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12 RIBOPRINTER Sistema de Identificación y Caracterización Rápida de Microorganismos en Alimentos Oxoid S.A. RiboPrinter es un sistema altamente tecnificado que tipifica molecularmente aislados bacterianos con rapidez, reproducibilidad y precisión, lo que permite determinar con certeza la fuente de contaminación o de infección. Dado que diferentes cepas de la misma especie pueden exhibir características bioquímicas muy similares, pero pueden presentar diferentes grados de virulencia, es con frecuencia necesario continuar con análisis más exhaustivos tales como las pruebas serológicas, para una caracterización mas discriminativa. Las pruebas adicionales necesarias, pueden enlentecer el proceso de investigación de varios días a varias semanas, periodos de tiempo inaceptables en los entornos industriales. A principios de los años 80 se desarrollaron una variedad de técnicas moleculares en los laboratorios de investigación y análisis de DNA y material genético. Y fue mediados los 80 cuando tales técnicas empezaron a aplicarse al análisis bacteriano. Una de esas técnicas, llamada ribotipaje, implicada en la caracterización de microorganismos por medio de los fragmentos de restricción de los ácidos nucleicos del genoma bacteriano y posterior hibridación con una sonda ribosomal, es el fundamento del sistema RiboPrinter Riboprinter combina varias etapas de procesamiento molecular en un solo paso. Trabajando a partir de una colonia bacteriana aislada, el sistema lleva a cabo todo el proceso requerido para identificar y caracterizar la bacteria al nivel de cepa automáticamente, desde la lisis celular hasta el análisis de imagen. Protocolo Cultivo La cepa bacteriana aislada se inocula en placas de agar (infusión de corazón-cerebro) durante horas. Se recoge una sola colonia y se resuspende en un tubo de microcentrífuga que lleva buffer. De ahí se transfiere a un portamuestras especial. Tratamiento térmico y preparación del DNA La suspensión de células se calienta para reducir la viabilidad e inactivar las nucleasas. Una vez que la temperatura baja, el portamuestras se introduce en el instrumento con los reactivos requeridos. El proceso automático comienza y las bacterias serán lisadas con una serie de enzimas líticas y el DNA liberado se corta o digiere con endonucleasas de restricción como la EcoR1. Separación y transferencia Los fragmentos de restricción del DNA se separan en virtud de su tamaño por electroforesis en gel de agarosa. Cada cassette de gel contiene 13 pocillos. Las muestras de DNA sujetas a investigación se disponen en 8 de los pocillos; DNA de referencia de peso molecular conocido, ocupa los restantes 5 pocillos. Una membrana de nylon que se mueve verticalmente contra el gel captura e inmoviliza sobre sí los fragmentos de DNA separados electroforéticamente (proceso automático de Southern blot). Procesamiento de la membrana Después de la desnaturalización del DNA sobre la membrana, se hibrida con una sonda de operón rrna marcada. Se lava la membrana, se trata con buffer de bloqueo y con el conjugado anticuerpo DNA/fosfatasa alcalina. El conjugado que no se ha unido se retira mediante una serie de lavados y se añade un sustrato quimioluminiscente. 1

13 Detección y análisis de imagen La membrana se calienta y se posiciona frente a una cámara CCD que detecta la intensidad de luz de los fragmentos del DNA diana. La cámara convierte los patrones luminiscentes de los fragmentos de DNA en información digital. Estos datos de la imagen se almacenan en el disco duro del ordenador. El "software" extracta información de la imagen, reconoce las líneas o calles y es capaz de distinguir entre los marcadores de referencia y las muestras. Después de haber procesado automáticamente un lote de muestras, se genera un patrón para cada calle de muestras y para los marcadores por medio de algorítmos apropiados. El patrón de cada muestra consiste en una serie de bandas de luz y oscuridad que pueden representarse en forma gráfica. El sistema compara estadísticamente el patrón con los obtenidos previamente. Esta es una operación en dos partes. Para la identificación, el análisis estadístico permite llegar a la conclusión de que una muestra desconocida puede o no ser comparada con los estándares conocidos y almacenados en la base de datos de identificación y con nombre clásico taxonómico aplicado. Aquellas muestras que coinciden en un umbral de similitud fijado de antemano se identifican; aquellas que quedan por debajo del umbral, no. Para la clasificación, los patrones de la muestra se agrupan con todos los tipos de patrones existentes y que han sido 2

14 analizados por el sistema para formar los RiboGrupos. Se utiliza un umbral de similitud separado para cada grupo. Si una muestra no puede ser adjudicada a un RiboGrupo por quedar fuera del umbral, el sistema crea un nuevo RiboGrupo para ella. Identificación y Caracterización El "software" del sistema contiene, por ejemplo, una base de datos de mas de 500 cepas/tipos de patrones de cuatro géneros muy importantes en la industria alimentaria: Listeria, Escherichia, Staphylococcus y Salmonella. RiboPrinter enfrenta las muestras contra la base de datos para asignar una identificación a nivel de género, especie y cepa o raza. Para propósitos de caracterización, el sistema compara automáticamente la muestra en curso con cada una de las muestras que han sido cargadas en el instrumento durante toda su vida. La caracterización es independiente de la identificación. Todas las muestras que son analizadas por el sistema son caracterizadas automáticamente. Los resultados de la comparación estadística muestran inmediatamente al usuario si un microorganismo desconocido ha sido procesado previamente por el sistema. Esta información puede sugerir una ruta de contaminación o suministrar información útil sobre un proceso de higienización de una planta, etc. Además, el investigador puede crear una base de datos individual de los microorganismos de su propio interés. Esto permite la comparación de bacterias de diferentes fuentes y la asociación de los patrones con una identificación taxonómica definida por el usuario. A esta base de datos se la conoce como "Custom Identification Data Base". Aplicaciones RiboPrinter tiene aplicaciones muy útiles y que incluyen su uso en estudios epidemiológicos así como en las operaciones de procesamiento de alimentos e industria farmaceútica. Puede ser aplicado virtualmente a todas las bacterias (hay a disposición una amplia bibliografía) y procesa cada lote de 8 aislados en un máximo de 8 horas. Dado que cada dos horas se puede introducir un nuevo lote de 8 muestras el sistema permite analizar hasta 32 aislados en una sola jornada de trabajo. Como sistema de tipaje molecular Riboprinter cumple con todos los criterios principales de tipabilidad, reproducibilidad y sensibilidad o poder de discriminación y los secundarios de facilidad de interpretación, técnicamente simple y rápido. 3