minterleukin-6 ELISA

Transcripción

1 Instrucciones de Uso minterleukin-6 ELISA Inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa de Interleucina-6 (IL-6) en suero y plasma ratón sobrenadantes de cultivo celular. BE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, GermanyFax: +49 (0)

2 INFORMACIÓN Y MANUAL DEL PRODUCTO 1. USO PROPUESTO 2 2. RESUMEN 2 3. PRINCIPIO DEL ENSAYO 2 4. REACTIVOS SUMINISTRADOS 4 5. INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO 4 6. TOMA DE LAS MUESTRAS Y INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO 4 7. MATERIAL REQUIRIDO PERO NO SUMINISTRADO 4 8. PRECAUCIONES DE USO 5 9. PREPARACIÓN DE REACTIVOS PROTOCOLO DE ENSAYO CALCULO DE RESULTADOS LÍMITES PRUEBAS FUNCIONALES INFORMACIÓN DE PEDIDOS RESUMEN PREPARACIÓN DE REACTIVOS RESUMEN DEL PROTOCOLO (24) 1/14

3 1. USO PROPUESTO El minterleukin-6 (IL-6) ELISA es un inmunoensayo enzimático para la detección cuantitativa de la IL-6 ratón. El minterleukin-6 (IL-6) ELISA es para uso exclusivo en investigación. No debe utilizarse en los procedimientos diagnóstico. 2. RESUMEN La interleucina 6 (IL-6) es una citocina multifuncional que regula las respuestas inmunitarias, las reacciones de fase aguda y la hematopoyesis, y puede cumplir una función central en los mecanismos de defensa anfitriones. Por lo general, las células normales no producen constitutivamente la IL-6, pero su expresión se induce fácilmente por una variedad de citocinas, infecciones virales o por lipopolisacáridos. La IL-6 es una citocina pleiotrópica producida por distintas células. Actúa en una amplia gama de tejidos, provocando la inducción del crecimiento, la inhibición del crecimiento y la diferenciación, respectivamente, según la naturaleza de los dianocitos. IL-6 participa en - la inducción de la diferenciación de células B, - la inducción de proteínas de fase aguda en células del hígado, - promoción de crecimiento de células de mieloma/plasmacitoma/hibridoma, - inducción de la expresión del receptor de IL-2 e IL-2, - proliferación y diferenciación de células T, - inhibición del crecimiento de células de ciertos líneas célulares de leucemia mioloide y inducción a su diferenciación a macrófagos, - aumento de la formación de colonias celulares multipotenciales inducidas por la IL-3 en hemocitoblastos e inducción de la maduración de megacariocitos como un factor trombocitopoyético, - inducción de crecimiento mesangial, - inducción de diferenciación neural de las células PC 12 e - inducción de crecimiento de los queratinócitos. Primero se indicó que la producción anormal de la IL-6 estaba relacionada con la activación de linfocitos B policlonales con producción de autoanticuerpos en pacientes con mixoma cardíaco. Desde entonces, se ha indicado que la IL-6 participa en la patogenia de distintas enfermedades. Así, la medición de los niveles de la IL-6 en el suero y otros líquidos corporales proporciona información más detallada sobre distintas situaciones patológicas. 3. PRINCIPIO DE ENSAYO Los pocillos de la microplaca están recubiertos con anticuerpos anti-il-6 ratón. Figura 1 Micropocillos Recubiertos Anticuerpo para el Recubrimiento (24) 2/14

4 Figura 2 La IL-6 ratón presente en la muestra o el estándar se une a los anticuerpos adsorbidos en los micropocillos. Se agrega un anticuerpo anti-il-6 humano conjugado a biotina que se une a la IL-6 ratón capturada por los primeros anticuerpos. Primera Incubación Estándar o Muestra Conjugado Biotina Figura 3 Después de la incubación se elimina el conjugado no unido mediante una etapa de lavado. Se agrega una solución de estreptavidina-peroxidasa de rábano qui se une al conjugado de biotina anti-il-6. Segunda Incubación Estreptavidina-HRP - Figura 4 Después de la incubación se elimina la estreptavidina-hrp no unida mediante una etapa de lavado y se agrega una solución de Substrato reactiva a Enzima Peroxidasa a los pocillos. Tercera Incubación Substrato Se forma un producto de color proporcional a la cantidad de la IL-6 presente en la muestra o el estándar. La reacción es terminada por la adición de ácido y la absorbancia se mide a 450 nm. Se prepara una curva estándar a partir de 7 diluciones estándar de IL-6 y se determina la concentración de IL-6 ratón en la muestra. Figura 5 Substrato Reaccionado (24) 3/14

5 4. REACTIVOS SUMINISTRADOS 1 bolsa de aluminio con una Placa de Micropocillos recubiertos con anticuerpos monoclonales anti-il-6 ratón. 1 vial (60 μl) de Conjuguado de Biotina (anticuerpos monoclonales anti-il-6 ratón) 1 vial (150 µl) con Estreptavidina-HRP 2 viales de Estándar IL-6 humano liofilizado, 4 ng/ml después de la reconstitución 1 vial (12 ml) de Diluyente de Muestras 1 vial (18 ml) de Solución Buffer de Ensayo 1 frasco (50 ml) de Solución Buffer de Lavado Concentrado 20x (PBS con 1 % de Tween 20) 1 vial (15 ml) de Solución de Substrato (tetrametil-benzidina) 1 vial (15 ml) de Solución de Parada (1M Acido Fosfórico) 4 Tapas para placas, Adhesivas 5. INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Conserve los reactivos del juego de reactivos a una temperatura comprendida entre 2 C y 8 C. Inmediatamente después de utilizarlos deberá volver a conservar los reactivos a dicha temperatura fría (2-8 C). En las etiquetas figuran las fechas de caducidad del juego de reactivos y de los reactivos. Sólo se podrá garantizar la fecha de caducidad de los componentes del juego de reactivos si se le conservan adecuadamente y si, en caso de uso reiterado de un mismo componente, el reactivo no queda contaminado en la primera manipulación. 6. TOMA DE LAS MUESTRAS Y INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO Sobrenadantes de cultivos celulares, suero y plasma (EDTA, citrato) fueron probados con este ensayo. Otras muestras biológicas pueden ser adecuadas para su uso en el ensayo. Separar el suero o plasma del coágulo o de las células lo antes posible después de la coagulación y separación. Las muestras que contienen un precipitado visible deben ser aclararadas antes de su uso en el ensayo. No utilice muestras altamente hemolizadas o lipémicas. Las muestras deben ser alícuotadas y se debe congeladar a -20 C para evitar la pérdida de IL-6 ratón bioactiva. Si se van a usar las muestras dentro de las 24 horas, se pueden almacenar ente 2 C y 8 C (para la estabilidad de la muestra consulte el cápitulo 13.5). Evite ciclos repetidos de congelación-descongelación. Antes del ensayo, la muestra congelada debe alcanzar lentamente la temperatura ambiente y ser mezclada suavemente. 7. MATERIAL REQUIRIDO PERO NO SUMINISTRADO - Pipetas graduadas de 5 ml y 10 ml - Micropipetas monocanales de 5 μl a 1000 μl con puntas desechables - Micropipetas multicanales de 50 μl a 300 μl con puntas desechables - Depósito para micropipetas multicanales - Vasos de precipitados, matraz, probeta, necesarios para la preparación de reactivos - Frasco lavador, sistema automatizado o semi-automatizado de lavado de placas de microtitulación - Fotómetro para placas de microtitulación capaz de leer absorbancias a 450 nm (opcional: 620 nm longitud de onda de referencia) - Agua bidestilada o deionizada en un recipiente de vidrio - Programa estadístico informático para llevar a cabo un análisis de regresión (24) 4/14

6 8. PRECAUCIONES DE USO - Todos los productos químicos deben considerarse potencialmente peligrosos. Por lo tanto, recomendamos que este producto sea manipulado únicamente por aquellas personas que hayan sido entrenadas en técnicas de laboratorio y que sea usado de acuerdo con los principios de buenas prácticas de laboratorio. Se debe llevar ropa de protección apropiada como puedan ser las batas de laboratorio, gafas de seguridad y guantes. Se debe trabajar con cuidado para evitar cualquier contacto con piel y ojos. En el caso de que tenga lugar un contacto con piel u ojos, proceder de forma inmediata a lavar la parte afectada con abundante agua. Véase la(s) hoja(s) de seguridad y/o declaraciones de seguridad para recomendaciones específicas. - Los reactivos están destinados para un uso en diagnóstico in vitro y no se deben usar en procedimientos terapéuticos. - No mezcle o sustituya los reactivos por los equivalentes de otros lotes u otras fuentes. - No use reactivos caducados - No exponga los reactivos del kit a una luz intensa durante su almacenamiento o incubación. - No pipetee con la boca - No se recomienda comer o fumar en las zonas donde se manipulen muestras o reactivos - Evite el contacto de los reactivos del kit o de las muestras con piel o mucosas. - Se recomienda el uso de guantes desechables de goma o látex durante la manipulación de las muestras y reactivos. - Evite el contacto de la solución de substrato con agentes oxidantes y metales. - Evite salpicaduras y la generación de aerosoles. - Con el propósito de evitar una contaminación microbiológica o contaminaciones cruzadas de reactivos y muestras que puedan invalidar el test se recomienda el uso de pipetas y/o puntas de pipetas de un solo uso. - Use recipientes limpios y específicos de reactivos para la dispensación de reactivos de sustrato. - La exposición a los ácidos inactiva el conjugado. - Se debe usar agua destilada o desionizada en la preparación de los reactivos. - La solución de substrato debe de estar a temperatura ambiente antes de su uso. - Descontamine y disponga las muestras y todos los materiales potencialmente contaminados como si pudieran contener agentes infecciosos. El método preferente de descontaminación es un autoclavado durante un mínimo de 1 hora a C. - Los residuos líquidos que no contengan ácido y los residuos neutralizados pueden ser mezclados con hipoclorito sódico en volúmenes tales que la mezcla final contenga 1.0 % de hipoclorito sódico. Dejar actuar durante 30 minutos para una efectiva descontaminación. Los residuos líquidos que contengan ácido deben ser neutralizados previamente a la adición de hipoclorito sódico. 9. PREPARACION DE LOS REACTIVOS Las Soluciónes de Buffer Concentradas deben de alcanzar la temperatura ambiente y ser diluídas antes de iniciar el procedimiento del ensayo. Si en las Soluciónes de Buffer Concentradas se han formado cristales, caliente suavemente hasta su completa disolución Solución Buffer de Lavado (1x) Vierta todo el contenido (50 ml) de la Solución Buffer de Lavado Concentrada (20x) en un matraz aforado de 1000 ml limpio. Enrase en matraz con agua destilada o desionizada. Mezcle suavemente para evitar la formación de espuma. Transfiera la solución a un frasco de lavado limpio y consérvela a una temperatura entre 2 C y 25 C. La Solución Buffer de Lavado (1x) permanece estable durante 30 días En función de la cantidad que vaya a necesitar, prepare la Solución Buffer de Lavado (1x) de acuerdo a la siguiente tabla: Número de Tiras Solución Buffer de Lavado Concentrada (20x) (ml) Agua Destilada (ml) (24) 5/14

7 9.2. Preparación de Conjugado de Biotina Utilice el Conjugado de Biotina antes de transcurridos 30 minutos desde su dilución. Justo antes de utilizar el Conjugado de Biotina, se debe diluirlo en una proporción de 1:100 con la Solución Buffer de Ensayo (1x) en un tubo de ensayo de plástico limpio. En función de la cantidad que vaya a necesitar, prepare el Conjugado de Biotina de acuerdo a la siguiente tabla: Número de Tiras Conjugado de Biotina (ml) Solución Buffer de Ensayo (1x) (ml) Estreptavidina-HRP Utilice la Estreptavidina-HRP antes de transcurridos 30 minutos desde su dilución. Justo antes de utilizar la solución concentrada de Estreptavidina-HRP, se debe diluirlo en una proporción de 1:100 con la Solución Buffer de Ensayo (1x) en un tubo de ensayo de plástico limpio. En función de la cantidad que vaya a necesitar, prepare la Estreptavidina-HRP de acuerdo a la siguiente tabla: Número de Tiras Estreptavidina-HRP (ml) Solución Buffer de Ensayo (1x) (ml) Estándar IL-6 Humano Reconstituya el Estándar IL-6 humano añadiendo agua destilada. El volumen de reconstitución está indicado en la etiqueta del vial del estándar. Gire o mezcle cuidadosamente para garantizar una solubilización completa y homogénea (concentración del estándar reconstituido = 4 ng/ml). Permita que el estándar reconstituido se asiente durante minutos. Mezcle bien previamente a realizar las diluciones. Tras su uso los restos del estándar no pueden ser almacenados y deben ser descartados. Las diluciones estándares pueden ser preparadas directamente en la placa multipocillo (véase 10.c) o alternativamente en tubos (véase 9.5.1) Dilución Estándar Externa Rotule 7 tubos, uno para cada curva estándar. S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7. Acto seguido, prepare diluciones seriadas 1:2 para la curva estándar como se indica a continuación: Pipetee 225 µl de Solución Buffer Ensayo (1x) a todos los tubos. Pipetee 225 µl de estándar reconstituido (concentración del estándar = 4 ng/ml) en el primer tubo, etiquetado como S1, y mezclar (concentración del estándar 1 = 2 ng/ml). Pipetee 225 µl de esta dilución en el segundo tubo, etiquetado como S2, y mezclar completamente antes de la siguiente transferencia. Repita la serie de diluciones 5 veces más de manera que se obtengan los diferentes puntos de la curva estándar (véase figura 6). La Solución Buffer de Ensayo (1x) sirve como blanco. Figura 6 Transferir 225 µl S1 S2 S3 S4 - S7 IL-6 Humano Estándar Reconstituido Solución Buffer de Ensayo (1x) 225 µl Descartar 225 µl (24) 6/14

8 10. PROTOCOLO DE ENSAYO a. Determine el número de tiras necesarias para analizar el número deseado de muestras y además añada las tiras para blancos y estándares (de color). Cada muestra, estándar, blanco y la muestra de control opcional deben ser analizadas por duplicado. Retire del soporte las tiras sobrantes y consérvelas, junto con el desecante suministrado en una bolsa metalizada y cerrada herméticamente, a una temperatura de 2-8 C. b. Lave las tiras 2 veces con aproximadamente 400 µl de Solución Buffer de Lavado por cada pocillo, aspirando completamente el contenido de los pocillos entre cada lavado. Permitir que la Solución Buffer de Lavado permanezca en los pocillos durante segundos antes de su aspiración. Evite rayar la superficie de los pocillos. Tras el último lavado, golpee suavemente las tiras contra un papel absorbente o una toallita de papel para eliminar el exceso de tampón de lavado. Utilice las tiras inmediatamente después de lavadas o bien colóquelas boca abajo sobre un papel absorbente húmedo durante como máximo 15 minutos. No deje secar los pocillos. c. Dilución Estándar en la placa de microtitración (Alternativamente, la dilución estándar puede ser preparada en tubos véase 9.4.1) Añada 100 µl de Solucón Buffer de Ensayo (1x) en duplicado a todos los pocillos estándar. Pipetee 100 µl de estándar preparado (véase Preparación del Estándar 9.4, concentración = 4000 pg/ml) por duplicado en los pocillos A1 y A2 (véase Tabla 1). Mezcle el contenido de los pocillos A1 y A2 por repetidas aspiraciones y expulsiones del contenido con la pipeta (concentración del estándar 1, S1 = 2000 pg/ml), y transfiera 100 µl a los pocillos B1 y B2, respectivamente. (véase Figura 7). Cuide de no rascar la superficie interior de los micropocillos con la punta de la pipeta. Continue este procedimiento 5 veces, formando dos filas de diluciones estándar del human IL-6 ordenadas desde 2000 a 31.3pg/mL. Descarte 100 µl de los contenidos de los últimos micropocillos (G1, G2) usados. Figura 7 Transferir 100 µl S1 S2 S3 S4 - S7 IL-6 Humana Estándar Reconstituido Solución Buffer de Ensayo (1x) 100 µl Descartar 100 µl En caso de una dilución estándar externa (véase 9.4.1), pipetee 100 µl de estas diluciones estándares (S1-S7) en los pocillos estándares correspondientes de acuerdo con la Tabla (24) 7/14

9 Tabla 1 Tabla describiendo un ejemplo de la disposición de los blancos, estándares y muestras en las tiras de los micropocillos A Estándar 1 ( pg/ml) Estándar 1 ( pg/ml) Muestra 1 Muestra 1 B Estándar 2 ( pg/ml) Estándar 2 ( pg/ml) Muestra 2 Muestra 2 C Estándar 3 (500.0 pg/ml) Estándar 3 (500.0 pg/ml) Muestra 3 Muestra 3 D Estándar 4 (250.0 pg/ml) Estándar 4 (250.0 pg/ml) Muestra 4 Muestra 4 E Estándar 5 (125.0 pg/ml) Estándar 5 (125.0 pg/ml) Muestra 5 Muestra 5 F Estándar 6 (62.5 pg/ml) Estándar 6 (62.5 pg/ml) Muestra 6 Muestra 6 G Estándar 7 (31.3 pg/ml) Estándar 7 (31.3 pg/ml) Muestra 7 Muestra 7 H Blanco Blanco Muestra 8 Muestra 8 d. Añada 100 µl de Diluyente de Muestras (1x) en duplicado a los pocillos del blanco. e. Añada 50 µl de cada Diluyente de Muestras (1x) a los pocillos con la muestra. f. Añada 50 µl de cada muestra en duplicado a los pocillos designados. g. Prepare el Conjugado de Biotina (véase la preparación del Conjugado de Biotina 9.3) h. Añada 50 µl el Conjugado de Biotina a todos los pocillos. i. Cubra la placa con una tapa e incúbela a temperatura ambiente (18-25 C) durante 2 horas en un agitador mecánico a 400 rpm, si es posible. Agitar la placa es absolutamente necesario para obtener resultados corectos. j. Prepare Estreptavidina-HRP (véase la preparación de estreptavidina-hrp 9.4). k. Retire la tapa y vacíe los pocillos. Lavar los micropocillos de las tiras 5 veces de acuerdo al punto b del protocolo del test. Proseguir inmediatamente después al próximo paso. l. Añada 100 µl Estreptavidina-HRP a todos los pocillos. m. Cubra la placa con una tapa e incúbela a temperatura ambiente (18-25 C) durante 1 hora en un agitador mecánico a 400 rpm, si es posible. Agitar la placa es absolutamente necesario para obtener resultados corectos. n. Retire la tapa y vacíe los pocillos. Lavar los micropocillos de las tiras 5 veces de acuerdo al punto b del protocolo del test. Proseguir inmediatamente después al próximo paso. o. Pipetee 100 μl de Solución de Substrato TMB y viértalos en todos los pocillos, incluidos los del blanco. p. Incube las tiras de microtitración a temperatura ambiente (18-25 C) durante aproximadamente 10 minutos. Evite la exposición directa a la luz intensa (24) 8/14

10 Deben monitorizarse los valores DO de la placa para detener la reacción del substrato (véase el siguiente punto de este protocolo) antes de que deje de ser posible registrar correctamente los pocillos positivos. La determinación del tiempo adecuado para el desarrollo del color, debe realizarse de forma individual para cada ensayo. Se recomienda añadir la solución de parada cuando el estándar más alto presente un color azul oscuro. Alternativamente el desarrollo de color puede ser monitorizado con un lector de placas de ELISA a 620 nm. La reacción del substrato debería ser parada cuando el Estándar 1 alcance una DO entre 0.9 y q. Detenga la reacción enzimática pipeteando rápidamente 100 µl de la Solución de Parada en cada pocillo, incluidos los del blanco. Es importante dispensar la Solución de Parada de forma rápida y uniforme en todos los pocillos para inactivar totalmente la enzima. Los resultados deben leerse inmediatamente después de añadir la solución de parada o, como máximo, en el plazo de 1 hora si las tiras se conservan a una temperatura entre 2-8 C en un lugar oscuro. r. Lea la absorbancia de cada pocillo en un espectrofotómetro utilizando 450 nm como longitud de onda principal (opcionalmente 620 nm como longitud de onda de referencia; los valores comprendidos entre 610 nm y 650 nm son aceptables). Utilizar los pocillos de blanco para medir el blanco del lector de placas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Determine la absorbancia de las muestras y de los IL-6 ratón. 11. CALCULO DE RESULTADOS - Calcule los valores de absorbancia media para cada conjunto de duplicados de los estándares y muestras. Los duplicados deben estar dentro del 20 por ciento del valor medio - Construya una curva estándar mediante la representación de la absorbancia media obtenido para cada estándar frente a la concentración de IL-6 ratón con el valor de absorbancia en el eje-y y la concentración en el eje-x. Se logra un buen ajuste con 5 Parameter Logistics. - Para determinar la concentración de la IL-6 ratón circulante para cada muestra, primero encontrar el valor de absorbancia media en la ordenada y extender una línea horizontal a la curva estándar. En el punto de intersección, extender una línea vertical al eje de abscisas y leer la concentración la IL-6 ratón. - Si se han seguido las instrucciones de este protocolo, se han diluido 1:2 las muestras (50 µl de muestra + 50 µl de Solución Buffer de Ensayo (1x)), la concentración leída a partir de la curva estándar se debe multiplicar por el factor de dilución (2x). - Cálculo de las muestras con una concentración superior al estándar 1, puede dar lugar a concentraciones incorrectas, bajas en IL-6 ratón. Estas muestras requieren más predilución externa según los valores esperados de IL-6 ratón con la Solución Buffer de Ensayo (1x) para cuantificar con precisión la concentración real de IL-6 ratón. - Se recomienda que cada centro de pruebas establece una muestra de control con concentraciones conocidas de IL-6 ratón y se ejecuta este control adicional con cada ensayo. Si los valores obtenidos no están dentro del intervalo esperado del control, los resultados del análisis pueden ser no válidos. - En la figura 8 se muestra una representativa curva estándar. Esta curva no se puede utilizar para obtener resultados de las pruebas. Cada laboratorio debe preparar una curva estándar por cada grupo de tiras ensayadas (24) 9/14

11 Figura 8 Representativa curva estándar para el minterleukin-6 (IL-6) ELISA. Se diluyó la IL-6 ratón en serie de 2 etapas en la Solución Buffer de Ensayo (1x). No use esta curva estándar para obtener resultados de las pruebas. Se debe ejecutar una curva estándar para cada grupo de tiras ensayadas. Tabla 2 Datos típicos del minterleukin-6 (IL-6) ELISA Longitud de onda: 450 nm Longitud de onda de referencia: 620 nm Estándar Concentración IL-6 ratón D.O. (pg/ml) (450 nm) Blanco D.O. Media C.V. (%) Los valores de DO de la curva estándar pueden variar según las condiciones de la realización del ensayo (por ejemplo empleados del laboratorio, técnica de pipeteo, técnica de lavado o efectos de la temperatura). Por otra parte el almacenamiento del equipo puede afectar la actividad enzimática y por tanto la intensidad de color. Los valores medidos siguen siendo válidas (24) 10/14

12 12. LÍMITES - Dado que las condiciones exactas pueden variar de un ensayo a otro ensayo, se debe crear una curva estándar para cada prueba. - La contaminación de las muestras o los reactivos por bacterias o hongos, o una contaminación cruzada entre los reactivos puede dar resultados erróneos. - Se debe utilizar preferiblemente puntas de pipeta desechables, matraz de vidrio o frascos de vidrio. Los frascos de vidrio reutilizables deben ser lavados antes de su uso y todos los productos de limpieza ser eliminados por un enjuague minucioso. - Un lavado incorrecto o inadecuado durante cada paso del procedimiento de ensayo puede conducir a resultados erróneos ya sea falsos positivos o falsos negativos. Vaciar los pocillos completamente antes de pipetear la Solución de Lavado fresca. Pipetear la Solución Buffer de Lavado en los pocillos como se especifica para cada ciclo de lavado y no deje que los pocillos estén no cubiertos durante mucho tiempo o que se secan. 13. PRUEBAS FUNCIONALES Sensibilidad El límite de detección de IL-6 ratón definido como la concentración del analito resultando en una absorción significativamente más alta que la del medio de dilución (media más dos desviaciones estándar), se determinó de ser 6.5 pg/ml (media de 6 ensayos independientes) Recuperación Intra-ensayo La recuperación del intra-ensayo se evaluó en tres experimentos independientes. Cada ensayo se llevó a cabo con 6 repeticiones de 8 muestras de suero que contienen diferentes concentraciones de IL-6 ratón. Se llevaron a cabo dos curvas de estándar en cada placa. Los datos a continuación muestran la concentración media de IL-6 ratón y el coeficiente de variación para cada muestra (ver Tabla 3). El calculado coeficiente de variación intra-ensayo total fue del 5.0 %. Tabla 3 La concentración media de IL-6 ratón y el coeficiente de variación para cada muestra Concentración Media Coefficiente de Variación Muestra Experimento IL-6 ratón (ng/ml) (24) 11/ (%)

13 Inter-ensayo La recuperación inter-ensayo dentro de un laboratorio se evaluó en dos experimentos independientes. Cada ensayo se llevó a cabo con 6 repeticiones de 8 muestras de suero que contienen diferentes concentraciones de IL-6 ratón. Dos curvas de calibración se realizaron en cada placa. Los datos a continuación muestran la concentración media de IL-6 ratón y el coeficiente de variación calculado en 18 determinaciones de cada muestra (ver Tabla 4). El coeficiente de variación total calculado de inter-ensayo fue del 5.2 % Tabla 4 La concentración media de IL-6 ratón y el coeficiente de variación para cada muestra Muestra Concentración Media de IL-6 Ratón (ng/ml) Coefficiente de Variación (%) Recuperación después del Enriquecimiento La recuperación del enriquecimiento fue evaluada enriqueciendo 3 niveles de IL-6 ratón en muestras combinadas de suero normal. Las recuperaciones se determinaron con 4 repeticiones cada uno. El suero no enriquecido sirvó como blanco en estos experimentos. Ver Tabla 5 por los datos. Tabla 5 Matriz de Muestra Suero Plasma (EDTA) Plasma (Citrato) sobrenadantes de cultivo celular Enriquecimento alto % 89% (87-91) 85% (71-100) 63% (62-65) 93% (81-105) Enriquecimento medio % 74% (72-76) 91% (88-97) 60% (59-61) 111% ( ) Enriquecimento bajo % 96% (79-112) 123% ( ) 101% (99-102) 103% (96-110) (24) 12/14

14 13.4. Dilución en Paralelo Se analizaron muestras de suero y plasma (EDTA, Citrato) con diferentes concentraciones de IL-6 ratón mediante 2 diluciones en serie con 4 repeticiones cada uno. Ver Tabla 6 por los datos. Tabla 6 Matriz de Muestra Recuperación de Concentración Expectada Media (%) Rango (%) Suero 100% Plasma (EDTA) 106% Plasma (Citrato) 135% sobrenadantes de cultivo celular 95% Estabilidad de Muestras Estabilidad Congelación - Descongelación Alícuotas de las muestras de suero (enriquecidas o no enriquecidas) fueron almacenadas a -20 C y posteriormente descongeladas hasta 5 veces, y se determinó las concentraciones del IL-6 ratón. No hubo pérdidas significativas de la inmunoreactividad de IL-6 ratón por la congelación y descongelación Estabilidad de Almacenamiento Alícuotas de las muestras de suero (enriquecidas o no enriquecidas) fueron almacenadas a -20 C, 2-8 C, temperatura ambiente (TA) y a 37 C, y la concentración de IL-6 ratón fue determinada después de las 24 horas. No se detectó una pérdida significativa de la inmunoreactividad del Il-6 ratón durante el almacenamiento en condiciones descritos anteriormente. No se detectó una pérdida significativa de la inmunoreactividad de la IL-6 ratón durante el almacenamiento a -20 C, 2-8 C y TA. Se detectó una pérdida significativa de la inmunoreactividad de IL-6 ratón durante el almacenamiento a 37 C después de 24 h Especificidad La interferencia de factores circulantes del sistema inmune fue evaluada por enriquecer estas proteínas a concentraciones fisiológicamente relevantes en un suero positivo de IL-6 ratón. No se detectaron interferencias, específicamente no con ratón IL-17, IL-2, IFN-γ, TFN-α, IL-5, IL-1α, GM-CSF, IL-4, IL Calibración El inmunoensayo es calibrado con recombinante IL-6 ratón altamente purificada, que ha sido evaluado según el estándar de referencia internacional NIBSC 89/548 y se ha demostrado que son equivalentes. NIBSC 93/730 se cuantifica en unidades internacionales (UI) de una IU que corresponde a 10 pg de la IL-6 ratón. 14. INFORMACIÓN DE PEDIDOS Para los pedidos póngase en contacto con: Para preguntas técnicas comuníquese con: Véase la última página. IBL@IBL-International.com (24) 13/14

15 15. RESUMEN: PREPARACION DE REACTIVOS Solución Buffer de Lavado (1x) Añada 50 ml de la Solución Buffer de Lavado Concentrado (20x) a 950 ml de agua destilada. Número de Tiras Solución Buffer de Lavado Concentrada (ml) Agua Destilada (ml) Conjugado de Biotina Haga una dilución 1:100 del Conjugado de Biotina en la Solución Buffer de Ensayo (1x): Número de Tiras Conjugado de Biotina (ml) Solución Buffer de Ensayo (1x) (ml) Estreptavidina-HRP Haga una dilución 1:100 del Estreptavidina-HRP en la Solución Buffer de Ensayo (1x): Número de Tiras Conjugado de Biotina (ml) Solución Buffer de Ensayo (1x) (ml) Estándar IL-6 Ratón Reconstituya el estándar liofilizado IL-6 ratón con agua destilada. (El volumen de reconstitución se indica en la etiqueta del frasco estándar.) 16. RESUMEN DE PROTOCOLO DE ENSAYO 1. Determine el número requirido de tiras de la placa de microtitulación. 2. Lave las tiras de la placa de microtitulación dos veces con Solución Buffer de Lavado. 3. Dilución estándar en la placa de microtitración: Añada 100 µl de Diluyente de Muestras, por duplicado, a todos los pocillos estándar. Pipetee 100 µl de estándar preparado en los primeros pocillos y cree diluciones estándar mediante la transferencia de 100 µl de pocillo a pocillo. Deseche 100 µl de los últimos pocillos. Alternativamente dilución estándar externa en tubos (ver 9.4.1): Pipetee 100 µl de estas diluciones estándares en las tiras de los micropocillos. 4. Añada100 μl de Diluyente de Muestras, por duplicado, a los pocillos blancos. 5. Añada 50 μl de Diluyente de Muestras a los pocillos de muestra. 6. Añada 50 μl de muestras por duplicado a los pocillos respectivos. 7. Prepare el Conjugado de Biotina. 8. Añada 50 μl de Conjugado de Biotina a todos los pocillos. 9. Cubra las tiras e incubar 2 horas a temperatura ambiente (18-25 C) / 400 rpm. Agitación es absolutamente necesario para obtener resultados corectos. 10. Prepare Estreptavidina-HRP. 11. Vacíe y lave los pocillos 5 veces con Solución Buffer de Lavado. 12. Añada 100 µl de la Solución de Substrato TMB a todos los pocillos. 13. Cubra las tiras e incubar 1 hora a temperatura ambiente (18-25 C) / 400 rpm. Agitación es absolutamente necesario para obtener resultados corectos. 14. Vacíe y lave los pocillos 5 veces con Solución Buffer de Lavado. 15. Añada 100 μl de Solución Substrato TMB a todos los pocillos. 16. Incube las tiras para approximadamente 30 minutos a temperatura ambiante (18-25 C). 17. Añada 100 μl de Solución de Parada a todos los pocillos. 18. Ajuste el fotómetro y medir la absorbancia a 450 nm. Nota: Si han seguido las instrucciones en este protocolo las muestras han sido diluidas 1:2 (50 μl de muestra, 50 μl de Solución Buffer de Ensayo (1x)), la concentración leída de la curva estándar debe ser multiplicada por el factor de dilución (x 2) (24) 14/14

16 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθμός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. COMPLAINTS: Complaints may be submitted initially written or vocal. Subsequently they need to be filed including the test performance and results in writing in case of analytical reasons. WARRANTY: The product is warranted to be free from material defects within the specific shelf life and to comply with product specifications delivered with the product. The product must be used according to the Intended use, all instructions given in the instructions for use and within the product specific shelf life. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. LIMITATION OF LIABILITY: IN ALL CIRCUMSTANCES THE EXTENT OF MANUFACTURER S LIABILITY IS LIMITED TO THE PURCHASE PRICE OF THE KIT(S) IN QUESTION. IN NO EVENT SHALL MANUFACTURER BE LIABLE FOR ANY INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL DAMAGES, INCLUDING DAMAGES FOR LOST PROFITS, LOST SALES, INJURY TO PERSON OR PROPERTY OR ANY OTHER INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL LOSS. IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Symbols Version 4.5 /