Lipoprotein (a) ELISA
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- Silvia Cortés Soler
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1 Instrucciones de Uso Lipoprotein (a) ELISA Inmunensayo enzimático para la determinación cuantitativa de Lipoproteína a [Lp(a)] en suero humano, citrato y plasma EDTA. RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)
2 1. USO PROPUESTO Inmunensayo enzimático para la determinación cuantitativa de Lipoproteína a [Lp(a)] en suero humano, citrato y plasma EDTA. 2. IMPLICACIONES CLÍNICAS La Lipoproteína(a) [Lp(a)] es un factor de riesgo genéticamente determinado e independiente para la ateroesclerosis. Poco se conoce sobre la función fisiológica y el metabolismo de Lp(a). La concentración en suero de esta lipoproteína puede variar entre 0 y 200 mg/dl. En concentraciones superiores a 30 mg/dl el riesgo para el desarrollo de ateroesclerosis aumenta significativamente, en especial cuando hay un aumento sincrónico del colesterol LDL. La estructura de Lp(a) deriva de la estructura de la partícula LDL. Lp(a) es una partícula de LDL que está unida a la apolipoproteína(a) altamente glicosilada [apo(a)] por medio de uno o varios enlaces disulfuro. Las homologías en las secuencias de apo(a) y plasminógeno indican una correlación entre los procesos trombóticos y ateroescleróticos. La composición de proteínas y lípidos de Lp(a) se caracteriza por una heterogoneidad interindividual e intraindividual. Hasta el momento, se han caracterizado más de 30 isoformas. Se desconoce si esta heterogeneidad influencia el riesgo relativo para el desarrollo de la ateroesclerosis. A diferencia de otras lipoproteínas, las concentraciones de Lp(a) no se pueden influenciar mediante cambios en la dieta. Los medicamentos que disminuyen el nivel de lípidos, que reducen la concentración de LDL, no tienen efecto en Lp(a). 3. PRINCIPIO DEL ENSAYO Lp(a) es un ELISA de captura de un paso. Los pocillos de las tiras reactivas ELISA están recubiertos con anticuerpos anti-apo(a) específicos, policlonales. En el primer paso de incubación, las muestras diluidas se incuban juntas con el conjugado (incubación de muestra). El conjugado consiste en un fragmento Fab antiapo(a) monovalente, sumado a peroxidasa (conjugado con anti-apo(a) peroxidasa). Durante el tiempo de incubación, las partículas Lp(a) están unidas a la fase sólida y son marcadas simultáneamente por el conjugado. Los componentes de suero no específicos y el conjugado no unido se eliminan mediante el lavado. En un segundo paso de incubación (reacción del sustrato), se produce la reacción enzimática. La peroxidasa es parte del conjugado y oxida la tetrametilbenzidina (TMB) del sustrato para transformarla en una sustancia azul. Para detener la reacción, se agrega ácido sulfúrico y el color cambia a amarillo. La intensidad del color es directamente proporcional a la concentración de Lp(a) en la muestra. La densidad óptica se mide a una longitud de onda de 450 nm mediante un lector ELISA. La concentración de Lp(a) en la muestra se determina cuantitativamente a partir de la curva de referencia, que se realiza al mismo tiempo. 4. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES 1. Sólo para uso en diagnóstico in-vitro. Sólo para uso profesional. 2. Antes de comenzar el ensayo lea las instrucciones completa y cuidadosamente. Use la versión válida del prospecto que se ofrece con el juego de reactivos. Asegúrese de entenderlo todo. 3. En caso de daño severo del estuche del juego de reactivos, contacte por favor a IBL o a su suministrador en forma escrita antes de transcurrida una semana de la recepción. No utilice los componentes dañados en los ensayos pero guárdelos en forma segura para la reclamación. 4. Tome en cuenta el número de lote y la fecha de caducidad. No mezcle reactivos de diferentes lotes. No use reactivos vencidos. 5. Cumpla con las buenas prácticas de laboratorio y las pautas de seguridad. Use bata de laboratorio, guantes de látex desechables y gafas de protección cuando sea necesario. 6. Los reactivos de este juego que contienen materiales peligrosos pueden causar irritación ocular y cutánea. Vea MATERIAL SUMINISTRADO y las etiquetas para los detalles. Las Hojas de Datos de Seguridad de los materiales para este producto están disponibles en la página de internet de IBL o mediante solicitud directa a IBL. 7. Los reactivos químicos y los reactivos preparados o usados deben ser tratados como desechos peligrosos de acuerdo con las regulaciones nacionales sobre bioseguridad y pautas de seguridad. 8. El personal de limpieza debe ser capacitado por profesionales para el manejo de residuos peligrosos. 9. Evite el contacto con la Solución de Parada. Puede causar irritaciones y quemaduras en la piel. Version / 6
3 10. Todos los reactivos de este juego que contienen suero o plasma humano han sido ensayados y encontrados negativos para anti-hiv I/II, HBsAg and anti-hcv. Sin embargo, la presencia de estos u otros agentes infecciosos no puede ser excluída en forma absoluta, por lo que estos reactivos deben ser tratados como potencialmente biopeligrosos a los efectos de su manipulación y eliminación. 5. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD El juego de reactivos es enviado a temperatura ambiente y debe ser almacenado a 2-8 C. Manteniéndose alejado del calor o de la luz solar directa. El almacenamiento y estabilidad de muestras y reactivos preparados se detalla en los capítulos correspondientes. Una vez abierto el estuche, la placa de microtitración, el Substrato TMB y la Solución Buffer son estable hasta 6 meses en su envase roto, pero herméticamente sellado, si se almacena a 2-8 C. 6. TOMA Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS Suero, Plasma (EDTA, Citrato) Las muestras deben ser nuevas. A -20 C, pueden almacenarse durante varios meses. Las muestras no pueden congelarse o descongelarse varias veces. Se deben observar las precauciones usuales para la venipuntura. Es importante preservar la integridad química de la muestra de sangre desde el momento de su toma hasta el ensayo. No emplee muestras fuertemente hemolizadas, lipémicas o ictéricas. Las muestras que presenten turbidez deben centrifugarse antes de ensayar para eliminar cualquier material particulado. Tenga en cuenta lo siguiente: El aumento de la concentración de Ca 2+ y el congelamiento y descongelamiento en varias oportunidades puede tener como resultado una acumulación de partículas de LDL, lo que influiría en los valores de Lp(a). 7. MATERIALES SUMINISTRADOS Cantidad Símbolo Componente 1 x 12 x 8 MTP 1 x 1.3 ml ENZCONJ LYO 1 x 5 x 0.2 ml CAL 1-5 LYO 1 x 2 x 0.2 ml CONTROL LL LYO CONTROL HL LYO 2 x 100 ml CONC 2 x 15 ml TMB SUBS 1 x 15 ml TMB STOP 2 x FOIL Folio Adhesivo Placa de Microtitulación Listo para usar. Tiras separables. Recubierto con anticuerpo anti-apo (a) purificado por afinidad, específico, policlonal de oveja. Conjugado Enzimático liofilizado Coloreado en azul. Contenido: peroxidasa anti-apo(a), policlonales, específicos, monovalentes fragmentos Fab de oveja. CAL 1-5 liofilizado Contenido: Suero humano, estabilizadores, conservantes. Por concentraciones exactas vea las etiquetas o el certificado de Control de Calidad. Control LL+HL liofilizado Control Positivo Suero, LL, Low Level, HL, High Level. Contenido: Suero humano, estabilizadores, conservantes. Para conocer los rangos aceptables, vea las etiquetas de las ampollas o el certificado de CC. Solución buffer Concentrado (10x) Contenido: detergentes, estabilizadores, 0.01 % (w/v) Thimerosal, 0.4 M Tris/HCl; ph 8.4. Solución de Substrato TMB Listo para usar. Contenido: TMB (Tetramethylbenzidine). Solución de Parada TMB Listo para usar. Contenido: 0.5 M H 2SO MATERIALES REQUIRIDOS PERO NO SUMINISTRADOS 1. Micropipetas (Multipette Eppendorf o dispositivos similares, < 3 % CV). Volúmenes: 5, 50, 100, 200, 1000 µl 2. Vortex 3. Tubos para la dilución de muestras 4. Micropipeta multicanal de 8 canales con reservorio de reactivo 5. Frasco lavador, sistema automatizado o semi-automatizado de lavado de placas de microtitración Version / 6
4 6. Fotómetro para placas de microtitulación capaz de leer absorbancias a 450 nm (longitud de onda de referencia nm) 7. Agua bidestilada o desionizada 8. Toallas de papel, puntas para las micropipetas y cronómetro 9. INDICACIONES PARA EL PROCEDIMIENTO 1. Cualquier manipulación inadecuada de las muestras o modificación del procedimiento de ensayo puede alterar los resultados. Los volúmenes a pipetear, los tiempos de incubación, las temperaturas y etapas de pretratamientos tienen que ser efectuados estrictamente siguiendo las instrucciones. Use sólo pipetas u otros dispositivos calibrados. 2. Una vez comenzado el ensayo, se deben completar todas las etapas sin interrupción. Asegúrese de que los reactivos, materiales y dispositivos necesarios estén listos en el momento adecuado. Permita que todos los reactivos y muestras alcancen la temperatura ambiente (18-25 C) y agite suavemente por rotación cada vial de reactivo líquido o muestra antes del uso. Evite la formación de espuma. 3. Evite la contaminación de los reactivos, pipetas pocillos y/o tubos. Emplee una punta desechable nueva para cada reactivo, estándar o muestra. No intercambie las tapas. Tape siempre los viales que no estén en uso. No reutilice los pocillos, tubos o reactivos. 4. Se recomienda ensayar las muestras por duplicado para poder identificar errores potenciales de pipeteo. 5. Use un esquema de pipeteo apropiado según las dimensiones de la placa. 6. El tiempo de incubación afecta los resultados. Todos los pocillos deben ser manipulados en el mismo orden y secuencia de tiempo. Para el pipeteo de soluciones en los pocillos se recomienda una pipeta de 8 canales. 7. El lavado de la placa de microtitulación es un paso importante. Los pocillos insuficientemente lavados conllevan a resultados erróneos. Se recomienda emplear una pipeta multicanal o un sistema automático de lavado. No deje secar los pocillos entre incubaciones. Cuide de no dañar el recubrimiento de las placas durante el enjuague y/o la aspiración. Enjuague y agregue los reactivos cuidadosamente. Al enjuagar cerciórese que todos los pocillos estén completamente llenos con la Solución Buffer de Lavado y que no haya residuos en ellos. 8. La humedad afecta los pocillos y tubos recubiertos. No abra la bolsa hasta que alcance la temperatura ambiente. Los pocillos o tubos que no se empleen deben guardarse inmediatamente en la bolsa resellada con desecante. 10. INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO Preparación de componentes concentrados Diluya / disuelva Componente con Diluyente Relación Notas Almacenamiento Estabilidad 100 ml CONC 900 ml agua bidest. 1:10 Mezclar bien. 2-8 C 2 meses Preparación de componentes liofilizados Diluya / disuelva 1 frasco Componente con Diluyente Notas Almacenamiento Estabilidad CAL 1-5 Control LL Control HL 200 µl 1 frasco ENZCONJ 1.30 ml Dejar durante 15 minutos a temperatura ambiente (18-25 ºC) y mezclar 10 segundos en una mezcladora de muestras (evitar la generación de espuma). Después de la reconstitución, los calibradores y los sueros de control son claros o levemente turbios. 2-8 C 2 semanas -20 C 6 meses 2-8 C 1 semana -20 C 6 meses Version / 6
5 10.3. Dilución de Estándares, Controles y Muestras CAL 1-5 Control LL Control HL para ser diluído con Relación Notas generalmente 1:2001 p.e. 5 µl CAL + 10 ml p.e. 5 µl Control + 10 ml Suero, Plasma generalmente 1:2001 p.e. 5 µl + 10 ml ENZCONJ generalmente 1:11 p.e. 400 µl ENZCONJ + 4 ml Estabilidad: 60 min (18-25 C). 11. PROCEDIMIENTO DE ENSAYO 1. Agregar con una pipeta 100 μl de Solución de Conjugado en el interior de cada pocillo requerido y agregar adicionalmente con una pipeta 100 µl, calibradores diluidos, muestras o controles diluidos en el interior de los respectivos pocillos de la placa de microvaloración (los calibradores se deben colocar en las tiras 1 y 2). 2. Cubra la placa con un folio adhesivo. Incubar 120 min a TA (18-25 C). 3. Remueva el folio adhesivo. Descargue la solución de incubación. Lavar la placa 3 x con 250 µl de Solución Buffer diluida. Remueva el exceso de solución golpeando cuidadosamente la placa invertida sobre una toalla de papel. 4. Para la adición de la Solución de Substrato y de Paro utilice, de ser posible, una pipeta de 8 canales. La adición de sustrato y solución de paro debe llevarse a cabo en intervalos de tiempo iguales. 5. Agregar con una pipeta 200 μl de Solución de Substrato TMB en cada pocillo. 6. Incubar 30 min a TA (18-25 C). 7. Detenga la reacción del substrato añadiendo 50 μl de Solución de Paro TMB en cada pocillo. Mezcle brevemente el contenido agitando la placa. 8. Mida la densidad óptica con un fotómetro a 450 nm (Longitud de onda de referencia: nm) dentro de los 10 min de haber agregado la Solución de Paro. 12. CONTROL DE CALIDAD Los resultados son válidos solamente si el ensayo ha sido realizado de acuerdo a las intrucciones. Además el usuario debe atenerse a las Prácticas de Buen Laboratorio (GLP) u otras normas o leyes comparables. Para la determinación del diagnóstico, el usuario y/o el laboratorio deben de tener un sistema validado de acuerdo con las Buenas Prácticas de Laboratorio (GLP). Los valores de los controles del ensayo deben encontrarse dentro de los rangos de aceptación indicados en las etiquetas y el Certificado QC. Si este criterio no se cumple, el ensayo no es válido y debe repetirse. Cada laboratorio debe emplear muestras conocidas como controles adicionales. Se recomienda participar en los programas de aseguramiento de la calidad adecuados. En caso de detectarse alguna desviación, se debe verificar lo siguiente: Fecha de vencimiento de los reactivos, condiciones de almacenamiento, pipetas, dispositivos, condiciones de incubación y método de lavado. 13. CÁLCULO DE RESULTADOS La DO de los estándares (eje-y, lineal) se plotean contra su concentración (eje-x, logarítmico) ya sea en papel semi-logarítmico o empleando un método automático. Se logra un buen ajuste con cubic spline, 4 Parameter Logistics or Logit-Log. Para el cálculo de la curva estándar, use las mediciones obtenidas de los estándares (es aconsejable no emplear valores duplicados). La concentración de las muestras se puede leer directamente de la curva estándar. Al momento de leer los resultados en el gráfico, tome en cuenta la dilución inicial. Los resultados de muestras diluídas con un factor mayor al inicial, deben ser multiplicados por el factor correspondiente. Las muestras que presenten una señal mayor a la del estándar mayor tienen que ser diluidas según se describe en INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO y analizadas nuevamente. Version / 6
6 La conversión de plasma citratado a valores de suero se logra multiplicando las concentraciones registradas con el factor 1.1. Curva de Calibración Típica (Ejemplo. No usar para el cálculo!) (OD) Lipoprotein (a) ELISA Estándar mg/dl DO Medio CAL CAL CAL CAL CAL (mg/dl) 14. INTERPRETACION DE RESULTADOS La interpretación de los valores obtenidos se ve influenciada por factores genéticos (por ej. polimorfismo, diferencias étnicas o según el género) y por la distribución asimétrica de la incidencia de los valores de Lp(a): por ej., el valor promedio para personas de raza blanca se aproxima a 10 mg/dl, para chinos, a 7 mg/dl y para sudaneses, a 40 mg/dl. Para las personas de raza blanca, se ha descripto un 15%-20% de riesgo de presentar síntomas de ateroesclerosis para aquellos individuos con niveles de plasma de mg/dl. Los resultados de los análisis pueden interpretarse de acuerdo con la siguiente tabla: Evaluación Lp(a) [mg/dl] Los resultados por si solos no deben ser la única razón Gama normal < 25 Riesgo elevado / límite Gama patológica >35 para un tratamiento terapéutico, sino que deben correlacionarse con observaciones clínicas y ensayos de diagnóstico. Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio rango de valores normales. 15. PRUEBAS FUNCIONALES Especificidad Analítica (Reactividad Cruzada) Las reacciones cruzadas con plasminógeno y LDL están por debajo del límite de detección. Los anticuerpos usados en este ensayo identifican todas las isoformas conocidas de apo(a). Precisión Intervalo (mg/dl) CV Intervalo (%) Intra-Ensayo Inter-Ensayo Linearidad Sensibilidad Analítica Comparación de Métodos Dilución Medido (mg/dl) Linearidad (%) 1: : : : : : : : : : : : <5 mg/dl IBL-ELISA = x LEIA r = Estandarización: Correlación: No hay un método ni estándar establecido para la determinación de Lp(a). Los valores obtenidos con el Lipoprotein (a) ELISA mostraron una muy buena correlación con los valores obtenidos por métodos turbidimétricos (ver Figura 2). Version / 6
7 100 Regression Plot 90% Confidence Bands Batch 0115 values found (mg/dl) Expected values (mg/dl) Y = 4, ,052 * X; R^2 =,95 Figura 2: Curva de correlación ELISA/LEIA 16. REFERENCIAS SOBRE EL PRODUCTO 1. Berg, K.: A new serum type system in man - the Lp system; Acta Pathol. Microbiol. Scand. 59, (1963) 2. Dagen, M.M., Packard, C.J., Shepherd, J.: A comparison of commercial kits for the measurement of lipoprotein(a); Ann. Clin. Biochem. 28, (1991) 3. Dahlen, G.H.: Lipoprotein(a), Atherosclerosis and Thrombosis; Prog. Lipid. Res. 30/2+3, (1991) 4. Dahlen, G.H., Guyton, J.R., Attar, M., Farmer, J.A., Kautz, J.A., Gotto, A.M.: Association of levels of lipoprotein Lp(a), plasma lipids and other lipoproteins with coronary artery disease documented by angiography; Circulation 74, (1986) 5. Eaton, D.L., Fless, G.M., Kohr, W.J., McLean, J.W., Xu, Q-T., Miller, C.G., Lawn, R.M., Scanu, A.M.: Partial amino acid sequence of apolipoprotein(a) shows that it is homologous to plasminogen; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, (1987) 6. Edelberg, J.M., Pizzo, S.V.: Lipoprotein(a): The Link Between Impaired Fibrinolysis and Atherosclerosis; Fibrinolysis 3, (1991) 7. Kostner, G.M.: Immunochemische Bestimmung von Lipoprotein (a); Berichte der ÖGKC, Jg. 15, (1992) 8. Lawn, R.M.: Lipoprotein A und Herzinfarkt; Spektr. Wiss. 78 (08/1992) 9. Rhoads, G.G., Dahlen, G., Berg, K., Horton, N.E., Danneberg, A.L.: Lp(a) lipoprotein as a risk factor for myocardial infarction; JAMA 256, (1986) 10. Scanu, A.M.: Update on lipoprotein(a); Curr. Opin. Lipidol. 2, (1991) 11. Scanu, A.M.: Lipoprotein(a): A Genetic Risk Factor for Premature Coronary Heart Disease; JAMA 267/24, (1992) 12. Scanu, A.M. and Fless G.M.: Lipoprotein (a), heterogeneity and biological relevance; J. Clin. Invest. 85, (1990) 13. Steinmetz, A., Utermann, G.: Lipoprotein(a) als Risikofaktor für Arteriosklerose; Internist 33, (1992) 14. Utermann, G., Menzel, H.J., Kraft, H.G., Duba, H.C., Kemmler, H.G., Seitz, C.: Lp(a) glycoprotein phenotypes: inheritance and relation to Lp(a) concentrations in plasma; J. Clin. Invest. 80, (1987) 15. Utermann, G., Kraft, H.G., Menzel, H.J., Hopferweise, T., Seitz, C.: Genetics of the quantitative Lp(a) lipoprotein trait. I. Relation of Lp(a) glycoprotein phenotypes to Lp(a) lipoprotein concentrations in plasma; Hum. Genet. 78, (1988) Version / 6
8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /
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