Expresión y purificación de proinsulina humana a partir de cultivos de raíces transformadas de Brassica Oleracea Var (Brócoli)

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1 Expresión y purificación de proinsulina humana a partir de cultivos de raíces transformadas de Brassica Oleracea Var (Brócoli) Berenice García-Reyes, María del Carmen Montes-Horcasitas, Emma Gloria Ramos- Ramírez, Armando Ariza-Castolo*, Josefina Pérez-Vargas**, Octavio Gómez-Guzmán, Graciano Calva-Calva Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional. Departamento de Biotecnología y Bioingeniería. Av. Instituto Politécnico Nacional No. 2508, Col. San Pedro Zacatenco México D.F. *Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional. Departamento de Química. Av. Instituto Politécnico Nacional No. 2508, Col. San Pedro Zacatenco México D.F. **Tecnológico de Estudios Superiores de Ecatepec. Ingeniería Bioquímica. Av. Tecnológico S/N Col. Valle de Anáhuac, Ecatepec de Morelos, C.P Estado de México. gcalva@cinvestav.mx Recibido: 21 de octubre de Aceptado: 30 de octubre de Palabras clave: Proteína heteróloga; Agrobacterium rhizogenes; pcambia; GUSPlus; Brócoli. Key words: Heterologous protein; Agrobacterium rhizogenes; pcambia; GUSPlus; Broccoli. RESUMEN. La proteína proinsulina, precursor natural de la insulina, se ha investigado como un neuroprotector y para el tratamiento de la retinitis pigmentaria, que actúa sobre degeneración de los fotorreceptores, la conectividad sináptica, y la actividad funcional de la retina. La proinsulina humana es producida por sistemas bacterianos recombinantes, sin embargo el proceso es caro. En este trabajo se evaluaron los niveles de expresión de la proinsulina en cultivos de raíces transformadas de brócoli como un modelo alternativo para su producción. Los niveles de expresión y la identidad de la proinsulina se evaluaron en extractos crudos y fracciones purificadas de proteína por SDS-PAGE y técnicas de Western Blot, respectivamente. Debido al pequeño tamaño de la proteína proinsulina (9 kda) se purificó por fraccionamiento con membranas de corte molecular de 30 a 3 kda seguido por cromatografía de exclusión molecular. El rendimiento de la proinsulina fue de 0,02% de la proteína soluble total determinado por ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). La identidad de la proinsulina está siendo confirmada por los análisis de MALDI-TOF. ABSTRACT. The proinsulin protein, natural precursor of insulin, has been investigated as a neuroprotective and for the treatment of retinitis pigmentosa, acting on photoreceptor degeneration, synaptic connectivity, and functional activity of the retina. Human proinsulin is produced by recombinant bacterial systems, however the process is expensive. In this work we evaluated the expression levels of the human proinsulin in hairy root cultures of broccoli as an alternative model for production of this therapeutic protein. The expression levels and identity of the human proinsulin was evaluated in crude extracts and purified fractions of protein by SDS-PAGE and Western Blot techniques, respectively. Because of the small size of the proinsulin protein (9 kda) it was purified by fractionation with 30 to 3 kda molecular-cutoff membranes followed by molecular exclusion chromatography. The yield of proinsulin was 0.02% of total soluble protein determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The identity of proinsulin is being confirmed by MALDI-TOF analyses. INTRODUCCIÓN La proinsulina o es el precursor natural de la insulina. Se utiliza como neuroprotector y en el tratamiento de enfermedades como la retinosis pigmentosa y la diabetes. Esta última es una enfermedad metabólica crónica 434

2 caracterizada por alteraciones en el metabolismo de carbohidratos, grasas y proteínas y es una de las principales causas de muerte en el mundo, donde se ha reportado que existen alrededor de 171 millones de personas que la padecen y se estima que llegarán a 370 millones en En México, desde 1940 la diabetes ya se encontraba dentro de las primeras 20 causas de mortalidad, con una tasa de 4.2 por habitantes. A partir del año 2007, la diabetes se convirtió en la primera causa de muerte en mujeres y hombres. 1,2 Con lo anterior queda clara la importancia de producir insulina para el tratamiento de la diabetes en cantidad suficiente y a un costo accesible para satisfacer la demanda de la población que así lo requiere. La producción comercial actual de proinsulina e insulina se realiza utilizando microorganismos transgénicos, pero los sistemas vegetales ofrecen ventajas. La primera insulina que se utilizó para tratamiento de la diabetes fue extraída del páncreas de ganado bovino o porcino, pero actualmente se utiliza la humana recombinante debido a que la FDA así lo dispuso, retirando del mercado las extraídas del ganado. Así, la insulina recombinante se ha expresado en bacterias, levadura, hongos, cultivos de células de mamífero, animales transgénicos, 3 y plantas transgénicas completas o en sus células tejidos y órganos cultivados in vitro. 4 No obstante, su producción comercial en la actualidad se realiza con Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae. A pesar de que estos sistemas comerciales han experimentado un considerable refinamiento y optimización en las dos últimas décadas, y han alcanzado niveles de producción anual del orden de cinco toneladas, se prevén algunas dificultades para atender a la demanda del futuro, motivando a la búsqueda de procesos alternativos y complementarios de producción. Entre esos procesos, los sistemas basados en plantas transgénicas completas, o el cultivo in vitro de su célula, tejidos y órganos ofrecen potencial, seguridad, economía, y capacidad para la producción para este tipo de biofármacos. 5 Las plantas transgénicas ofrecen estabilidad física, fisicoquímica y nutricional suficiente para poder llegar a cualquier parte del mundo y entregar al receptor final los compuestos o proteínas transgénicas respectivas en estado activo. El uso farmacéutico de plantas transgénicas ha sido bien aceptado por la sociedad, lo que contrasta con los temores y políticas en la población cuando el objetivo es utilizarlas como alimentos transgénicos. 6,7 Además, el cultivos in vitro de células, tejidos y órganos vegetales, es una tecnología que desde hace tiempo representa una opción real y económicamente viable. Así, la producción de los compuestos de interés puede efectuarse con los cultivos in vitro en biorreactores o utilizando plantas transgénicas completas. Así, con el objetivo de explorar el potencial de estas tecnologías, en este trabajo se presentan los resultados de la expresión y purificación de la proinsulina a nivel de matraz por cultivos de raíces Brassica oleracea var. italica transformadas con el cdna del gen de la insulina humana (Ins). Con los resultados se pretende establecer las bases para estudiar la posibilidad de usar esta planta como modelo para el estudio de procesos postraduccionales de esta proteína y proponer un proceso biotecnológico de producción para coadyuvar a la creciente demanda de preinsulina e insulina debida al aumento de la población que presenta problemas de diabetes. MATERIALES Y MÉTODOS Material vegetal. Se usaron plántulas de brócoli (Brassica oleracea var. itálica) obtenidas mediante la germinación de semillas en medio mineral semisólido (1.8 g/l fitagel) Gamborg s B5 adicionado con vitaminas pero sin reguladores de crecimiento. Preparación del vector binario con el cdna de preproinsulina. El cdna de preproinsulina se aisló a partir de la clona (Open Biosystems, USA) de E. coli llevando el cdna del gen completo de la insulina (Ins) insertado en el plásmido pdnr-lib (Figura 1). El cdna fue liberado por restricción con EcoR I, y Xho I y se amplificó por PCR con oligos diseñados en este trabajo para luego ser incorporado al vector pcambia (Figura 2). Los oligos contienen las secuencias para Eco31 combinada con las de las enzimas Nco I, Bgl II para los oligos directo y reverso respectivamente. Establecimiento de cultivos de raíces transformadas. Con la construcción resultante de pcambia se realizó la transfección del cdna a plántulas de Brócoli para obtener raíces transformadas vía agroinfección usando Agrobacterium rhizogenes LBA9402 como se reportó anteriormente. 8,9 La transformación se corroboró por PCR y ensayos de β-glucuronidasa de acuerdo a lo reportado previamente. 10 Ensayos de Extracción y purificación de proinsulina. El contenido de proteína total soluble se determinó por el método de Bradford y la presencia de insulina y proinsulina en los extractos se verificó PAGE y por ensayos de ELISA con anticuerpos específicos. Para la purificación de preinsulina se estableció un tren de purificación a partir de los extractos crudos de proteína total soluble aplicando cuatro etapas: fraccionamiento por ultrafiltración tangencial utilizando tubos Amicon Ultra; una Cromatografía de Exclusión Molecular; concentrado y desalado con tubos Amicon ultra y liofilizado. En cada etapa se verificó el perfil de proteína por SDS-PAGE. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Con el uso de oligos diseñados para añadir la secuencia correspondiente a las enzimas Nco I, Bgl II y Eco 31 I al cdna del gen ins, se logró amplificar dos tamaños de fragmentos que contienen el cdna del gen ins tal como se esperaba de acuerdo a la información sobre este vector. Los oligos preproinsulina y proinsulina amplificaron los fragmentos de 495 y 364 pb correspondientes al cdna de la preproinsulina y proinsulina respectivamente (Figura 1), tanto en su totalidad (preproinsulina) como el fragmento que no contiene la región correspondiente al péptido señal de la proteína correspondiente (proinsulina). 435

3 Fig 1. Productos de PCR del vector pdnr-lib-ins amplificado con los oligos prepro y pro insulina diseñados en este trabajo para la amplificación del cdna de los genes respectivos. El cdna liberado por restricción con EcoR I, y Xho I se amplificó por PCR para luego ser incorporado al vector pcambia y obtener las construcciones para la expresión de preproinsulina pcppins-bgr y y proinsulina pcpins-bgr (Figura 2). Los oligos contienen las secuencias para Eco31 combinada con las de las enzimas Nco I, Bgl II para los oligos directo y reverso respectivamente. Con las construcciones resultante se realizó la transfección del cdna amplificado a plántulas de Brócoli para obtener raíces transformadas vía agroinfección usando Agrobacterium rhizogenes LBA9402 como se reportó anteriormente. 10,11 La transformación se corroboró por PCR y ensayos de glucuronidasa. Con las raíces propagadas exitosamente en medio semisólido se establecieron cultivos en medio líquido (Figura 3D). Paralelamente varias plántulas que no fueron infectadas se utilizaron para establecer cultivos de raíces no transformadas con la finalidad de ser utilizadas como control contra las líneas transformantes (Figura 3C). Estos cultivos, a diferencia de las raíces transformadas, mostraron crecimiento típico, pilosidad normal y sensibilidad a higromicina, lo que demuestra la presencia del T-DNA del plásmido pcambia en los tejidos transformados, lo que les confiere resistencia a higromicina y actividad de β-glucuronidasa para la reacción GUS. Fig 2. Vector pcambia y construcciones de preproinsulina y proinsulina. Los colores en los fragmentos representan las secuencias de la señal para translocación a retículo endoplásmico (naranja), cadena B (verde), péptido C (negro) y cadena A (azul). 436

4 Como se esperaba, los cultivos de raíces transformadas con Agrobacterium sin plásmido foráneo mostraron sensibilidad a higromicina y reacción negativa a GUS (Figura 3c y d). Esto debido a que a pesar de ser raíces transformadas estas no poseen resistencia a higromicina ni producen β-glucuronidasa porque esos genes están presentes en el vector pcambia pero no en el plásmido pri de Agrobacterium. Por otro lado, para investigar la presencia del cdna correspondiente a la preinsulina y preproinsulina en el genoma de las raíces transformadas con las cepas de Agrobacterium rhizogenes que lleva las construcciones pcppins-bgr y pcpins-bgr se aisló el DNA genómico y se analizó por PCR (Figura 4). Como puede observarse se detectaron claramente los fragmentos correspondientes en los productos de reacción. Estos resultados confirman la presencia del cdna correspondiente en el genoma vegetal. Fig 3. Establecimiento de cultivo de raíces transformadas (A, B) y su respuesta al ensayo de β-glucuronidasa. Nótese la ausencia de coloración azul en los cultivos de raíces no transformadas con los vectores pcambia. Fig 4. Resultados de la PCR de DNA genómico vegetal utilizando los oligos mostrados en la figura 1 para investigar la presencia del cdna de la preinsulina y preproinsulina. Para evaluar los niveles de expresión se determinó el contenido de proteína total soluble en las líneas de raíces transformadas. El contenido de proteína en la mayoría de las líneas de estas raíces (1.25 mg/g biomasa) no fueron diferentes significativamente con las transformadas con el vector pcambia vacío (1.46 mg/g biomasa), sin embargo la producción promedio de proinsulina evaluada por ELISA (Figura 5) y confirmada por su peso molecular (8 kda) por PAGE después de haberla purificado parcialmente mediante filtración tangencial (Figura 6), fue de 0.25 µg/ml. 437

5 Fig 5. Niveles de proinsulina en extractos proteicos de varios cultivos de raíces transformadas de brócoli purificados parcialmente mediante filtración tangencial y evaluada por ELISA utilizando anticuerpos específicos contra insulina. Fig 6. PAGE de extractos proteicos de varios cultivos de raíces transformadas de brócoli después de haber sido purificados parcialmente mediante filtración tangencial. CONCLUSIONES Se establecieron cultivos de raíces transformadas de brócoli transformadas vía Agrobacterium llevando las construcciones pcppins-bgr y pcpins-bgr que a su vez llevan fragmentos de DNA del gen Ins que codifica para la preinsulina y preproinsulina humana. Estos cultivos son valiosos para estudiar la posibilidad de establecer un bioproceso alternativo para la producción tanto de insulina como de preproinsulina y proinsulina. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. INEGI (2007). "Estadísticas Demográficas, 2005." Base de datos. CONAPO, INEGI y COLMEX. 2. Salud, S. d. (2002). "Estadísticas de mortalidad en México: muertes registradas en el año 2000." Salud Publica Mex 44: BioSidus. (2007). from 4. Nykiforuk, C.L., et al. (2006): Transgenic expression and recovery of biologically active recombinant human insulin from Arabidopsis thaliana seeds, Biotechnology Journal, 4, Deckers, H., M.M. Moloney, and A. Baum. (1999): The case for recombinant production of pharmaceutical proteins in plants, Annu. Rep. Med. Chem., 34, Calva, G., F. Esparza, et al. (2002). "como biorreactores para la producción de biomoléculas y remoción de xenobióticos." Avance y Perspectiva 21: Calva, G. and J. Pérez (2005). "Plant cell tissue and culture." Tecnocultura García-Reyes, Berenice; Ramos-Ramírez, Emma G.; Montes-Horcasitas, M. del Carmen; Esparza-García, Fernando J.; Ariza-Castolo, Armando; Gómez-Guzmán, Octavio; Pérez Vargas Josefina; Calva-Calva, Graciano (2012). Cultivos de Raíces de Brassica oleracea var italica (Brócoli) transformadas con el cdna del Gen de la Preproinsulina Humana. XVII Congreso Nacional de Ingeniería Bioquímica, VII Congreso Internacional de Ingeniería Bioquímica, VIII Jornadas Científicas de Biomedicina y Biotecnología Molecular. Ixtapa Zihuatanejo, Guerrero (México). 28, 29 y 30 de marzo Abstract BML510GRA

6 9. Berenice García-Reyes, Emma Gloria Ramos-Ramírez, María del Carmen, Montes-Horcasitas, Fernando José Esparza-García, Armando Ariza-Castolo, Octavio Gómez-Guzmán, Josefina Pérez-Vargas, Graciano, Calva-Calva (2014). Purificación de proinsulina a partir de cultivos de raíces transformadas de Brassica oleracea var italica (Brócoli). VIII Congreso Internacional de Ingeniería Bioquímica, XIX Congreso Nacional de Ingeniería Bioquímica, 80 Aniversario de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, XII Jornadas Científicas de Biomedicina y Biotecnología Molecular (Mazatlán, Sinaloa, México; Abril 9-11, 2014). Adán Núñez Arévalo (Ed.). Memorias CD ISBN xxxx, Colegio Mexicano de Ingenieros Bioquímicos. Azcapotzalco, México D. F. Artículo BML439BGR Berenice García Reyes, María del Carmen Montes Horcasitas, Emma Gloria Ramos Ramírez, Armando Ariza Castolo, Josefina Pérez Vargas, Octavio Gómez Guzmán, and Graciano Calva Calva (2010). Cloning of the human insulin cdna gene in hairy roots of Brassica oleracea var italica (broccoli). XV International Scientific Congress CNIC'2010. Organized by the National Center for Scientific Research. June 28th to July 1st, Havana, Cuba. Revista CENIC Ciencias Biológicas 41 (Número Especial): 1-9 PNA053 ISSN García Reyes, Berenice; Calva Calva, Graciano; et al. (2010): Cloning of the human insulin cdna gene in hairy roots of Brassica oleracea var italica (broccoli), CENIC Ciencias Biológicas, 41, PNA053. ISSN