Manual de laboratorio de Banco de Sangre. Dr. Jonathan Alfaro Alvarado Dr. Carlos Cordero Gómez Dr. Miguel A Rodríguez Pineda.

Transcripción

1 Manual de laboratorio de Banco de Sangre Dr. Jonathan Alfaro Alvarado Dr. Carlos Cordero Gómez Dr. Miguel A Rodríguez Pineda.

2 Procedimiento 1 Prueba de Antiglobulina Indirecta v Principio La técnica de inmunoglobulina indirecta fue descrita por primera vez en 1945 por Coombs y colaboradores y permite observar aglutinaciones de anticuerpos que normalmente no serían evidenciables en condiciones estándar de laboratorio. La técnica de antiglobulina indirecta, permite detectar los anticuerpos de tipo IgG, que no tienen la capacidad de aglutinar de manera espontánea y requiere de una fase de revelado para poder evidenciarlos. Se utiliza en el fenotipaje de grupos sanguíneos, en los que los antígenos se encuentran en baja densidad antigénica y donde el anticuerpo utilizado es IgG., Igualmente es aplicable en aquellos casos en los que se buscan anticuerpos de tipo IgG en el suero de una persona. En esta prueba se utiliza el suero de Coombs, o reactivo de antiglobulina humana, el cual consiste, en su forma más simple, en una inmunoglobulina dirigida contra la porción Fc de los anticuerpos de tipo IgG. Existen igualmente reactivos que están conformados no solamente por inmunoglobulinas anti- IgG, sino también por anticuerpos dirigidas contra la molécula C3 del complemento, lo que permite reconocer la presencia de anticuerpos fijadores de complemento. Se han desarrollado asimismo reactivos dirigidos contra fracciones específicas de complemento, como C3b, C3d, C4b y C4d. En este sentido podemos encontrar reactivos de antiglobulina humana policlonales (anti IgG + anti C) o monoespecíficos que contienen solo uno de los anticuerpos en mención La prueba de Antiglobulina Indirecta cuenta con varias fases, siendo la primera una fase la centrifugación, sin previa incubación en la cual se detectan anticuerpos de tipo IgM como los del sistema ABO, auto-anti-i, anti-m, anti-n, anti-lewis, etc. Por esta razón cuando se esta utilizando esta técnica, con el objetivo de detectar anticuerpos irregulares en pacientes, las células que se utilizan deberán ser de grupo O para evitar a interferencia del anti A y anti B. La segunda fase consta en incubar la reacción a una temperatura de 37ºC, por un tiempo que estará definido por el tipo de potenciador que utilicemos, como albúmina, LISS, polietilenglicol o enzimas. En caso de que alguno de estos reactivos sea utilizado, es necesario apegarse a las instrucciones aportadas por el fabricante. Durante la incubación se pretende que ocurra la sensibilización del glóbulo rojo, que permitirá detectar la reacción antígeno-anticuerpo en la fase de revelado. Una vez terminada esta incubación, se pasa a realizar lavados con el fin de remover inmunoglobulinas u otro tipo de proteínas, que no se unieron al eritrocito y que pueden interferir con la reacción. La fase de los lavados es crítica, ya que la presencia de anticuerpos u otros interferentes en el suero podrían llevar a la neutralización del reactivo. Asimismo, es sumamente importante eliminar el exceso de

3 solución salina al finalizar estos lavados, ya que de lo contrario, el reactivo de antiglobulina es diluido, lo cual puede afectar la sensibilidad de la prueba. Posterior a los lavados, y de haber eliminado la última gota de solución salina se añade el reactivo de antiglobulina, fase de revelado se centrifuga y se lee la prueba. De haberse dado sensibilización, los anticuerpos adheridos a la superficie eritrocitaria serán reconocidos por el reactivo de antiglobulina y se podrá observar una reacción de aglutinación. Muestras y reactivos Solución salina Muestras de sangre total anticoagulada con EDTA. Baño maría a 37ºC. Juego de células rastreadoras 3%. Reactivo de Antiglobulina Humana. Albúmina bovina 22%. Células de control de antiglobulina humana. Método 1. Rotular tubos para las Células I, Células II y Células III. 2. Mezclar y homogenizar con suavidad el juego de reactivo de células rastreadoras. 3. Añadir al tubo rotulado como células I, 50 ul del pool I. Debe tenerse especial cuidado en no intercambiar las tapas de los goteros y en minimizar la posibilidad de contaminación de los mismos. 4. Añadir al tubo rotulado como células II, 50 ul del pool II. 5. Añadir al tubo rotulado como células III, 50 ul del pool III. 6. Añadir 100 ul del suero en análisis a cada uno de los tubos. 7. Agregue 100 ul de albúmina al 22%. A partir de este momento se inician las tres fases de una prueba de antiglobulina: Fase 1, centrifugación inmediata o prueba rápida: 1. Centrifugar los tubos 30 segundos a 3000 rpm. 2. Resuspender con suavidad, leer y anotar resultados. Fase II, incubación a 37ºC: 1. Después de la lectura anterior, colocar los tubos a 37ºC por 30 minutos. 2. Centrifugar los tubos 30 segundos a 3000 rpm. Leer y anotar resultados. 3. Realizar tres lavados con solución salina fisiológica. 4. Secar la última gota de solución salina Fase III, antiglobulina: 1. Añadir 100ul del reactivo de antiglobulina humana poliespecífico (suero de Coombs).

4 2. Mezclar y centrifugar 30 segundos a 3000 rpm. 3. A las pruebas que dieron negativo, se les realiza el control con Células Control, agregando 50ul de las células Control de Antiglobulina Humana. 4. Mezclar y centrifugar 30 segundos a 3000 rpm, leer y anotar resultados. Procedimiento 2 Prueba de Antiglobulina Directa v Principio La prueba de antiglobulina directa se utiliza primordialmente para determinar si los eritrocitos del paciente en análisis están recubiertos por inmunoglobulinas o fracciones de complemento. Esto puede llegar a presentarse en diferentes condiciones, como por ejemplo, la presencia de aloanticuerpos, producto de una reacción hemolítica tardía o por enfermedad hemolítica del recién nacido o autoanticuerpos en anemias hemolíticas autoinmunes, dirigidos contra antígenos de propios de la superficie eritrocitaria, de anticuerpos dirigidos contra drogas que se adsorben a la membrana del glóbulo rojo o por la activación de complemento en esta superficie. Por estas razones, la prueba de antiglobulina directa son útiles en el estudio de anemias hemolíticas, y el resultado debe analizarse en el contexto clínico para poder dar un diagnóstico certero. Normalmente, esta prueba se realiza con el reactivo de Antiglobulina Humana, que tal como se explicó en el procedimiento anterior, usualmente es poliespecífico e incluye anticuerpos dirigidos tanto contra las IgG humanas como contra fracciones del complemento. En caso de obtener una reacción positiva utilizando el reactivo poliespecífico, se procede a repetir la determinación utilizando reactivos monoespecíficos con el fin de identificar la especificidad de las proteínas involucradas en la reacción. Dado que es posible que exista fijación de complemento in vitro en muestras no anticoaguladas, se prefiere realizar esta prueba en muestras con EDTA. De lo contrario, se puede obtener un resultado positivo debido a la activación del complemento, durante la coagulación. También se recomienda utilizar eritrocitos lavados para realizar la prueba, ya que podrán existir proteínas o sustancias inespecíficas que interferirían con la reacción. Muestras y Reactivos Solución salina Muestras de sangre total anticoagulada con EDTA. Baño maría a 37ºC. Reactivo de Antiglobulina Humana Células de control de antiglobulina humana. Método

5 1. Rotular tres tubos con el número de muestra por analizar. 2. Tomar una alícuota de la muestra y transferir al tubo correspondiente. 3. Realizar tres lavados con solución salina fisiológica. 4. En el segundo tubo hacer una suspensión de trabajo al 3-5% a partir de la muestra de eritrocitos lavada. 5. Añadir al tercer tubo 50 ul de la suspensión de trabajo realizada. 6. Añadir 100 ul del reactivo de antiglobulina humana. 7. Mezclar y centrifugar por 30 segundos a 3000 rpm 8. Resuspender levemente, leer por aglutinación y hacer las anotaciones respectivas. 9. En caso de obtener un resultado negativo, corroborar el mismo utilizando las Células Control. Procedimiento 3 Estudio de Anticuerpos Irregulares utilizando Células Rastreadoras v Principio Como se mencionó anteriormente, la prueba de Antiglobulina Indirecta puede ser utilizada para la detección de la presencia de anticuerpos dirigidos hacia antígenos de la superficie eritrocitaria. En medicina transfusional es de suma importancia la detección de la presencia de estos anticuerpos, ya que si están presentes en el suero de un paciente, por una reacción de aloinmunización previa, permitirá definir cual es la sangre más indicada para ser transfundida. Por esta razón, el rastreo de anticuerpos se realiza de rutina a todos los receptores de hemocomponentes, como parte de los estudios pretransfusionales. Lo anterior con el fin de prevenir reacciones transfusionales hemolíticas leves y graves, reduciendo un acortamiento de la sobrevida de las células transfundidas. Los anticuerpos irregulares son por lo general del tipo IgG, reactivos a 37ºC y/o en la prueba de antiglobulina. Son ejemplos de este tipo de anticuerpos los dirigidos contra los antígenos de los grupos sanguíneos Rh, Kell, Duffy, Kidd y SsU. Se ha estimado que la incidencia de anticuerpos irregulares, en diferentes poblaciones oscila entre el 0,78% y el 1,64%. En poblaciones hospitalarias especiales, que por su condición de fondo reciben transfusiones de hemocomponentes con frecuencia, esta incidencia puede ser mucho mayor. Los métodos empleados en la detección de anticuerpos irregulares pueden incluir 3 o más células pantalla o rastreadoras. Estas células deben de contar con los antígenos de significancia clínica y se trabajan, al igual que las suspensiones de trabajo eritrocitarias, a una concentración de 3 %, para la técnica en tubo. Cuando un anticuerpo irregular es detectado, la especificidad debe de ser definida mediante la confrontación del plasma del paciente con las células del panel de identificación de anticuerpos. Una vez identificada la especificidad del anticuerpo, se debe de buscar un hemocomponente que no posea dicho antígeno, realizarle la prueba cruzada y solo

6 una vez obtenido un resultado negativo se procede a transfundir al paciente. Muestras y reactivos Solución salina Muestras de sangre con EDTA. Baño maría a 37ºC. Juego de células rastreadoras 3%. Reactivo de Antiglobulina Humana Albúmina bovina 22%. Células de control. Método 1. Rotular tubos para las Células I, Células II y Células III. 2. Mezclar y homogenizar con suavidad el juego de reactivo de células rastreadoras. 3. Añadir al tubo rotulado como células I, 50 ul del pool I. Debe tenerse especial cuidado en no intercambiar las tapas de los goteros y en minimizar la posibilidad de contaminación de los mismos. 4. Añadir al tubo rotulado como células II, 50 ul del pool II. 5. Añadir al tubo rotulado como células III, 50 ul del pool III. 6. Añadir 100 ul del suero en análisis a cada uno de los tubos. 7. A partir de este momento se inician las tres fases de una prueba de antiglobulina: Fase I, centrifugación inmediata o prueba rápida: 1. Centrifugar los tubos 30 segundos a 3000 rpm. 2. Resuspender con suavidad, leer y anotar resultados. Fase II, incubación a 37ºC: 1. Después de la lectura anterior, colocar los tubos a 37ºC por 30 minutos. 2. Centrifugar los tubos 30 segundos a 3000 rpm. Leer y anotar resultados. 3. Realizar tres lavados con solución salina fisiológica. 4. Secar la última gota de solución salina Fase III, antiglobulina: 1. Añadir 100ul del reactivo de antiglobulina humana poliespecífico. 2. Mezclar y centrifugar 30 segundos a 3000 rpm. 3. A las pruebas que dieron negativo, se les realiza el control con Células Control. 4. Mezclar y centrifugar 30 segundos a 3000 rpm, leer y anotar resultados.

7 Procedimiento 4 Pruebas de Compatibilidad Sanguínea v Principio La transfusión sanguínea representa en la actualidad una parte importante de la práctica médica y en algunas patologías, la única terapia existente. Sin embargo, el éxito de este tipo de terapia depende de multiples factores, entre ellos, que se asegure compatibilidad entre el donador y el receptor de un hemocomponente. Para que un hemocomponente pueda ser utilizado en un paciente particular, las normas internacionales indican que debe cumplirse de previo con los siguientes procedimientos: - Solicitud del hemocomponente por parte del médico tratante. - Muestra de sangre del receptor. Tubo con anticoagulante tipo EDTA - La identidad del paciente y de la muestra deben ser corroboradas, con el fin de evitar cualquier tipo de confusión. - Pruebas al donante: grupo ABO/Rh, - Pruebas al receptor: grupo ABO/Rh, detección de anticuerpos irregulares. - Prueba cruzada mayor. Además, es necesario incluir diferentes etapas de verificación que permitan confirmar que efectivamente se están trabajando las muestras correspondientes al hemocomponente y al receptor. PROCESO DE LAS PRUEBAS PRETRANSFUSIONALES La Solicitud, identificación y colección de la muestra de sangre: Las reacciones por transfusión se pueden deber a reacciones hemolíticas secundarias, dado al bajo título de anticuerpos, a errores de tipo clerical por identificación equívoca del paciente a transfundir, confusión al momento de extraer la muestra, o en el laboratorio. Antes de realizar la extracción de sangre, el tubo y la solicitud deben de coincidir con la identificación del paciente, preguntando directamente cuando sea factible al paciente o corroborando con brazaletes de identificación; nunca se debe de guiar por los números de cama, ya que los pacientes pueden ser cambiados dependiendo de la necesidad del servicio. La solicitud debe tener como datos mínimos: Identificación del paciente, número de cédula de identidad o pasaporte. Nombre completo y edad del receptor. Sexo. En caso de conocerse se debe de indicar valores como por ejemplo grupo ABO y Rh, hemoglobina y hematocrito, antecedentes transfusionales, gestaciones, inmunización materno fetal, reacciones adversas que se hubieran presentando.

8 Diagnóstico de certeza o de probabilidad, así como el motivo de la indicación transfusional. Señalar el producto a solicitar incluyendo cantidad de unidades, volumen o características requeridas. Fecha y hora en que se realizará la transfusión y, de ser necesario el señalamiento de la urgencia de la transfusión. Nombre completo y firma del médico que indica la transfusión. Las solicitudes transfusionales deben ser escritas en forma legible para evitar al máximo la equivocación. Después de haber realizado una adecuada identificación del receptor, la muestra de sangre debe ser obtenida, usando técnicas muy cuidadosas para evitar hemólisis, ya que la misma produce activación del complemento y algunos anticuerpos pueden ser enmascarados, al requerirse del complemento para visualizar la reacción antígeno-anticuerpo. Si no existen problemas serológicos (presencia de múltiples anticuerpos) anticuerpos de fondo son suficientes 5 ml de sangreel receptor para realizar todos los procedimientos inmunohematológicos. Grupo ABO En la medida de lo posible los receptores deberán recibir hemocomponentes sanguíneos ABO idénticos, sin embargo, en ciertas situaciones puede ser necesario hacer selecciones alternativas. La determinación del grupo ABO es el paso más importante de las pruebas serológicas pretransfusionales. Se emplean antisueros anti A y anti B, para determinar grupo eritrocítico y glóbulos rojos con antígenos A1 y B para la prueba sérica. En receptores menores de 4 meses de edad la prueba inversa no se realiza, ya que en este tipo de pacientes el desarrollo de los anticuerpos naturales todavía es inmaduro. En caso de discrepancias entre grupo directo e inverso se emplearán técnicas adicionales antes de establecer el tipo sanguíneo. Cuando se está en presencia de una urgencia extrema, en la que el grupo ABO no se puede determinar se podrá utilizar glóbulos rojos empacados del grupo O para transfundir. ESQUEMA DE SELECCION DE HEMOCOMPONENTES POR ABO: Si se va a transfundir sangre total o sangre total reconstituida no hay alternativa transfusional, todas deberán de transfundirse grupo ABO idéntico. Tabla 1 Esquema transfusional para Sangre total Grupo del paciente A B AB O Grupo de la unidad a transfundir A B AB O

9 Si la solicitud se refiere a Glóbulos Rojos Empacados se pueden utilizar alternativas como se indican en la tabla 2 dependiendo de las existencias y reservas del Banco de Sangre. Tabla 2 Esquema transfusional para glóbulos rojos empacados Grupo del Opción 1 Opción 2 Opción 3 Opción 4 paciente A A O - - B B O - - AB AB A B O O O El grupo sanguíneo O, puede utilizarse con cualquier paciente ya que carece de antígenos, lo anterior solo si no hay existencia de el grupo del paciente y en las transfusiones subsecuentes inmediatas se debe realizar de la misma manera para evitar reacciones de tipo hemolítico. Para los pacientes de grupo AB, se prefiere la utilización de unidades del grupo A sobre B, ya que el anti B del grupo A tiene menor capacidad hemolítica que el anti A del grupo B. La identificación de antígeno Rh D se realiza usando el antisuero anti D, cuando este reactivo es de alta concentración proteica, la prueba debe incluir un control, que permita detectar aquellos pacientes que tiene eritrocitos sensibilizados que puedan dar reacciones falsas positivas. Si el grupo Rh no puede ser establecido, dado a que el control también presenta aglutinación y la transfusión es urgente podrá ser utilizado glóbulos rojos empacados Rh negativo. Los hemocomponentes Rh positivos deberán rutinariamente ser enviados a receptores Rh positivos. El uso de productos Rh negativos para pacientes Rh positivos es permitido, aunque en forma ideal, deberán de reservarse exclusivamente para pacientes o receptores Rh negativos. Solo se recomiendan cuando las unidades están por vencerse. De forma inversa, los productos Rh negativos pueden no estar disponibles, en esta situación se podrá optar por otras medidas alternativas, como posponer la transfusión, hasta que el banco de sangre de manera eficiente solucione dicha situación o en caso de que el retardo de la transfusión ponga en peligro la vida del paciente y siempre que el rastreo de anticuerpos del paciente esté negativo se podría utilizar sangre Rh positiva, con un riesgo de inmunización de un 70%. PRUEBA CRUZADA PARA TRANSFUSIÓN DE ERITROCITOS La prueba cruzada nos permite garantizar la compatibilidad ABO y en caso de que el paciente tenga anticuerpos irregulares permite garantizar que dicho anticuerpo no va a generar una reacción hemolítica tardía. La prueba cruzada en la actualidad ha sido expuesto a una serie de Interrogantes, en cuanto a si debe ser sustituida solo por el rastreo de anticuerpos, en aquellos pacientes que no presentan anticuerpos irregulares.

10 Lo anterior, dado que el rastreo de anticuerpos en los sueros del receptor y del donador tiene una alta sensibilidad. Lo anterior no aplica para cuando la transfusión sea destinada a un paciente que presente anticuerpos clínicamente significativos. La prueba cruzada mayor se refiere a la técnica, mediante el cual se demuestra la ausencia de anticuerpos en el plasma del receptor contra los antígenos del glóbulo rojo del donador. Por otro lado, la prueba cruzada menor se refería al cruce entre los eritrocitos del receptor con el suero del donador y ha sido sustituida en la mayoría de los bancos de sangre, por el rastreo rutinario de anticuerpos clínicamente significativos en los donantes de sangre. En caso de existir en el donante un anticuerpo en su plasma, el plasma es eliminado y los remanentes, probablemente no causen una reacción transfusional, por efecto dilucional. PRUEBA CRUZADA EN SITUACIONES ESPECIALES Urgencias. La necesidad urgente de transfusión en ciertas situaciones clínicas establece que la sangre sea liberada antes de que la prueba cruzada sea terminada. El médico tratante debe estar enterado, que se le esta entregando una unidad sin prueba cruzada completa. En caso de que durante el proceso se determine alguna incompatibilidad en alguno de los pasos, se dará aviso de inmediato al médico encargado para que se administre el tratamiento oportuno. De acuerdo a la necesidad de liberación urgente del producto sanguíneo el Banco de Sangre puede optar por: Enviar glóbulos rojos empacados del grupo O Rh negativo y en caso de no tener en existencia emplear grupo O Rh positivo cuando se desconozca el grupo sanguíneo del receptor. Enviar sangre del mismo grupo ABO y Rh del receptor y donador. Siempre que sea posible, realizar la primera fase de centrifugación inmediata, antes de enviar el producto sanguíneo. Estas medidas pretender evitar una hemolisis de tipo intravascular. Prueba de compatibilidad para productos plasmáticos Los plasmas se transfunden solo con corroboración del grupo sanguíneo ABO. En el caso de la transfusión de plasma no se requiere tomar en consideración el tipo Rh del paciente o donante debido a que estas unidades no contienen el antígeno D. Exceptuando si las unidades están muy contaminadas con eritrocitos. Para el caso de la transfusión de plaquetas, estas deben de ser transfundidas Utilizando el mismo grupo sanguíneo ABO en primera instancia, en caso de no disponer se debe utilizar plaquetas O lavadas.

11 Tabla 3: Esquema transfusional del plasma Grupo del Opción 1 Opción 2 Opción 3 Opción 4 paciente A A AB B B AB AB AB O O A B AB Materiales y reactivos: Frascos de anti A, anti B, anti AB, anti D, anti A1, Reactivo de antiglobulina humana, albúmina al 22%, células A y B al 3%. Tubos con muestras de eritrocitos a analizar. Tubos con muestras de suero a analizar. Células rastreadoras. Tubos de 12 x 75 mm para realizar las reacciones Solución salina al 0.85% (Pizetas). Centrífugas Serológicas. Microscopios. Frascos con células control de antiglobulina humana. Pipetas Pasteur. Bulbos para pipeta Pasteur. Baños de María a 37ºC. Portaobjetos. Caja de aplicadores. Gradillas metálicas. Gradillas madera. Papel toalla. Método: Rotular los tubos con el nombre Paciente 1, Paciente 2, Paciente 3 y Paciente 4 Realizar suspensiones de trabajo 3-5% de los donantes 1, 2, 3 y 4. Añadir 50ul de la suspensión del donante 1 al tubo rotulado como Paciente 1. Añadir 50ul de la suspensión del donante 2 al tubo rotulado como Paciente 2. Añadir 50ul de la suspensión del donante 3 al tubo rotulado como Paciente 3. Añadir 50ul de la suspensión del donante 4 al tubo rotulado como Paciente 4. Añadir 100ul del suero del paciente 1 al tubo rotulado como paciente 1.

12 Añadir 100ul del suero del paciente 2 al tubo rotulado como paciente 2. Añadir 100ul del suero del paciente 3 al tubo rotulado como paciente 3. Añadir 100ul del suero del paciente 4 al tubo rotulado como paciente 4. Añadir 100 ul de albúmina bovina al 22% a todos los tubos. Mezcle los tubos, a partir de este momento iniciamos con las tres fases de la prueba de antiglobulina humana indirecta. Fase I: Centrifugación inmediata o prueba rápida: Centrifugar los tubos 30 segundos a 3500 rpm. En esta fase se establece la compatibilidad al sistema ABO, sin embargo, otros anticuerpos (ejemplo: auto-anti-i), pueden también ser detectados en esta fase. Leer y realizar las anotaciones. Fase II Después de la lectura anterior colocar todos los tubos a 37ºC por 30 minutos. Al concluir la incubación sacar los tubos del baño y centrifugar por 30 segundos a 3000 rpm. Leer y hacer las anotaciones correspondientes. Realizar tres lavados con solución salina fisiológica. Secar la ultima gota de salina. Fase III o antiglobulina: Añadir 100ul del reactivo de antiglobulina humana poliespecífico. Mezclar y centrifugue 30 segundos a 3000 rpm. Leer y realizar anotaciones. Las reacciones con resultado negativo confirmar con las células control. Simultáneamente debe montar el estudio de anticuerpo para cada uno de los pacientes de acuerdo a lo detallado en el procedimiento 3. Durante el período de incubación realizar las determinaciones de grupo sanguíneo eritrocitario a cada una de las suspensiones de los pacientes y donantes. Recomendaciones: Los resultados de las pruebas deberán ser leídos contra luz blanca. Se puede utilizar espejos magnificadores, lentes y microscopios que ayuden con la lectura de las pruebas. El botón de las células se resuspenderá, se hará la lectura y se asignará los puntajes en cruces en la hoja de trabajo. En caso de resultados incompatibles deberán ser investigados en busca de su causa. Procedimiento 5 Identificación de Anticuerpos Principio Una vez que se ha detectado la existencia de un anticuerpo irregular, através de un estudio de anticuerpos positivo, se debe identificar su especificidad y definir su

13 importancia clínica. Los paneles de identificación están compuestos por juegos de 11 o más tipos diferentes de células del grupo O, con fenotipo conocido de los principales antígenos de grupo sanguíneo, a saber: D, C,E, c, e y usualmente f, Cw M, N, S, s Fya, Fyb Jka, Jkb K, k y usualmente Kpa, Kpb, Jsa, Jsb Lua, Lub Lea, Leb P1 Xga Otros antígenos de fenotipo poco frecuente, pueden ser incluidos dentro del panel e incluso pueden estar incluidos dependiendo de la zona geográfica, donde se encuentre la investigación. Lo anterior de acuerdo a la disponibilidad de células por parte del fabricante. El panel de identificación dispone de una tabla antigénica de reacción, donde se indica la positividad de los diferentes antígenos en relación a la célula que se está analizando, así como el lote del reactivo, fecha de vencimiento y un lugar destinado para hacer las anotaciones de los resultados obtenidos y sus interpretaciones. Para el estudio de anticuerpos es importante tener presente las características de los anticuerpos como son: - rango térmico, - respuesta a la reacción de la enzima, - fuerza de reacción, (tanto aglutinación como hemólisis). - Resultado del autocontrol para la detección de autoanticuerpos. Cuando el patrón de aglutinación del panel muestra diferencias, se sospecha de mezcla de anticuerpos. La aplicación de técnicas enzimáticas o de reactivos especiales, permite separar los anticuerpos, en base a sus características de los antígenos respectivos, de tal manera que permitan separarlos y diferenciarlos con mayor claridad. Dentro de estas técnicas se deben considerar para separar las mezclas de anticuerpos se pueden mencionar: absorción/elución variación de temperaturas de reacción uso de medios como el polietileno glicol y enzimas los medios reductores. Características de los anticuerpos en las fases de reacción: Fase de Centrifugación Inmediata: A 22ºC reaccionan mejor los anticuerpos del tipo IgM como el M, N, Lewis, y el P. El anti I tiene un rango térmico desde 4ºC hasta fase de antiglobulina, sin embargo, su temperatura óptima es de 4ºC. INCUBACION A 37ºC: En este grupo se incluyen los anticuerpos del tipo IgG que tiene la capacidad de aglutinar sin llegar a la fase de antiglobulina humana. Se pueden mencionar los anti D, C, c, E, e, que reaccionan óptimamente al ser incubados por 30 minutos.

14 FASE DE ANTIGLOBULINA HUMANA: En esta fase se incluyen todos los anticuerpos tipo IgG no aglutinantes como el anti Duffy, Kidd, Lutheran, S, s, Kell y Cellano. EQUIPOS Y REACTIVOS: Solución salina fisiológica Panel de identificación Panel de identificación tratado con enzima Tubos 12 x 75mm para reacción. Centrífugas serológicas. Papel toalla. Pipetas Pasteur. Bulbos para pipetas Pasteur. Tubos rotulados como muestra 1 con de suero/plasma a identificar. Tubos rotulados como muestra 2 con de suero/plasma a identificar. Método: Panel de identificación Mezclar con suavidad y homogenizar el juego de reactivos del panel de identificación según corresponda. Rotular un juego de 11 tubos con el número y la muestra a analizar. Añadir 50ul de las células reactivo correspondiente 1 al tubo rotulado como células 1. y así sucesivamente hasta completar los 11 tubos. Añadir 100ul del suero o plasma a estudiar a los 11 tubos. A todos los tubos añadir 100ul del reactivo de albúmina bovina al 22%. Mezclar y a partir de este momento se inicia con las tres fases de la prueba de antiglobulina humana indirecta. Anotar los resultados obtenidos en la tabla antigénica que corresponde al lote del panel. Identificar según perfil antigénico obtenido el antígeno contra el cual va dirigido el anticuerpo en estudio. Procedimiento 6 Técnica de adsorción de anticuerpos Principio En inmunohematología se habla de adsorción cuando se utilizan células con fenotipo conocido para provocar que el anticuerpo correspondiente, se pegue a la superficie del glóbulo rojo. A partir de un proceso de adsorción se pueden separar a nivel de laboratorio dos o más anticuerpos mezclados en un suero. Como primer punto para seleccionar las células a utilizar en la absorción, se deben interpretar las reacciones obtenidas en el panel de identificación y establecer cuáles anticuerpos pueden estar involucrados. Seguidamente se debe buscar células cuyo fenotipo posea sólo uno de los antígenos que se sospecha. Una vez seleccionada la célula, se toma partes iguales de células y plasma y se realiza el proceso de adsorción, bajo las condiciones óptimas del anticuerpo en estudio. La parte final del proceso establece una centrifugación, que sirve para separar

15 los glóbulos rojos sensibilizados del plasma y así obtener los dos anticuerpos separados. EQUIPOS Y REACTIVOS: Solución salina fisiológica Panel de identificación Panel de identificación tratado con enzima Tubos 12 x 75mm para reacción. Centrífugas serológicas. Papel toalla. Pipetas Pasteur. Bulbos para pipetas Pasteur. Tubos rotulados como muestra 1 con de suero/plasma a identificar. Tubos rotulados como muestra 2 con de suero/plasma a identificar. Tubos con eritrocitos a analizar Baños a 37ºC Tubos 13 X 100 mm. Tapones rojos. Pipetas 10 ml. Pipeteadores. Método: - Seleccionar los glóbulos rojos adecuada para adsorción y tomar estérilmente una alícuota de unos 10 ml. - Lavar tres veces el paquete con solución salina fisiológica. - Dejar el paquete el máximo posible sin salina después del último lavado. - Agregar igual cantidad del suero en estudio. - Incubar a 37ºC por 30 minutos. - Mezclar cada 10 minutos para ayudar al proceso de adsorción. - Tomar una muestra de eritrocitos y realizar una prueba de antiglobulina humana directa. - Mantener en incubación a 37ºC, hasta que se alcance el máximo de positividad de antiglobulina humana directa, idealmente debe tener una aglutinación de 3 a 4 cruces. - Centrifugar 10 minutos a 2000 r.p.m, para separar el suero adsorbido y los eritrocitos sensibilizados. - Rotular un tubo con los datos necesarios y transferir el suero del tubo centrifugado. - Al suero realizar el panel de identificación de anticuerpos. - Al paquete globular realizar procedimiento de elución. Procedimiento 7 Técnica de Elución de Anticuerpos Principio El término elución significa en Inmunohematología liberar los anticuerpos unidos a la membrana del glóbulo rojo proveniente de un proceso de adsorción. Dependiendo de las necesidades y protocolos de trabajo del Banco de Sangre se puede: Separar el anticuerpo conservando la integridad de la membrana del glóbulo rojo. Separar el anticuerpo rompiendo las membranas del eritrocito mediante

16 agentes químicos como el éter, cloroformo, digitonina o mediante condiciones físicas extremas como la congelación o el calor. Una vez liberado el anticuerpo el eluato, se procede a determinar su especificidad a través del panel de identificación de anticuerpos. EQUIPOS Y REACTIVOS: Solución salina fisiológica Panel de identificación Panel de identificación tratado con enzima Tubos 12 x 75mm para reacción. Centrífugas serológicas. Papel toalla. Pipetas Pasteur. Bulbos para pipetas Pasteur. Tubos rotulados como muestra 1 con de plasma a identificar. Tubos rotulados como muestra 2 con de eluato a identificar. Tubos con eritrocitos a analizar Frascos con cloroformo. Baños a 37ºC. Tubos 13 X 100 mm. Tapones rojos. Pipetas 10 ml. Pipeteadores. Método: Técnica de elución con cloroformo - Tomar el paquete de glóbulos rojos sensibilidados después del proceso de adsorción. - Lavar tres veces con solución salina. - A un volumen igual de células lavadas agregar un volumen de cloroformo. - Tapar el tubo y agitar fuertemente por 1 minuto. Con cuidado de que el contenido del tubo sea expulsado sobre algún compañero. - Centrifugar 10 minutos a 2000 r.p.m, - El tubo queda dividido en tres capas, una del cloroformo (trasparente), otra de restos de membrana (turbia) y un eluato o hemolizado (rojo traslúcido) donde se encuentra el anticuerpo separado. - Transferir el eluato a otro tubo y realizar un panel de identificación de anticuerpos. Recomendaciones: Para encontrar la especificidad del anticuerpo los resultados positivos por aglutinación así como los negativos deben ser comparados con la tabla antigénica del panel en su lote respectivo. Para trabajar procedimientos de adsorción/elución siempre tomar en consideración la temperatura óptima de reacción. Esta va a ser la temperatura donde ocurrió la aglutinación más fuerte. Procedimiento 8 Incompatibilidad materno- fetal Principio La enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN) es una enfermedad, en la cual la

17 madre en gestación transfiere aloanticuerpos del tipo IgG, via placentaria, contra antígenos de glóbulo rojo del feto. Debido a esta sensibilización, los glóbulos rojos fetales sufren una destrucción acelerada tanto antes como después del nacimiento. Para los recién nacidos que padecen la enfermedad hemolítica, la elevación de los niveles de bilirrubina se convierte en un problema clínico grave, la pérdida de la capacidad de transporte de oxígeno, así como resultado de la hemólisis, los niveles altos de bilirrubina indirecta que pueden depositarse a nivel del sistema nervioso central. Los antígenos localizados en la membrana de los eritrocitos, se desarrollan en diferentes etapas de la vida intrauterina o postnatal. Los antígenos contra el sistema de grupo sanguíneo Rh, Kell, MNSs, Duffy por mencionar algunos, presentan desde el primer de gestación una potencia antigénica similar a la observada en los eritrocitos de una persona adulta. Otros, por el contrario, se encuentran poco desarrollados, de ahí que su expresión antigénica sea menor que los antígenos de un eritrocito de una persona adulta, ejemplos de estos antígenos pueden ser los sistemas ABO, P1 y Lutheran. Estos antígenos están muy pobremente expresados al nacimiento y es hasta después del primer año de vida cuando logran expresarse completamente. En estos casos la debilidad o ausencia antigénica en el eritrocito del feto, impide que se inicie o exprese la enfermedad, por lo anterior se puede tener la incompatibilidad eritrocitaria, sin embargo, no una enfermedad hemolítica. Las acciones básicas en el estudio de la EHRN, se ajustan a las circunstancias en que se ubica el médico y el paciente. Una manera de estudiar los casos es dividiendo a los sujetos de estudio en tres grupos: el feto o neonato, la madre y el padre. Al feto o neonato se le debe realizar al menos las siguientes pruebas para su estudio: Grupo ABO/Rh, prueba de antiglobulina directa, fenotipo eritrocitario, (previo elución de anticuerpos) rastreo de anticuerpos con las células pantallas y con células A1 y B. Que se busca con estos análisis? Demostrar la presencia del antígeno en los glóbulos rojos del feto/neonato. Demostrar la presencia del anticuerpo en el suero o glóbulo del feto neonato. Análisis en la madre: Determinar grupo ABO/Rh. Realizar estudio de anticuerpos. Fenotipo Análisis al padre: Determinar grupo ABO/Rh. Determinar el fenotipo eritrocitario. La enfermedad hemolítica del recién nacido, desde el punto de vista inmunohematológico, se puede clasificar en tres categorías principales dependiendo de la especificidad del anticuerpo sensibilizante: Enfermedad Hemolítica por ABO, principalmente por un anti-a,b en mujeres del grupo O. Enfermedad Hemolítica por Rh, debida al anti-d. Enfermedad Hemolítica por otros anticuerpos irregulares. Transfusión intrauterina y del neonato

18 La sangre para transfusión intrauterina debe ser seleccionada compatible con los anticuerpos maternos capaces de cruzar la placenta. Se utilizará el suero de la madre para la pruebas pretransfusionales. Los glóbulos rojos empacados seleccionados para la transfusión intrauterina deberán ser de preferencia O, el Rh que se escoja va a depender si conocemos el fenotipo del feto, en caso de no saberlo se utilizará Rh negativo. Para las unidades de exanguíneotransfusión deberán ser compatibles con el plasma materno. Todas las unidades seleccionadas para estos procedimientos, deberán ser del grupo sanguíneo O, filtradas, irradiadas, de menos de 5 días de recolectada y en el caso para las exanguíneotransfusión el plasma para su reconstitución deberá ser del mismo grupo ABO del recién nacido. Materiales y Reactivos: Tubos 12 x 75 mm de reacción. Pipetas Pasteur. Bulbos pipetas. Muestras de suero y eritrocitos a analizar Solución salina fisiológica. Juego de reactivos anti A, anti B, anti AB, anti D, albúmina bovina al 22%, reactivo de antiglobulina hunana. Panel de identificación de anticuerpos. Frascos con células control de AGH. Juego de células rastreadoras 3%. Baños maría a 37 C. Centrífugas serológicas. Gradillas de madera. Gradillas de metálicas. Microscopios. Papel toalla. Método: Realizar a la muestra de sangre rotulada como niño una prueba de inmunoglobulina directa. Determinar el grupo sanguíneo ABO/Rh del niño. Realizar a la muestra de plasma de la madre un rastreo e identificación de anticuerpos. Realizar una prueba cruzada entre los eritrocitos del niño y el plasma del donador. Procedimiento 9 Anemia Hemolítica Autoinmune Principio La anemia hemolítica inmune se define como un acortamiento en la sobrevida del glóbulo rojo debido a una desregulación del sistema inmune, específicamente generado por autoanticuerpos. Las anemias hemolíticas autoinmune se clasifican en: Anemia Hemolítica Autoinmune por anticuerpos calientes Síndrome de aglutininas frías Hemoglobunuria paroxística al frío

19 Anemia Hemolítica Autoinmune Combinada (Anticuerpos fríos y calientes) Anemia Hemolítica Inmune inducida por drogas Cada una de estas se subclasifica en: primaria o secundaria. La Anemia Hemolítica Autoinmune es designada como primaria si se considera como una entidad idiopática, es decir, si no está asociada con alguna enfermedad demostrable que la desencadene. En contraste, la secundaria está asociada con un desorden primario y con razones suficientes para sospechar que su asociación es más que meramente fortuita. Estos desordenes son diagnosticados en base a las características serológicas de reacción. La mayoría de los casos de AHAI son causados por autoanticuerpos cuya reacción es en caliente, es decir, anticuerpos cuya reactividad optima con los glóbulos rojos humanos es a 37ºC y que por lo general es una inmunoglobulina de la clase IgG. El Síndrome de Aglutininas frías es generalmente causado por un autoanticuerpo de la clase IgM y que exhibe una reactividad máxima a 4ºC. El anticuerpo causante de la Hemoglobinuria Paroxística Nocturna es una inmunoglobulina IgG bifásica que difiere en su modo de acción. Este anticuerpo se detecta in vitro por su habilidad de causar hemólisis de los glóbulos rojos normales en un procedimiento que lleva dos pasos, una incubación en frío seguido por una incubación a 37ºC en presencia del complemento. Finalmente, la ingesta de ciertos medicamentos pueden causar anemia hemolítica pero aquí el anticuerpo siempre posee una especificidad por la droga o sus metabolitos. Reactivos y materiales: Tubos 12 x 75 mm de reacción Pipetas Pasteur. Bulbos pipetas. Muestras de suero y eritrocitos a analizar Solución salina. Reactivo de antiglobulina humana poliespecífico. Reactivo de antiglobulina humana monoespecífico IgG. Reactivo de antiglobulina humana monoespecífico C3 Panel de identificación eritrocitos. Frascos con células control de AGH. Juego de células rastreadoras 3%. Baños maría a 37 C. Centrífugas serológicas. Gradillas de madera. Gradillas de metálicas. Microscopios. Papel toalla.

20 Método: De la muestra en estudio: Hacer una suspensión de trabajo entre el 3-5% y: Realizar una prueba de antiglobulina humana directa utilizando el reactivo poliespecífico, monoespecífica IgG, monoespecífico C3. -Realizar un rastreo e identificación de anticuerpos. Al igual que un eluido de los eritrocitos con prueba directa de antiglobulina para realizar las conclusiones.