ESTUDIO FITOQUÍMICO DE HOJAS DE LA ESPECIE Cavendishia compacta (ERICACEAE) Y EVALUACIÓN DE SU ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA

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1 ESTUDI FITQUÍMIC DE JAS DE LA ESPECIE Cavendishia compacta (ERICACEAE) Y EVALUACIÓN DE SU ACTIVIDAD ANTIINFLAMATRIA LAURA XIMENA DIAZ BARRERA SRANLLY PALA VASC ZAMUDI UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISC JSÉ DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN PRYECT CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA BGTÁ, D.C I

2 ESTUDI FITQUÍMIC DE JAS DE LA ESPECIE Cavendishia compacta (ERICACEAE) Y EVALUACIÓN DE SU ACTIVIDAD ANTIINFLAMATRIA LAURA XIMENA DIAZ BARRERA SRANLLY PALA VASC ZAMUDI TRABAJ DE GRAD PARA PTAR AL TITUL DE LICENCIAD EN QUÍMICA DIRECTR: WILLIAM FERNAND CASTRILLÓN CARDNA QUÍMIC, ESPECIALISTA EN EDUMATICA, MAGISTER EN CIENCIAS AMBIENTALES CDIRECTR: JAVIER ANDRÉS MATULEVICH PELÁEZ LICENCIAD EN QUÍMICA, ESPECIALISTA EN ANÁLISIS QUÍMIC INSTRUMENTAL, MAGISTER EN CIENCIAS BILGICAS CN ÉNFASIS EN FITQUÍMICA UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISC JSÉ DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN PRYECT CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA BGTÁ D.C II

3 TABLA DE CNTENID RESUMEN... 1 ABSTRACT... 3 INTRDUCCIÓN JUSTIFICACIÓN Problema de Investigación BJETIVS bjetivo General bjetivos Específicos MARC DE REFERENCIA Familia Ericaceae Características morfológicas de la familia ERICACEAE Distribución de la familia ERICACEAE Usos etnobotánicos de la familia ERICACEAE Química de la Familia ERICACEAE Género Cavendishia Características morfológicas del género Cavendishia Distribución y hábitat del género Cavendishia Etnobotánica del género Cavendishia Fitoquímica del género Cavendishia Especie Cavendishia compacta Características morfológicas de la especie Cavendishia compacta Distribución y hábitat de la Cavendishia compacta Etnobotánica de la especie Cavendishia compacta Estudios químicos y biológicos de la especie Cavendishia compacta Actividad Antiinflamatoria Generalidades Modelos de evaluación in vivo de la actividad antiinflamatoria METDLGÍA Generalidades Métodos de Separación Cromatográfica Técnicas para la Elucidación Estructural y Caracterización de los Compuestos Aislados Estudio Fitoquímico de Hojas de Cavendishia compacta Recolección y Selección del Material Vegetal Preparación de Extractos y Fracciones Extracción y Caracterización Química de los Aceites Esenciales Evaluación de la Actividad Antiinflamatoria RESULTADS Y ANÁLISIS III

4 5.1. Estudio Fitoquímico Preliminar Metabolitos Secundarios Aislados Composición de la Mezcla CcH Composición de la Mezcla CcH Composición de la Mezcla CcH Elucidación Estructural del Compuesto CcH Elucidación Estructural del Compuesto CcH Composición Química del Aceite Esencial de Hojas de Cavendishia compacta Actividad Antiinflamatoria Análisis Estadístico de los Datos btenidos en el Bioensayo Análisis Gráfico del Promedio de los Deltas de Peso y de los Porcentajes de Inhibición de Inflamación CNCLUSINES RECMENDACINES REFERENCIAS BIBLIGRÁFICAS IV

5 ÍNDICE DE ECUACINES Ecuación 4-1. Cálculo de IR Ecuación 4-2. Cálculo del peso entre la oreja tratada y no tratada Ecuación 4-3. Cálculo del porcentaje de Inhibición V

6 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 3-1. Ericaceae - Gaultheria bracteata - Gaultheria erecta - Gaultheria longiflora Figura 3-2. Mapa de distribución Mundial de la Familia Ericaceae. La zona amarilla representa la distribución mundial de la familia Figura 3-3. A- Distribución de Ericaceae en América Latina y números de los géneros y especies para cada país. B- Centros de diversidad de la Ericaceae en América Latina Figura 3-4. Cavendishia aberrans Figura 3-5. Mapa de distribución del género Cavendishia en Centro y Sur América. La zona amarilla representa la distribución Figura 3-6. Mapa de distribución del género Cavendishia en Colombia. Los puntos rojos indican la distribución del género Figura 3-7. Cavendishia compacta Figura 3-8. Mapa de la distribución de la Cavendishia compacta. Los puntos negros indican la distribución de la especie Figura 4-1. Mapa de localización del área de recolección de la especie. Santander, Municipio Charalá, Corregimiento Virolin, camino lival Figura 4-2. Marcha Fitoquímica Preliminar Figura 4-3. Porcentaje de Rendimiento de las fracciones obtenidas a partir del E.EtH.H Figura 4-4. Fracciones y Mezclas obtenidas a partir de la Fracción de Hexano Figura 4-5. Fracciones y Compuestos obtenidos a partir de la Fracción de Diclorometano Figura 4-6. Fracciones y Compuestos obtenidos a partir de la Fracción de Acetato de Etilo Figura 5-1. Corriente iónica total (TIC) obtenida para la mezcla CcH Figura 5-2. Espectro de masas en modo ionización electrónica para el Rimueno. 52 Figura 5-3. Espectro de masas de la librería NIST 08 para el Rimueno Figura 5-4. Esquema de fragmentación para el Rimueno propuesto por los autores Figura 5-5. Espectro de masas en modo ionización electrónica para el Biformeno Figura 5-6. Espectro de masas de la librería NIST 08 para el Biformeno Figura 5-7. Esquema de fragmentación para el Biformeno propuesto por los autores Figura 5-8. Espectro de masas en modo ionización electrónica para el Kaurano. 56 Figura 5-9. Espectro de masas de la librería NIST 08 para el Kaurano Figura Esquema de fragmentación del Kaurano VI

7 Figura Corriente iónica total (TIC) obtenida para la mezcla CcH Figura Espectro de masas en modo ionización electrónica para el Benzaldehído Figura Espectro de masas de la librería NIST08 para el Benzaldehído Figura Esquema de fragmentación para el Benzaldehído Figura Espectro de masas en modo ionización electrónica para el Acetofenona Figura Espectro de masas de la librería NIST 08 para el Acetofenona Figura Esquema de fragmentación para Acetofenona Figura Corriente iónica total (TIC) obtenida para la mezcla CcH Figura Espectro de masas en modo ionización electrónica para α- amirina. 63 Figura Espectro de masas de la librería NIST 08 para la α- amirina Figura Espectro de masas en modo ionización electrónica para β- amirina. 63 Figura Espectro de masas de la librería NIST 08 para la β- amirina Figura Esquema de fragmentación de α y β amirina Figura Espectro de masas en modo ionización electrónica para el compuesto CcH Figura Mecanismo de fragmentación para la Morina Figura Espectro RMN 1 H (300 MHz, CDCl3) del compuesto CcH Figura Asignación de H en la estructura química de la Morina Figura Espectro de masas en modo ionización electrónica para el compuesto CcH Figura Mecanismo de fragmentación para la Miricetina Figura Espectro RMN 1 H (300 MHz, CDCl3) del compuesto CcH Figura Asignación de H en la estructura química de la Miricetina Figura Gráfica de interacciones de los componentes de los aceites esenciales de siete especies de la Familia Ericaceae Figura Gráfica de Normalidad para la población de datos Figura Prueba de Levene para comprobar la Homogeneidad de Varianzas 79 Figura Análisis de Varianza de un solo factor para los Tratamientos Figura Prueba de Dunnett para comparación múltiple Figura Método de Dunnett Figura Gráfico de medias por la prueba de Dunnett Figura Promedios de Porcentajes de Inhibición de Inflamación para los Tratamientos y la Indometacina VII

8 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 3-1. Usos tradicionales de algunas especies del género Vaccinium spp Tabla 3-2. Usos tradicionales, farmacología y actividad biológica de algunas especie del genero Rhododendron Tabla 3-3. Actividades biológicas de la familia ERICACEAE Tabla 3-4. Distribución y usos de especies del género Cavendishia en Colombia Tabla 5-1. Resultados del análisis fitoquímico preliminar Tabla 5-2. Tiempo de retención y resultados de la comparación con la librería NIST 08 para la mezcla CcH Tabla 5-3. Tiempo de retención y resultados de la comparación con la librería NIST 08 para la mezcla CcH Tabla 5-4. Tiempo de retención y resultados de la comparación con la librería NIST 08 para la mezcla CcH Tabla 5-5. Comparación de los desplazamientos químicos RMN 1 H del compuesto CcH4 con el de morina Tabla 5-6. Comparación de los desplazamientos químicos del compuesto CcH5 con los de miricetina Tabla 5-7. Compuestos volátiles de Cavendishia compacta Tabla 5-8. Comparación del porcentaje de área de los componentes de los aceites esenciales de siete especies de la Familia Ericaceae Tabla 5-9. Hipótesis planteadas para el análisis del porcentaje de área de los componentes de los aceites esenciales de siete especies de la Familia Ericaceae Tabla Análisis de varianza para el porcentaje de área de los componentes de los aceites esenciales de siete especies de la Familia Ericaceae Tabla Efectos del extracto y las fracciones evaluadas de Cavendishia compacta sobre el edema auricular inducido por TPA VIII

9 LISTA DE ABREVIATURAS CC Cromatografía en columna CCD Cromatografía en capa delgada CCDP Cromatografía en capa delgada preparativa CDCl3 Cloroformo deuterado CD3D Metanol deuterado CG-EM Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas E. EtH.H Extracto etanólico Hojas EM Espectroscopia de masas EtH Etanol F. AcEt. CcH Fracción acetato de etilo de hojas de Cavendishia compacta F. CH2Cl2.CcH Fracción diclorometano de hojas de Cavendishia compacta F. HEX.CcH Fracción de hexano de hojas de Cavendishia compacta IE Ionización electrónica IR Índice de retención PAC Proantocianidinas RDA Mecanismo retro Diels Alder R.H.CcH Residuo hidroalcoholico de hojas de Cavendishia compacta RMN Resonancia magnética nuclear RMN 1 H Resonancia magnética nuclear protónica TIC Corriente iónica total TMS Tetrametilsilano TPA 13-acetato de 12-tetradecanoilforbol IX

10 RESUMEN El presente trabajo describe los resultados del estudio fitoquímico realizado con el extracto etanólico de hojas de la especie vegetal Cavendishia compacta clasificada bajo el número de colección CL en el Herbario Nacional Colombiano con el propósito de contribuir en las investigaciones realizadas en la familia Ericaceae y en el género Cavendishia, ya que, este no presenta reportes de estudios fitoquímicos. La separación de los extractos y fracciones por cromatografías en columna (CC), en capa delgada (CCD) y cromatografía en capa delgada preparativa (CCDP), permitieron obtener una mezcla de compuestos de tipo diterpeno conformada por kaurano, rimuneno y biformeno (9,2mg), una mezcla de compuestos aromáticos constituidos por acetofenona y benzaldehído (21,6mg), una mezcla de compuestos de tipo triterpeno constituida por α-amirina y β-amirina (30mg) y el aislamiento de dos flavonoides: morina (87mg) y miricetina (160mg). La elucidación estructural de las mezclas y de los compuestos aislados se llevó a cabo mediante las técnicas de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM) y resonancia magnética nuclear (RMN) de 1 H. A partir de hojas frescas de la especie vegetal se obtuvo el aceite esencial de Cavendishia compacta con un rendimiento del 0.27% (m/v) por arrastre con vapor de agua. Su caracterización se realizó por (CG-EM), la identificación se realizó a través de la comparación de los índices de retención (IR) y los espectros de masas de la librería NIST 08. Se identificaron 22 componentes los cuales constituyen el 77% de la composición relativa total del aceite, siendo el cariofileno el sesquiterpeno con mayor porcentaje. La actividad antiinflamatoria se evaluó para el E.EtH.H, F.HEX.CcH, F.CH2Cl2.CcH y F.AcEt.CcH, utilizando el modelo de edema auricular inducido por 13-acetato de 12- tetradecanoilforbol (TPA), siendo el E.EtH.H y la fracción F.CH2Cl2.CcH que contiene la mezcla de terpenos y flavonoides, los que 1

11 presentaron un efecto antiinflamatorio moderado de 49,3% y 39,8% respectivamente. PALABRAS CLAVE: actividad antiinflamatoria, Cavendishia compacta, metabolitos fijos, metabolitos volátiles. 2

12 ABSTRACT This paper describes the results of the phytochemical study of the ethanolic extract of leaves of the specie classified as Cavendishia compacta under number CL at the National Colombian Herbarium, in order to contribute to research phytochemical in the Ericaceae family and gender, because this gender does not report phytochemical studies. The methods used to get the extracts and fractions were: Column Chromatography (CC), Thin Layer Chromatography (TLC) and Preparative Thin Layer (PTLC), yielded a mixture type diterpene of compounds formed by rimueno, biformeno and kaurano (9,2 mg), a mixture of aromatic compounds consisting of benzaldehyde and acetophenone (21,6 mg), a mixture of compounds consisting of type triterpene α-amyrin and β-amyrin (30 mg) and the isolation of two flavonoids: morin (87 mg) and myricetin (160 mg). The structural elucidation of mixtures and isolated compounds were carried out using techniques GC-MS and 1 H NMR. From fresh leaves of the specie Cavendishia compacta was obtained essential oil with a yield of 0.27% (m/v) by stripping with water vapor. Its characterization was performed (GC-MS), identification is performed by comparing retention indices (IR) and Mass Spectra Library (NIST 08). 22 components were identified which constitute 77% of the total oil composition on being the sesquiterpene caryophyllene the highest percentage. The anti-inflammatory activity was evaluated for E.EtH.H, F.HEX.CcH, F.CH2Cl2.CcH and F.AcEt.CcH, using the model of ear edema induced by Tetradecanoylphorbol acetate (TPA), being the E.EtH.H and F.CH2Cl2.CcH containing the mixture of terpenes and flavonoids, which showed moderate antiinflammatory effect of 49.3% and 39.8% respectively. KEYWRDS: anti-inflammatory activity, Cavendishia compacta, fixed metabolites, volatile metabolites. 3

13 INTRDUCCIÓN El hombre en su búsqueda de reconocer, utilizar y explicar lo que le rodea ha sido capaz de interactuar con los recursos naturales a través de la historia en actividades como: la agricultura, la medicina tradicional y la minería entre otras. Un aspecto metabólico que distingue al reino vegetal del animal es la capacidad para producir sustancias que no son esenciales para su supervivencia, estas sustancias se les conoce como metabolitos secundarios. La obtención de metabolitos secundarios en las plantas es uno de los temas de mayor interés en la actualidad, ya que, al buscar y reconocer de donde provienen los diferentes mecanismos de producción y utilización de los mismos en procesos que permiten el crecimiento, alimentación, defensa e interacción con el medio ha permitido el uso de estos, en reemplazo de productos sintéticos generando un desarrollo en el conocimiento en pro de ciencias como: la química, la biología y la medicina. En países como Colombia, poseedores de una alta biodiversidad, resulta especialmente importante el estudio de las plantas, extractos o sustancias puras que presentan significativa actividad terapéutica. Dentro de las múltiples estrategias que se pueden utilizar para la selección de especies vegetales como fuentes de principios activos; diversas investigaciones han identificado el potencial biológico de diferentes compuestos como flavonoides, taninos, esteroides, naftoquinonas y sesquiterpenoides presentes en la familia Ericaceae; de allí la importancia de realizar un estudio químico y biológico en la especie del género Cavendishia ya que esta investigación contribuye de manera significativa en el campo de la fitoquímica y los productos naturales. 4

14 1. JUSTIFICACIÓN La especie vegetal en estudio fue seleccionada teniendo en cuenta tres factores importantes: su distribución en Colombia, la quimiotaxonomía y el interés en la posible actividad antiinflamatoria. La familia Ericaceae contiene cerca de ciento veinte seis (126) géneros y cuatro mil cien (4.100) especies, siendo los géneros más diversos Rhododendron, Érica, Vaccinium, Cavendishia y Gaultheria. Por otra parte, tiene amplia distribución geográfica pues abarca todos los continentes a excepción de la Antártida (Luteyn, 2002). Colombia, al encontrarse en la zona Neotropical es un país con una privilegiada ubicación geográfica y cuenta con abundantes recursos entre los cuales sobresale: una de las floras más diversas del planeta, la presencia del mar Caribe y del océano Pacífico, una gran variedad de climas y la presencia de la cordillera en la región andina, pero a pesar de esta enorme riqueza no son numerosos los estudios acerca de la flora en Colombia y muy pocas familias florísticas han sido investigadas en el campo de la fitoquímica, como es el caso de la familia Ericaceae, específicamente de la especie Cavendishia compacta. Colombia es el país con mayor diversidad de Ericáceas, con veinte cuatro (24) géneros y cerca de doscientas sesenta y siete (267) especies, particularmente los bosques montañosos de la vertiente pacífica de la cordillera ccidental colombiana albergan la mayor riqueza de especies (Luteyn, 2002). Entre los estudios más importantes acerca de la fitoquímica de la familia de las Ericáceas se encuentran como componentes principales a los flavonoides, entre estos los más reportados son los pigmentos tipo antocianinas: cianidina, delfinina, malvidina, petunidina y peonidina; el hiperósido y la epi-catequina y proantocianidinas principalmente en el fruto. Para el género Vaccinium varios pigmentos y otros flavonoides coinciden en gran número de especies, lo cual es consistente con criterios quimiotaxonómicos. 5

15 Los compuestos polifenólicos han sido los más estudiados desde el punto de vista farmacológico en varias de estas especies, por causa de sus efectos antioxidantes y antimicrobianos en las infecciones urinarias, fundamentalmente del fruto de V. mirtillus y del V. macrocarpon, cuyas proantocianidinas han demostrado ser las encargadas de interferir en la adhesión fimbrial de la E. coli uropatógena. La naturaleza de los metabolitos descritos para el género está en correspondencia con la familia de estudio según las bases de datos consultadas, los usos tradicionales referidos en muchos casos como: afecciones del sistema urinario, astringente, antiescorbútico, desinfectante; y efectos biológicos comprobados como: antimicrobiano, antioxidante y antiinflamatorio (Abreu, 2008). Terpenos y compuestos relacionados, al igual que los flavonoides, son algunas de las clases de metabolitos ampliamente distribuidos en la familia de estudio y para el género Cavendishia en particular; los cuales poseen una gran variedad de efectos biológicos entre los que sobresale la actividad antiinflamatoria (Gomez, 2011). La actividad antiinflamatoria ha despertado en los últimos años un gran interés científico en el área farmacológica, principalmente en virtud de la capacidad potencial de ciertos compuestos de interferir en la evolución de enfermedades que cursan con procesos inflamatorios. Ahora bien, dentro del contexto de los productos naturales antiinflamatorios, la medicina tradicional se ha utilizado para tratar y cuidar a pacientes con enfermedades que conllevan a procesos inflamatorios. En este sentido, la medicina tradicional en la actualidad, es ampliamente usada en el mundo. Teniendo en cuenta lo descrito anteriormente, se hace necesario realizar un estudio químico de las hojas de Cavendishia compacta que aporte al conocimiento químico de este género en nuestro país y además, evaluar su actividad antiinflamatoria, ya que especies de la familia Ericaceae se caracterizan por presentar metabolitos secundarios como terpenos y flavonoides a los cuales se les han atribuido especiales actividades biológicas Problema de Investigación El presente proyecto se desarrolló en el grupo de investigación de productos naturales vegetales de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas con el 6

16 título: ESTUDI FITQUÍMIC DE JAS DE LA ESPECIE Cavendishia compacta (ERICACEAE) Y EVALUACIÓN DE SU ACTIVIDAD ANTIINFLAMATRIA con el cual, se realizó un análisis de los metabolitos secundarios fijos y volátiles presentes en las hojas de la especie Cavendishia compacta y una evaluación de su actividad antiinflamatoria; a fin de establecer posibles marcadores quimiotaxonómicos para la familia Ericaceae. Con respeto a lo anterior se establece la siguiente pregunta de investigación: Cuáles metabolitos secundarios se encuentran en las hojas de la especie Cavendishia compacta y pueden estos presentar actividad antiinflamatoria? 7

17 2. BJETIVS 2.1. bjetivo General Contribuir en el estudio químico y biológico de las hojas de la especie vegetal Cavendishia compacta y evaluar su actividad antiinflamatoria bjetivos Específicos Aislar, purificar y determinar la estructura química de los metabolitos secundarios mayoritarios presentes en los extractos o fracciones de las hojas de la especie Cavendishia compacta. Determinar la composición química de los aceites esenciales extraídos de hojas de la especie Cavendishia compacta por medio de la técnica de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM). Evaluar la actividad antiinflamatoria de las fracciones, extractos y compuestos mayoritarios aislados de las hojas de Cavendishia compacta. 8

18 3. MARC DE REFERENCIA 3.1. Familia Ericaceae Características morfológicas de la familia ERICACEAE Las Ericáceas son una familia de plantas leñosas que crecen principalmente como arbustos, son epifitas o terrestres, su tallo es cilíndrico raramente alado, sus hojas son simples, persistentes, revolutas o planas, sin estipulas y se disponen de forma polística; recién desarrolladas las hojas presentan un color rojo visible. En todas la Ericáceas el envés de las hojas tienen pelos gruesos, sin embargo, estos pelos en la mayoría de las especies están reducidos a pequeños puntos oscuros, considerando el envés de la hoja como glabro. El peciolo está desarrollado y puede ser terete, semirollizo, alado o acanalado. La lámina u hoja se inserta al pecíolo por su base y su forma generalmente varía entre elíptica, oblonga y ovada. Las Ericáceas se caracterizan por presentar hojas coriáceas o cartáceas, sus flores son pentámeras o tetrámeras, actinomorfas o ligeramente zigomorfas. Las inflorescencias son racimos simples y laxos, excepcionalmente en espigas. Son flores hermafroditas en su mayoría, sin olores florales, raramente con néctares extra florales. El fruto es una cápsula o baya esférica, cuyo color puede ser blanco o morado; sus semillas son numerosas bastante pequeñas elipsoidales a planas (Luteyn, 1996). Según el Instituto de Ecología y Ciencias Ambientales (2011) la familia Ericaceae pertenece al orden Ericales, algunas de las sinapomorfías o novedades evolutivas del orden son: nudos 1:1; hojas en espiral, dientes con una vena simple y una tapa opaca decidua. La Ericaceae es hermana de la familia Cyrillaceae, algunas de las características que presentan son: corola gamopétala y estigma húmedo como se puede observar en la Figura

19 Figura 3-1. Ericaceae - Gaultheria bracteata - Gaultheria erecta - Gaultheria longiflora Distribución de la familia ERICACEAE La familia Ericaceae comprende cerca de ciento veintiséis (126) géneros con aproximadamente cuatro mil cien (4.100) especies, son plantas cosmopolitas que habitan en regiones templadas y zonas de montaña con latitudes tropicales; como se puede observar en la Figura 3-2, la mayor diversidad se da en los Andes montañosos del Neotrópico y Nueva Guinea, donde existen cuarenta y seis (46) géneros y más de ochocientas (800) especies. Entre los géneros con mayor número de especies se encuentra: Cavendishia (150), Thibaudia (60), Psammisia (60), Vaccinium (48), Macleania (40), Gaylussacia (40), Gaultheria (37), Ceratostema (34), y Disterigma (32) (Luteyn, 2004). Las especies de la familia Ericaceae prefieren hábitats fríos, húmedos y de suelos ácidos. En América tropical, son más abundantes en hábitats de bosques montañosos, fríos, húmedos desde a m de altura. 1 Tomado de (Luteyn, 2004). 10

20 Figura 3-2. Mapa de distribución Mundial de la Familia Ericaceae. La zona amarilla representa la distribución mundial de la familia. 2 La familia Ericaceae es un elemento florístico sobresaliente de la vegetación en los bosques húmedos de las montañas Andinas de Latinoamérica. En el Neotrópico, la Ericaceae se concentran en el Noroeste de América del Sur, principalmente de Colombia, Ecuador, Perú y Venezuela. La distribución de la familia se concentra en cinco regiones biogeográficas que se muestran en la Figura 3-3, Colombia es uno de los países con mayor número de especies de Ericaceae, con aproximadamente doscientas sesenta y siete (267) especies, la región Neotrópica con mayor número de especies de Ericáceas es la vertiente pacifica del departamento de Nariño (Salinas, 2005). Figura 3-3. A- Distribución de Ericaceae en América Latina y números de los géneros y especies para cada país. B- Centros de diversidad de la Ericaceae en América Latina. 3 2 Tomado de (Garden, 1997). Editado por los Autores. 3 (Luteyn, 1989). Editado por los Autores. 11

21 Usos etnobotánicos de la familia ERICACEAE Se realizó una revisión bibliográfica de los usos etnobotánicos de especies de la familia Ericaceae por algunos países y continentes, teniendo en cuenta la distribución de esta familia en la zona Neotrópico, la cual comprende casi toda América del Sur, Centroamérica, Antillas, una parte de Estados Unidos y parte de México en las zonas montañosas de México y Centroamérica, a partir de Veracruz y Jalisco al sur de Quintana Roo, se encuentra la Agarista mexicana, en donde, el extracto acuoso de las hojas de esta planta conocida como Palo Santo se usa por vía oral para tratar la diabetes (Andrade- Cetto & Heinrich, 2005). En la actualidad, para el arándano perteneciente al género Vaccinium, se han reportado que existen 120 compuestos con más de 700 actividades biológicas y algunos usos tradicionales como: astringente, anti-infeccioso, diurético, diabetes y resfriadoslos cuales se emplean en más de una especie, incluso en diferentes latitudes (ver Tabla 3-1), esta coincidencia no es casual, junto a la apropiación cultural entre los pueblos de diferentes lugares, podría ser debido a factores taxonómicos, ya que la naturaleza de los metabolitos presentes en Vaccinium son similares en especies de este género (Abreu, 2014). Existen 40 compuestos con 130 efectos asociados con la actividad anticancerígena, 35 compuestos con 108 efectos asociados a la actividad antioxidante y 25 compuestos con 45 efectos asociados a la actividad antiinflamatoria (Cunningham, 2005). El V. myrtillus, es la especie más reconocida y estudiada en Asia, pero hay otras especies relacionadas a este género que presentan importantes aplicaciones en la medicina. Los frutos del V. myrtillus son comestibles y tienen un alto valor nutritivo. La planta tiene un uso medicinal en el tratamiento de varias enfermedades como la diabetes, algunas enfermedades oculares y trastornos vasculares. Los extractos tanto de las hojas y frutos han sido de gran importancia para la eliminación de radicales libres, altas propiedades antioxidantes y es un complemento importante para el rejuvenecimiento de la piel (Arora, 2013). 12

22 En Rusia, con las hojas de la V. vitis-idaea (arándano rojo) se preparan infusiones que se han utilizado en la medicina tradicional como astringente para tratamiento de enfermedades renales y de la vejiga; la gastroenteritis y como diurético para la lixiviación de cálculos renales y para el dolor de estómago, diarrea, la gota, la artritis y el reumatismo. También sus hojas se utilizan como antiinflamatorias en la medicina China para el tratamiento de infecciones del sistema respiratorio (Shikov, 2014). El zumo de arándano americano o cranberry (V. macrocarpon) ha sido utilizado para el tratamiento de infecciones del tracto urinario provocadas por baterías patógenas como la Escherichia coli., ayudando a mantener sano el tracto urinario. Investigaciones preliminares indican que el arándano americano desempeña un papel importante en el mantenimiento de la salud cardiovascular (Cunningham, 2005). También se encuentra en el mercado como suplemento dietético en EE. UU. Propiamente el fruto y los productos de V. macrocarpon han demostrado tener gran impacto en el mercado debido a su actividad biológica. Tabla 3-1. Usos tradicionales de algunas especies del género Vaccinium spp. 4 No. Especie Parte Metabolitos de la predominantes planta Uso tradicional bencenoides, flavonoides (cianidina, 1 V. alpinum fruto hiperósido, epicatequinas y alimento proantocianidinas) y fenilpropanoides. 2 V. angustifolium fruto hojas raíz flor alcanos, alquenos, alcanonas, bencenoides, flavonoides, monoterpenos 3 V. arboreum hojas flavonoides 4 V.caespitosum fruto raíz 5 V.bancanum raíz bencenoides, flavonoides (cianidina, hiperósido, epicatequinas y proantocianidinas) y fenilpropanoides. bencenoides, flavonoides (cianidina, hiperósido, epicatequinas y alimento saborizante, purifica la sangre, cólicos en bebes, induce el parto, locura diarrea, disentería, cataplasma, dolor de garganta, hinchazón, tónico alimento, fuente de vitamina C, utilizado como tabaco ayuda post-parto País U.S.A. Canada U.S.A. U.S.A. Canada U.S.A. Malasia 4 Tomado de (Abreu, 2008, 2014) 13

23 No. Especie Parte de la planta 6 V. berberidifolium hojas 7 V. bracteatum toda la planta 8 V.calycinum hojas 9 V.caespitosum fruto 10 V.corymbosum fruto 11 V. deliciosum fruto 12 V. dentatum hojas 13 V. floribundum fruto 14 V.globulare 15 V.keysseri hojas Metabolitos predominantes proantocianidinas) y fenilpropanoides. bencenoides, flavonoides (cianidina, hiperósido, epicatequinas y proantocianidinas) y fenilpropanoides. alcanos, alquenos, fenilpropanoides, flavonoides, monoterpenos y triterpenos bencenoides, flavonoides (cianidina, hiperósido, epicatequinas y proantocianidinas) y fenilpropanoides bencenoides, flavonoides (cianidina, hiperósido, epicatequinas y proantocianidinas) y fenilpropanoides alcanos, alquenos, alcanonas, bencenoides, fenilpropanoides, flavonoides, monoterpenos, sesquiterpenos y triterpenos. bencenoides, flavonoides (cianidina, hiperósido, epicatequinas y proantocianidinas) y fenilpropanoides. bencenoides, flavonoides (cianidina, hiperósido, epicatequinas y proantocianidinas) y fenilpropanoides. epicatequina, flavonoles (quercetina y glucósidos miricetina), compuestos fenólicos (cianidina y delfinidina) bencenoides, flavonoides (cianidina, hiperósido, epicatequinas y proantocianidinas) y fenilpropanoides. bencenoides, flavonoides (cianidina, hiperósido, epicatequinas y Uso tradicional Té Cáncer Té alimento alimento, condimento alimento Té alimento astringente diurético dolor de estomago artritis, corazón, riñón, reumatismo llagas internas País China U.S.A. Canada U.S.A. U.S.A. Canada Ecuador U.S.A. Papúa Nueva Guinea 14

24 No. Especie Parte de la planta Metabolitos predominantes proantocianidinas) y fenilpropanoides Uso tradicional País 16 V.macrocarpon 17 V.maingayi 18 V.membranaceum fruto ramas fruto raíz ramas 19 V. meridionale fruto 20 V.myrsinites hojas raíz ácidos orgánicos: cítrico, clorogénico, málico, quínico y shikímico. polifenoles: flavonoides y glucósidos de pigmento: antociánicos de cianidina y peonidina bencenoides, flavonoides (cianidina, hiperósido, epicatequinas y proantocianidinas) y fenilpropanoides. bencenoides, flavonoides (cianidina, hiperósido, epicatequinas y proantocianidinas) y fenilpropanoides. compuestos fenólicos (antocianinas) y compuestos no fenólicos (ácido clorogénico). ácidos orgánicos, azucares, vitaminas B y C, minerales (K, Ca, P). flavonoides alimento, cáncer, escorbuto, para calmar el ardor, leve irritación de garganta, purificador de la sangre, como fibra, para el hígado, el asma, la vesícula biliar, estimulante suave, cistitis, prevenir la infección urinaria, pleuresía lactogogo alimento, fuente de vitamina C, reumatismo, artritis, corazón, antiséptico, astringente, carminativo, diabetes alimento alimento, medicina ceremonial, resfriados, fiebre, vómito, enfermedades: de los ojos, dolor de cabeza, fiebre alta y diarrea, baño para el mal de cerdo: la inconsciencia U.S.A. Canada U.S.A. Colombia Jamaica U.S.A. 21 V.myrtilloides fruto flores parte aérea flavonoides alimento, conservas, anticonceptivos, diaforético, ayuda ginecológica, sangrado menstrual, prevenir aborto involuntario Canada U.S.A. 22 V. myrtillus 23 V. oxycoccos parte aérea fruto hoja raíz parte aérea frutos alcanos, alquenos, alcanonas, bencenoides, cumarinas, fenilpropanoides, flavonoides, monoterpenos y triterpenos. alcanos, alcanonas, flavonoides, monoterpenos y antídoto, antiséptico, astringente, catarro, diabetes, inflamación, escorbuto, fiebre tifoidea, enfermedades intestinales, dolor de estomago cáncer, refrigerante, té, antiemético, alimento Turquía Francia Italia U.S.A. Inglaterra Canadá Francia Rusia Puerto Rico Portugal Yugoslavia U.S.A. Canada 15

25 No. Especie Parte de la planta Metabolitos predominantes triterpenos. Uso tradicional País 24 V. oldhamii fruto 25 V. ovalifolium 26 V. ovatum 27 V. pahalae fruto hojas fruto hojas bencenoides, flavonoides (cianidina, hiperósido, epicatequinas y proantocianidinas) y fenilpropanoides. bencenoides, flavonoides (cianidina, hiperósido, epicatequinas y proantocianidinas) y fenilpropanoides. bencenoides, flavonoides (cianidina, hiperósido, epicatequinas y proantocianidinas) y fenilpropanoides. bencenoides, flavonoides (cianidina, hiperósido, epicatequinas y proantocianidinas) y fenilpropanoides. alimento alimento, fuente de vitamina C, ayuda post-parto alimento, ayuda post-parto, diabetes Té Corea U.S.A. Canada U.S.A. Canada 28 V. padifolium fruto flavonoides bronquitis, resfriado y tos Madeira corteza bencenoides, resfriado, alimento, vino, fruto U.S.A. 29 V. parvifolum fenilpropanoides y utilizado como una escoba, ramas Canada triterpenos tabaco hojas 30 V. peleanum 31 V.pennsylvanicum hojas 32 V. reticulatum 33 V. scoparium hojas frutos ramas bencenoides, flavonoides (cianidina, hiperósido, epicatequinas y proantocianidinas) y fenilpropanoides. bencenoides, flavonoides (cianidina, hiperósido, epicatequinas y proantocianidinas) y fenilpropanoides. bencenoides, fenilporpanoides y flavonoides bencenoides, flavonoides (cianidina, hiperósido, epicatequinas y proantocianidinas) y fenilpropanoides. Té diabetes Té antiemético, incremento del apetito, alimento, utilizada como una escoba U.S.A. U.S.A. Canada 16

26 No. Especie Parte de la planta Metabolitos predominantes Uso tradicional País 34 V. ugliginosum hojas frutos alcanos, alquenos, alcanonas, bencenoides, cumarinas, fenilpropanoides, flavonoides, monoterpenos y triterpenos. catarro, cistitis, enteritis, gastritis, intestino, licor, narcótico, ayuda post-parto, alimento, fuente de vitamina C U.S.A. Canada 35 V. vacciniaceum fruto bencenoides, flavonoides (cianidina, hiperósido, epicatequinas y proantocianidinas) y fenilpropanoides. alimento India 36 V. vitis-idaea fruto hojas alcanos, alquenos, alcanonas, bencenoides, cumarinas, fenilpropanoides, flavonoides, monoterpenos y triterpenos. antiséptico, tratar el cáncer de mama, diabetes, desinfectante, reumatismo, astringente, refriado, tos, dolor de garganta, diarrea, catarsis, controlar el dolor debido a cálculos renales Canadá U.S.A. Irán Italia Inglaterra 37 V. whitfordii bencenoides, flavonoides (cianidina, hiperósido, epicatequinas y proantocianidinas) y fenilpropanoides. lengua Inglaterra El género Érica comprende aproximadamente setecientas (700) especies en el mundo y se encuentran principalmente en África del Sur, el Mediterráneo y Europa occidental. Este género es representado por especies como la É. arbórea y É. manipuliflora especies de amplia distribución y comunes en las partes costeras de Turquía, en donde, se prepara té de hierbas a partir de las partes aéreas de estas dos especies, los cuales se han utilizado como diurético, astringente y para el tratamiento de infecciones urinarias en Turquía. Una infusión de hojas É. arbórea se toma después de las comidas para adelgazar y É. manipuliflora se emplea como: remedio popular en Marruecos, diurético, antiséptico urinario y como tratamiento para las heridas en España. Las especies de Érica tienen amplias aplicaciones en medicamentos y fitoterapia, tales como: drenar los edemas, heridas de serpientes y presenta una elevada actividad antiinflamatoria (Akkol, 2008). 17

27 El gran género Rhododendron incluye especies que han sido utilizados en la medicina tradicional (ver Tabla 3-2) para el tratamiento de condiciones inflamatorias, dolor, trastornos gastrointestinales, resfriado común, asma, enfermedad de la piel, etc., los Rododendros también son bien conocidos por su toxicidad y algunos especies se han utilizado tradicionalmente como veneno. En Asia, América del Norte y Europa, principalmente se emplean contra la inflamación, dolor, enfermedades de la piel, trastornos fríos y gastrointestinales comunes. Pruebas realizadas in vivo e in vitro en los extractos de plantas y compuestos aislados de este género, han determinado diversas actividades biológicas incluyendo antiinflamatoria, analgésico, antimicrobiana, anti-diabético, insecticida y actividad citotóxico (Popescu & Kopp, 2013). En la medicina tradicional Rusa se emplean las hojas de Ledum palustre (Rhododendro tomentosum) comúnmente conocido como (té de Labrador norte o romero silvestre), las cuales se preparan como infusión para tratar una amplia gama de trastornos respiratorios y pulmonares incluyendo bronquitis, tuberculosis, tos ferina y el asma, así como para reducir la presión arterial y la prevención de convulsiones. La decocción se utiliza como antihelmíntico con la preparación de un ungüento usando una base de grasa animal, que se utiliza para la sarna y picaduras de insectos. En la medicina tradicional sueca, esta planta se ha utilizado para tratar el dolor de cabeza, dolor de muela y la culebrilla. Las hojas se utilizan también como té, las cuales actúan como un abortivo, diaforético, diurético, emético, expectorante y lactagogo. En China las hojas se emplean para tratar la tos, el asma, disminuir la presión arterial y como un agente antifúngico (Shikov, 2014). 18

28 No Tabla 3-2. Usos tradicionales, farmacología y actividad biológica de algunas especie del genero Rhododendron. 5 Especie Rhododendron anthopogon Rhododendron anthopogonoides Rhododendron arboreum Rhododendron aureum Rhododendron campanulatum Rhododendron dauricum Parte de la planta hojas flores corteza flores hojas ramas flores hojas hojas flores flores semillas hojas tallos Hojas Metabolitos predominantes flavonoides (quercetina, rutina y isoquercitrin) flavonoides flavonoides flavonoides derivados fenólicos flavonoides triterpenos derivados orcinol preniladas derivados de cromeno y cromano flavonoides Uso tradicional trastornos en hígado, pulmón y gastrointestinal dolor estomacal, garganta, bronquitis, tos, resfriado común, fiebre, gonorrea, inflamación, estimulante, presión arterial, parálisis, dolor, dismenorrea, diurético baja la fiebre desintoxicación, tos, asma, elimina la hinchazón estomacal, elimina flema, antiinflamatorio, relajante muscular, enfermedad coronaria diarrea, dolor de cabeza, retraso mental, sangrado nasal, fiebre, dolor de estómago erupciones, reumatitis, diarrea, artritis, diurético, estomacal, narcótico, gota dolor en el cuerpo, dolor de garganta, digestión, enfermedades en la piel, reumatismo,sífilis, asiática, emético, hemicránea, frío, fiebre bronquitis expectorante, mucolítico, asma, tos, veneno para peces Farmacología/ Actividad Biológica estimulante antiinflamatorio antiviral insecticida antibacterial antiinflamatorio antibacterial analgésico antihiperglicemico cardioprotector antiinflamatorio analgésico antibacterial antioxidante inmunomodulador inhibición de la liberación de histamina, anti- VIH,anti - oxidante, la inhibición de la proliferación de células de músculo liso vascular País Nepal Tíbet India China Tíbet India Corea Rusia Turquía India India Nepal 5 Tomado de (Popescu & Kopp, 2013) 19

29 No Especie Rhododendron ferrugineum Rhododendron maximum Rhododendron molle Rhododendron mucronulatum Parte de la planta hojas flores parte aérea hojas flores frutos raíces hojas corteza Metabolitos predominantes triterpenos cumarinas diterpenos glucósidos fenolicos diterpenos fenoles flavonoides Uso tradicional reumatismo, gota, neuralgia, hipertensión, dolores musculares, migraña, molestias de la vejez, diurético, antiséptico urinario, diarrea, expectorante, dolor de garganta, tos, catarro, bronquitis, resfriado común, estimulante analgésico, antirreumático, dolencias del corazón analgésico, anestésico, reumatismo, artritis, lesiones traumáticas,enfermedades en los hombres, parálisis, insecticidas, mata a los gusanos, los nervios y la migraña terrible dolor de cabeza, dolor de muelas, narcótico, caries, malaria, activador del flujo sanguíneo, golpes y caídas fiebre, asma, tos, flemas, traqueítis crónica, disuria, tónico, tuberculosis, reumatismo, neuralgia Farmacología/ Actividad Biológica antiviral citotóxico hipotenso activo inmunomodulador analgésico sedante citotóxico antiinflamatorio antioxidante País Europa América del Norte China China Corea Rusia En la Tabla 3-3 se presenta un resumen de algunas plantas pertenecientes a la familia Ericaceae, las cuales han presentado algún tipo de farmacología o actividad biológica. No. Tabla 3-3. Actividades biológicas de la familia ERICACEAE. Parte de Metabolitos Farmacología/Actividad Nombre de la planta la planta predominantes Biológica 1 Agarista mexicana hojas triterpenos tratamiento diabetes 2 Vaccinium myrtillus frutos alcanos, alquenos, tratamiento diabetes trastornos vasculares y 20

30 No. Nombre de la planta Parte de la planta 3 Vaccinium vitis-idaea hojas 4 Vaccinium macrocarpo frutos 5 Érica arbórea hojas 6 Érica manipuliflora hojas Metabolitos predominantes alcanonas, bencenoides, cumarinas, fenilpropanoides, flavonoides, monoterpenos y triterpenos alcanos, alquenos, alcanonas, bencenoides, cumarinas, fenilpropanoides, flavonoides, monoterpenos y triterpenos ácidos orgánicos: cítrico, clorogénico, málico, quínico y shikímico. polifenoles: flavonoides y glucósidos de pigmento: antociánicos de cianidina y peonidina flavonoides antocianidinas cumarinas triterpenos flavonoides antocianidinas cumarinas triterpenos 7 Rhododendro tomentosum hojas flavonoides 8 Arctostaphylos uva-ursi hojas taninos condensados Farmacología/Actividad Biológica oculares. antioxidante astringente diurético astringente antiinflamatorio tratamiento infecciones del tracto urinario suplemento dietético diurético astringente tratamiento infecciones urinarias antiinflamatorio diurético astringente tratamiento infecciones urinarias antiinflamatorio expectorante trastornos respiratorios y pulmonares diurético 9 Arctostaphylos pungens raíces taninos tratamiento diabetes Química de la Familia ERICACEAE Los principales compuestos químicos hallados en la familia Ericaceae son, compuestos polifenólicos (flavonoides, ácidos fenólicos y taninos) y terpenos entre otros componentes. 21

31 Flavonoides Esta es una de las familias de compuestos más investigada y descrita en mayor cantidad de especies de la familia Ericaceae, más de 65 flavonoides se han obtenido como aglicona y glucósidos, según Popescu & Kopp (2013) se ha determinado la presencia de kaempferol (1), quercetina (2), quercitrina (3), hiperosido (4), farrerol (5) en hojas de 166 Rododendros, las flores contienen antocianidinas y flavonoles tales como azaleatina (6), cianidina (7), delfinidina (8), malvidina (9), petunidina (10), peonidina (11) y proantocianidinas (PAC) oligomeros y polímeros de la epicatequina (12) epigalocatequina (13). Flavonoles como la miricetina (14) y flavonoles c-glucósidos como isoorientina (15), orientina (16), vitexina (17), isovitexina (18). tros flavonoides presentes D catecol (19), avicularin (20), 3',4', 5,7 - tetrahidroxiflavon β -D- (6 "-- acetilgalactopiranosido) o (6 " -acetilhiperin) (21) y catequina (22). (1) H H H H H H H (2) (3) H H H H H H H H H H H 3 C H H (4) (5) (6) + H H + H H H + H (7) H (8) H H (9) 22

32 + H H + H H H (10) H (11) H (12) H H H H H H H H H (13) H (14) H H H (15) H H H H H H H H H H H H H H H (16) H (17) (18) H H (19) H H (20) H H H H (21) H H (22) H H H Terpenos En la familia Ericaceae se encuentran terpenos de tipo monoterpeno con estructuras oxigenadas, con un esqueleto mentano y monoterpenoides alifáticos como: sabineno (23), p cimeno (24), limoneno (25), terpinol (26), mirceno (27) y lepaol (28). También se encuentran terpenos de tipo sesquiterpenoides oxigenados como: ledol (29), palustrol (30), ciclocolorenona (31). Se encuentra el 23

33 12-urseno (32) y el triterpeno 23,24-dimetil-1,24 etil sigma-25-eno (33) en Agarista mexicana y triterpenoides como el uvaol (34). CH 2 C H 3 H CH 2 CH 2 H 3 C (23) H 3 C H 3 C CH 2 H 3 C H 3 C (24) (25) (26) (27) C H 3 H H H 3 C H H 3 C H H 3 C CH 2 H 3 C H H 3 C H H H 3 C H H 3 C H 3 C H H (28) (29) (30) (31) H 3 C H 3 C H 3 C CH 2 H 3 C H 3 C H H H H 3 C (32) H (33) H 3 C (34) Cumarinas En especies como Rhododendron tomentosum (Ledum palustre) se encuentran cumarinas como: fraxetina (35) fraxin (36), esculina (37), y palustrosido (esculetina 6 - -beta- D [ 6 ' ( 3 -hidroxi- 3 - metilglutaril )] glucósido (38), umbeliferona (39), escopoletina (40) (Dampc & Luczkiewicz, 2013). 24

34 H 3 C H 3 C H H H H H H H (35) (36) (37) H H 3 C H H H (39) H H (38) (40) H Ácidos orgánicos En varias especies de la familia Ericaceae como para el caso de los frutos del V. macrocarpon (arándano americano) se han encontrado ácidos orgánicos como: el cítrico (41), málico (42), quínico (43), shikímico (44), ácido clorogénico (45), p- cumárico (46), ácido 4-hidroxicinámico (47), ácido 3,4- dihidroxibenzoico (48), ácido vaníllico (49), ácido cafeico (50) y ácido cinámico (51) (Cunningham, 2005) y para la E. arbórea el ácido gálico (52) (Amezouar et al., 2013). 25

35 H H H H H H (41) (42) (43) H H H H H H H (44) H H C 2 H H (45) (46) (47) (48) H C 2 H CH H H H H H H (49) (50) (51) (52) H tros compuestos Como la pectina (53), ácido elágico (54), el resveratrol (55), secoisolariciresinol (56), ácido ursólico (57), tocotrienoles (58), y ácidos grasos omega-3, acetato nerodiol (59), cadaleno (60), guaiazuleno (61) y β sitosterol (62). Se registra la presencia de taninos gálico, taninos elágicos y taninos condensados, saponinas, esteroles y mucilago en E. arbórea. 26

36 C H C H H H H H H H H H C CH (53) (54) (55) H H H H H H H H H H H (57) (58) (56) H H H H (59) (60) (61) (62) 3.2. Género Cavendishia Características morfológicas del género Cavendishia El género Cavendishia se caracteriza por un grupo de plantas leñosas de hojas perennes y morfológicamente muy variables que fluctúan de oblongas, elípticas u ovadas a lanceoladas, de 2.5 a 22cm por 1.5 a 10cm, redondeadas, cordadas, con venación usualmente impresa y elevada, estas son alternas, simples y coriáceas. Inflorescencia con 6 a 30 flores, rodeadas basalmente por una serie de brácteas de pubescentes a glabradas, rosadas, de rojizas a rojo-rosadas, hasta de 8cm de largo, raras veces verde-rojizas. Pedicelos estriados o acostillados, algunas veces con glándulas fimbriadas. Bractéolas presentes en la base del pedicelo. Sus flores son numerosas y sin olor, con cáliz de glabro a pubescente, de 4 a 9mm de largo, de verde a rojizo, algunas veces con glándulas fimbriadas. Corola cilíndrica, de 10 a 28mm por 4 a 9mm, de glabra a pubescente como se puede identificar en la Figura 3-4, bayas de glabras a pilosas, de 8 a 14mm de diámetro (Martinez, 2010). Las especies pueden ser fácilmente reconocidas, por lo general, por sus grandes 27

37 brácteas florales, de colores brillantes y estambres con filamentos alternativamente desiguales. Figura 3-4. Cavendishia aberrans Distribución y hábitat del género Cavendishia La Cavendishia es un género Neotropical que comprende doscientas seis (206) especies descritas y de estas solo ciento cincuenta (150) aceptadas. Como se puede identificar en la Figura 3-5 las plantas pertenecientes a este género son nativas de áreas tropicales en zonas montañosas como el sur de México, América Central, norte de Bolivia, cerca del este en las Guayanas y en Amapá (Brasil). Figura 3-5. Mapa de distribución del género Cavendishia en Centro y Sur América. La zona amarilla representa la distribución. 7 6 Tomado de (Luteyn, 2004) 7 Tomado de (Garden, 1997). Editado por los Autores. 28

38 Las Ericáceas presentes en el Neotrópico se concentran en el noroeste del Sur América específicamente en Colombia, Ecuador, Perú y Venezuela, siendo los bosques montañosos húmedos y fríos las zonas más pobladas de la familia Ericaceae. Cerca del 50% de las especies neotropicales tienen hábitos de crecimiento epifito y aproximadamente el 94% son endémicas (Luteyn, 2001), como es el caso del género Cavendishia el cual se encuentra en gran proporción en la región Andina y Pacifica de Colombia donde se distribuye a lo largo de las tres cordilleras (ver Figura 3-6), entre los 1000 a 3200m de altitud. Figura 3-6. Mapa de distribución del género Cavendishia en Colombia. Los puntos rojos indican la distribución del género. 8 A continuación en la Tabla 3-4 se presentan algunas de las especies del género Cavendishia que presentan estudios en la región Andina y Pacífica (Salinas, 8 Tomado de la. Editado por los Autores. 29

39 2007). Es importante resaltar que aunque Colombia posee gran número de especies Cavendishia aún no cuenta con estudios químicos realizados reportados en la literatura. Tabla 3-4. Distribución y usos de especies del género Cavendishia en Colombia No. Nombre Común Especie Región Uso tradicional 1 No reporta Cavendishia awa Nariño 2 No reporta Cavendishia callista 3 No reporta 4 No reporta Cavendishia engleriana Cavendishia mariae Andén pacífico, la cordillera ccidental, el extremo norte de la cordillera Central y la Sierra Nevada de Santa Marta. Cauca y Nariño Nariño, llanura del Pacífico y la región andina, municipio de Barbacoas, corregimientos de Altaquer, Junín y Santander. rnamentación rnamentación rnamentación rnamentación 5 No reporta Cavendishia complectens Cordillera ccidental rnamentación 6 No reporta Cavendishia oligantha Nariño rnamentación Llanura del Pacífico y la región andina, municipios de Barbacoas 7 No reporta (corregimiento el Diviso) y Tumaco rnamentación Cavendishia palustris (corregimiento la Guayacana) 8 Flor de quinde Cavendishia micayensis Chocó, Valle, Cauca y Nariño rnamentación 9 No reporta Cavendishia porphyrea Cauca, Nariño rnamentación 10 No reporta Cavendishia tarapotana Valle del cauca, Nariño rnamentación 11 No reporta Cavendishia tryphera Valle del cauca, Nariño rnamentación 12 Chaquilulo Cavendishia venosa Choco, Cauca, Valle del Cauca, Nariño rnamentación 13 No reporta Cavendishia violacea rnamentación Alimento, 14 Uva de Anís, uvo Cundinamarca decocción, Cavendishia bracteata ó aniso y Boyacá astringente, antirreumático 13 Chanquilulo Cavendishia acuminata Putumayo Alimento 14 Tullá Cavendishia beckmanniana Cauca Alimento 15 Uvito macho Cavendishia campii Valle Alimento 16 Uvito, Uvo Cavendishia cordata Huila Alimento 17 Zarcillejo Cavendishia cordifolia Norte de Santander Alimento 18 Esmeraldo, siete cueros, uva de camarona, uva de monte, gualicón, joyapa, sagalipa. Cavendishia costaricensis Santander Alimento 30

40 Etnobotánica del género Cavendishia Se realizó una revisión bibliográfica de los usos etnobotánicos de especies del género Cavendishia encontrando diez ocho (18) especies (ver Tabla 3-4), destacando la Cavendishia bracteata (uva de anís) una de las Ericáceas características de la flora andina Colombiana; este arbusto ofrece grandes oportunidades de uso dadas sus propiedades alimenticias y medicinales (Aguilar & Torres, 2010). Sus frutos son utilizados como alimento, en dulces y mermeladas; se usan en decocciones como astringentes y antirreumáticas, sus hojas son usadas en infusión para curar los granos y la sarna. Generalmente se utilizan las flores de esta planta para curar inflamaciones y el dolor de muela. También es utilizada como leña y forraje para las ovejas. Varias especies de Cavendishia han sido usadas como ornamentales localmente en Colombia incluyendo C. bracteata, C. quereme, C. tryphera, y C. adenophora entre otras (Martinez, 2010) Fitoquímica del género Cavendishia Los principales compuestos químicos encontrados en el género Cavendishia son flavonoides de diferentes tipos como: flavonas glicosiladas, flavonas ((luteolina (63), chrysoeriol (64) y tricina (65)), flavonoles (quercetina (66), kaempferol (67) y miricetina (68), dihidroflavonoles y proantocianidinas. También se han reportado compuestos fenólicos como el ácido elágico (69) y el ácido salicílico (70) (Plazas G, 2012). Según (Luteyn, 1980) en la Cavendishia endresii y Cavendishia grandifolia se reportó la presencia de resveratrol (71) y estilbenos (72), en extractos de esta última especie se presentan derivados del ácido cinámico (73) y en frutos grandes contenidos de ácido clorogénico (74) como constituyente químico más abundante en esta especie (Dastmalchi, 2011). 31

41 H H3C (63) (64) (65) H H H3C H H H H H H (66) (67) (68) H H H H H H H (69) (70) (71) H (72) (73) (74) H H H H H La especie Cavendishia bracteata contiene abundantes principios tánicos en la corteza, raíz y frutos por esta razón causa una fuerte astringencia estomacal que si se continúa por la ingestión exagerada de frutos puede generar una diarrea, además contienen ácido tánico (75) y ácido gálico (76) junto con oxalatos (Martinez, 2010). Las brácteas de Cavendishia bracteata de coloración roja se emplean para extraer las antocianinas como colorante natural de alimentos. 32

42 H H H H H H H H H H H H H H (75) (76) 3.3. Especie Cavendishia compacta Características morfológicas de la especie Cavendishia compacta Es un arbusto epifito de 4m de altura aproximadamente, con tallo adulto terete, estriado, glabro, de color café, ramas subteretes, sin rodeos en ángulo, lisos y glabros. Como se puede identificar en la Figura 3-7 presenta hojas coriáceas y subcoriáceas, elípticas, oblongo elípticas a ovado elípticas, basalmente redondeadas, ampliamente cuneadas, ápice acuminado, glabro o con pelos dispersos a lo largo de la nervadura central por debajo. Peciolo cilíndrico y rugoso. Inflorescencia de flores con promedio de dos flores por cada centímetro, estas se caracterizan por tener múltiples brácteas, su estructura se asemeja a las hojas pero se diferencia por su forma, tamaño y color que la rodea. Flores con cáliz glabro de color fucsia oscuro en forma de botellas estrechándose cerca de la garganta, los lóbulos de color blanco, erectos, triangulares (Luteyn, 2004). 33

43 Figura 3-7. Cavendishia compacta Distribución y hábitat de la Cavendishia compacta Como se puede identificar en la Figura 3-8 la Cavendishia compacta conocida comúnmente como - camarero grande- es una especie endémica de Colombia que se distribuye a lo largo de las laderas occidentales y estribaciones de la Cordillera ccidental, en el bosque húmedo, en elevaciones de m. Figura 3-8. Mapa de la distribución de la Cavendishia compacta. Los puntos negros indican la distribución de la especie. 9 9 Tomado de o%20vallecaucano%20en%20el%20mapa%20de%20colombia.png. Editado por los Autores. 34

44 Etnobotánica de la especie Cavendishia compacta A esta especie se la da un uso ornamental, ya que hace parte de la vegetación de la zona y sus flores son de gran atractivo para las personas por su color vivo Estudios químicos y biológicos de la especie Cavendishia compacta Actualmente la especie no cuenta con estudios químicos ni biológicos realizados reportados en la literatura Actividad Antiinflamatoria Generalidades El proceso inflamatorio involucra una serie de eventos inespecíficos que pueden ser provocados por numerosos estímulos o agresiones del medio, por ejemplo, agentes biológicos, isquemia, interacciones antígeno-anticuerpo, traumatismos, lesiones térmicas o fisicoquímicas de otra índole. Cada tipo de estímulo provoca una respuesta característica que constituye una variante relativamente menor del mismo fenómeno. A nivel macroscópico, la respuesta esta usualmente acompañada por conocidos signos clínicos como tumefacción (edema), rubor, calor, dolor espontáneo a la palpación y desorden de la función tisular. La respuesta inflamatoria ocurre en tres fases distintas, cada una mediada aparentemente por diferentes mecanismos: Fase transitoria aguda, caracterizada por vasodilatación local, hiperemia activa e incremento en la permeabilidad capilar. Fase subaguda tardía, visiblemente caracterizada por un periodo de hiperemia pasiva, infiltración de leucocitos y fagocitos. Fase proliferativa crónica, en la cual ocurre degeneración de tejidos, lesión endotelial y fibrosis. La inflamación es un mecanismo fisiopatológico básico, la magnitud de la respuesta inflamatoria es crucial pues una respuesta inflamatoria insuficiente 35

45 resulta en inmunodeficiencia, lo cual puede conducir desde una infección hasta cáncer. Por otro lado una excesiva respuesta inflamatoria causa morbilidad y mortalidad en enfermedades tales como, arteriosclerosis, tromboembolismo, enfermedad arterial coronaria, cerebral y periférica, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPC), la enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, peritonitis, esclerosis múltiple y artritis reumatoide, entre otras (Gomez, 2011) Modelos de evaluación in vivo de la actividad antiinflamatoria Para evaluar la actividad antiinflamatoria in vivo se dispone de modelos que varían en la intensidad de la reacción, estos pueden ser, modelos de inflamación aguda o modelos de inflamación subcrónica o crónica. Dentro de los modelos de inflamación aguda se pueden emplear tres métodos según (Gomez, 2011), cada uno presenta características especiales dependiendo de las condiciones bajo las cuales se realice el estudio, los cuales son: Edema plantar por Carragenina El método por edema plantar por carragenina ha sido uno de los métodos de mayor utilidad en la discriminación de fármacos antiinflamatorios por su sencillez y reproducibilidad. Consiste en la administración subcutánea de una pseudo solución de carragenina (un muco polisacárido sulfatado extraído del alga marina Chondrus crispus y Gigartina stellata) a nivel de la aponeurosis plantar de la rata o del ratón. El producto ensayar se administra por diferentes vías sea intraperitoneal u oral Protocolo experimental por Aceité de Crotón Consiste en la administración tópica del aceite de crotón, una mezcla de ésteres y otros componentes, los cuales poseen propiedades irritantes. Esté método se utiliza farmacológicamente para provocar una inflamación localizada en las orejas de los animales de laboratorio, inflamación que responde a los antiinflamatorios no esteroideos. 36

46 Edema auricular en ratón inducido por el 13-Acetato de 12-tetradecanoilforbol (TPA) Los esteres de forbol se extraen del aceite de crotón, el TPA es el más potente de todos, este posee propiedades irritantes, pro-inflamatorias y promotor de tumores. La aplicación de TPA desencadena todos los eventos propios del proceso inflamatorio como lo es la vasodilatación y eritema, extravasación y edema. 37

47 4. METDLGÍA La investigación se realizó teniendo en cuenta dos aspectos importantes, uno químico y otro biológico. El estudio químico se enfocó en la extracción, aislamiento e identificación de los metabolitos secundarios y caracterización de la composición química del aceite esencial de las hojas de Cavendishia compacta y en el estudio biológico se evaluó la actividad antiinflamatoria del extracto etanólico y las fracciones obtenidas Generalidades En el estudio fitoquímico se utilizaron métodos cromatográficos, espectroscópicos y espectrométricos convencionales empleados para el aislamiento, purificación y elucidación estructural de metabolitos secundarios Métodos de Separación Cromatográfica Los extractos y fracciones obtenidos fueron sometidos a separaciones sucesivas empleando cromatografía en columna (CC) bajo gravedad y cromatografía en capa delgada preparativa (CCDP), cada una de las subfracciones obtenidas fueron monitoreadas por cromatografía en capa delgada (CCD) utilizando cromatoplacas en sílica gel 60G F-254 Merck y para la CC se empleó sílica gel 60 Merck ( Mesh). El criterio de selección fue la complejidad del perfil cromatográfico en la CCD y la cantidad de fracción para las fracciones que se llevaron a purificación. El control de pureza se llevó a cabo por CCD empleando como reveladores luz ultravioleta y vainillina en ácido sulfúrico. Los solventes empleados para las separaciones cromatográficas fueron de grado analítico. Para la determinación de las mezclas se empleó un cromatógrafo de gases con detector selectivo de masas SHIMADZU QP2010 plus, ubicado en el laboratorio de química de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas. La separación se realizó en una columna capilar SHRXI-5MS (J & W Scientific, Folsom, CA, EE.UU.) de 30m x 0,25mm x 0,25μm con una inyección en modo Split (10:0), el 38

48 gas de arrastre utilizado fue helio (grado 5.0) con flujo constante de 1,2mL/min. La programación de la temperatura del horno fue de 50 C (2min), incremento de 15 C/min, hasta 200 C (2min), incremento de 10 C/min, hasta 300 C (10min) para un tiempo total de análisis de 34 minutos, las temperaturas de la cámara de ionización y de la línea de transferencia fueron de 230 C y 275 C, respectivamente. La determinación de la composición química relativa del aceite esencial se realizó por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG-EM) empleando una columna capilar de sílice fundida, SHRXI-5MS (J & W Scientific, Folsom, CA, EE.UU.) de 30m x 0,25mm x 0,25μm, con fase estacionaria 5% fenilpolimetilsiloxano. La programación de temperatura del horno fue de 45ºC (5 min), incremento de 5ºC/min, hasta 60ºC (1min), incremento de 30ºC/min, hasta 130 C (0min), incremento de 4ºC/min, hasta 190 C (2 min), incremento de 40ºC/min, hasta 285 C (0 min) para un tiempo total de análisis de 71 minutos. Los espectros de masas se obtuvieron por ionización electrónica (IE) de energía de 70 ev. Las temperaturas de la cámara de ionización y de la línea de transferencia fueron de 230ºC y 325ºC, respectivamente. El gas de arrastre utilizado fue helio (grado 5.0) con flujo constante de 1,2mL/min Técnicas para la Elucidación Estructural y Caracterización de los Compuestos Aislados Espectrometría de Masas Los espectros de masas de las sustancias aisladas, fueron tomados en un equipo SHIMADZU QP2010 dotado con sonda de inserción directa y analizador de masas cuadripolar. El modo de ionización fue ionización electrónica (IE) a 70eV y la temperatura de la cámara de ionización fue de 230 C. 39

49 Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear Los espectros de RMN 1 H fueron tomados en un espectrómetro Bruker Avance del laboratorio de RMN de la Pontificia Universidad Javeriana. Los análisis se realizaron a 300MHz para RMN 1 H, empleando como solvente CDCl3, con tetrametilsilano (TMS) como referencia interna Estudio Fitoquímico de Hojas de Cavendishia compacta A continuación se realiza una descripción de la metodología empleada para la identificación de la especie vegetal, la obtención y preparación de extractos, el aislamiento y purificación de los metabolitos secundarios y obtención del aceite esencial Recolección y Selección del Material Vegetal Como se muestra en la Figura 4-1 el material vegetal fue recolectado en el corregimiento Virolin, finca la Sierra, camino el lival del municipio de Charalá, Santander, Colombia (Coordenadas geográficas: 6º N, 73º W). Una muestra testigo fue enviada al Herbario Nacional de Colombia para su determinación taxonómica la cual fue clasificada bajo el número de colección CL como Cavendishia compacta por el biólogo Adolfo Jara. Se tomaron (300 g) de hojas de la especie las cuales se secaron a temperatura ambiente y fueron reducidas de tamaño para su posterior extracción. 40

50 Figura 4-1. Mapa de localización del área de recolección de la especie. Santander, Municipio Charalá, Corregimiento Virolin, camino lival Preparación de Extractos y Fracciones Las hojas una vez secas y trituradas en molino fueron sometidas a una extracción con etanol (EtH) por el método de extracción soxhlet; el extracto obtenido (E.EtH.H) 22,6g fue floculado con agua en relación 1:0.5mL y filtrado posteriormente. Al E.EtH.H se le realizó un estudio fitoquímico preliminar (ver Figura 4-2) basado en la guía de análisis fitoquímico preliminar (Sanabria, 1983) y en el método de estudio de productos naturales (Lock de Ugaz, 1994) a fin de reconocer los posibles grupos de metabolitos presentes en el mismo. 10 Tomado de Editado por los Autores. 41

51 11 (Lock de Ugaz, 1994; Sanabria, 1983) Figura 4-2. Marcha Fitoquímica Preliminar. 11

52 Para el fraccionamiento del E.EtH.H se empleó el método de extracción líquido líquido continuo con solventes de polaridad creciente obteniendo las fracciones de hexano (F.HEX.CcH), diclorometano (F.CH2Cl2.CcH), acetato de etilo (F.AcEt.CcH) y un residuo hidroalcoholico (R.H.CcH). Los pesos y porcentajes de rendimiento se describen en la Figura 4-3. Hojas de Cavendishia compacta Extracción Soxhlet E.EtH.H 22,6 g Fraccionamiento Líquido-Líquido F.HEX.CcH 9,57% F.CH2Cl2.CcH 6,62% F.AcEt.CcH 22,64% R.H.CcH 60,36% Figura 4-3. Porcentaje de Rendimiento de las fracciones obtenidas a partir del E.EtH.H Fracción de Hexano de hojas de Cavendishia compacta (F.HEX.CcH) 2g de F.HEX.CcH se fraccionaron por CC empleando como fase móvil Hexano:Cloroformo 6:4, obteniendo 8 fracciones. Las fracciones 1 (F.HEX.CcHF1) y 4 (F.HEX.CcHF4) fueron subfraccionadas nuevamente por CC. Para 0,66g de (F.HEX.CcHF1) se empleó como fase móvil Diclorometano:Acetona 9:1, obteniendo 5 subfracciones. En las subfracciones 2 (F.HEX.CcHF1.2) y 4 (F.HEX.CcHF1.4), se obtuvo 9,2mg de un sólido de color blanco denominado mezcla CcH1 y 21,6mg de un sólido de color verde denominado mezcla CcH2, respectivamente. Para 0,60g de (F.HEX.CcHF4) se empleó como fase móvil Diclorometano:Acetona 8:2, obteniendo 5 subfracciones. En la subfracción 1

53 (F.HEX.CcHF4.1), se obtuvo 30mg de un sólido de color blanco denominado mezcla CcH3. Las fracciones y mezclas obtenidas a partir de la F.HEX.CcH se describen en la Figura 4-4. Figura 4-4. Fracciones y Mezclas obtenidas a partir de la Fracción de Hexano Fracción de Diclorometano de hojas de Cavendishia compacta (F.CH2Cl2.CcH) 1g de (F.CH2Cl2.CcH) se fraccionaron por CC empleando como fase móvil Diclorometano:Acetato de Etilo 1:1, obteniendo 10 fracciones. En la fracción 2 (F.CH2Cl2.CcHF2) precipito un sólido de color amarillo (87mg) denominado compuesto CcH4 y en la fracción 3 (F.CH2Cl2.CcHF3) se obtuvo un sólido de color amarillo-verdoso (40mg) denominado compuesto CcH5. Las fracciones y compuestos obtenidos a partir de la F.CH2Cl2.CcH se describen en la Figura

54 Figura 4-5. Fracciones y Compuestos obtenidos a partir de la Fracción de Diclorometano Fracción de Acetato de Etilo de hojas de Cavendishia compacta (F.AcEt.CcH) 1g de (F.AcEt.CcH) se fraccionó por CC empleando como fase móvil Cloroformo:Metanol 6:4, obteniendo 5 fracciones. La fracción 1 (F.AcEt.CcHF1), fue fraccionada por CC empleando como fase móvil Cloroformo:Metanol 7:3, obteniendo 12 subfracciones. En la subfracción 1 (F.AcEt.CcHF1.1) precipitó un sólido (120mg) de color amarillo - verdoso el cual después de ser analizado resulto ser el mismo compuesto denominado CcH5. Las fracciones y compuestos obtenidos a partir de la F.AcEt.CcH se describen en la Figura

55 Figura 4-6. Fracciones y Compuestos obtenidos a partir de la Fracción de Acetato de Etilo Extracción y Caracterización Química de los Aceites Esenciales El aceite esencial fue obtenido a partir de 300g de hojas frescas por arrastre con vapor de agua, obteniendo 0,2mL de aceite con un porcentaje de rendimiento de 0,27%. La caracterización se realizó por CG-EM, la identificación través del cálculo de los índices de retención (IR) y la comparación de los índices de retención y los espectros de masas reportados en la librería NIST 08. Los IR se calcularon teniendo en cuenta los tiempos de retención de una serie homologa de patrones de hidrocarburos desde C7 hasta C24, analizados por CG-EM bajo las mismas condiciones que el aceite esencial. Los valores fueron calculados aplicando la Ecuación 4-1: IR = 100 n [ t RX t Rn t RN t Rn ] Ecuación 4-1. Cálculo de IR 12 Donde IR corresponde al índice de retención del compuesto de interés x, n corresponde al número de átomos de carbono del n-alcano que eluye antes del 12 (Goodner, 2008) 46

56 compuesto de interés x, N corresponde al número de átomos de carbono del n- alcano que eluye después del compuesto de interés X, trx corresponde al tiempo de retención del compuesto de interés X, trn corresponde al tiempo de retención del n-alcano que eluye después del compuesto de interés X y trn corresponde al tiempo de retención del n-alcano que eluye antes del compuesto de interés X. Finalmente, se realizó un análisis estadístico de los resultados, mediante el software Statgraphics asumiendo un análisis de varianza multivariado seguido de prueba interacciones para comparaciones múltiples Evaluación de la Actividad Antiinflamatoria La evaluación de la actividad antiinflamatoria del extracto y de las fracciones obtenidas a partir de Cavendishia compacta se realizó mediante el ensayo de edema inducido en oreja de ratón por TPA, empleando 36 ratones albinos machos de 32 a 38g, entre doce a catorce semanas de nacidos, mantenidos en condiciones estándar suministrados por el bioterio de la facultad de Farmacia de la Universidad Nacional de Colombia en colaboración con el Doctor Luis Fernando spina. Se administró el irritante 13-acetato 12-tetradecanoilforbol (TPA, 2,5µg/oreja) junto con indometacina 500µg/oreja como patrón o con la sustancia a evaluar (E.EtH.H, F.HEX.CcH, F.CH2Cl2.CcH y F.AcEt.CcH 500µg/oreja) disueltas en EtH-acetona vía tópica en la oreja derecha (volumen total: 20µL/oreja, 10µL/cara). La oreja izquierda se empleó como control. Transcurridas 4 horas se sacrificaron los animales por dislocación cervical y se obtuvieron muestras de cada pabellón auricular por sacabocado de 6mm de diámetro los cuales fueron pesados. Posteriormente se calcularon los deltas de peso conforme a la Ecuación 4-2. Peso (mg) = [P t P nt ] Ecuación 4-2. Cálculo del peso entre la oreja tratada y no tratada (Jaimes, 2009) 47

57 Donde P t corresponde al peso de a oreja tratada (derecha) y P nt corresponde al peso de la oreja no tratada (izquierda). Finalmente se expresaron los resultados como porcentaje de inhibición del edema calculado con la Ecuación 4-3. % Inhibición: 100 (( P Trat X P c ) 100) Ecuación 4-3. Cálculo del porcentaje de Inhibición. 14 Donde P Trat corresponde al delta de peso de cada uno de los individuos dentro de cada tratamiento y X P c corresponde a la media aritmética de los deltas de peso del grupo control. Para el análisis se consideró como actividad antiinflamatoria moderada la inhibición del edema del 35 al 65% y como buen efecto antiinflamatorio un valor mayor de 65% (Garcia, 2004). Finalmente, se realizó un análisis estadístico de varianza de un solo factor, mediante el software Minitab seguido de una prueba Dunnett para comparaciones múltiples. 14 (Jaimes, 2009) 48

58 5. RESULTADS Y ANÁLISIS 5.1. Estudio Fitoquímico Preliminar Los resultados de los ensayos químicos preliminares realizados al extracto etanólico de hojas (E.EtH.H) de la especie Cavendishia compacta se encuentran en la Tabla 5-1. Metabolitos secundarios Tabla 5-1. Resultados del análisis fitoquímico preliminar Análisis Resultado en E.EtH.H Cloruro ferríco - Taninos Taninos Acetato de plomo - Gelatina sal - Leucoantocianidinas Leucoantocianidinas Rosenhein + Flavonoides Flavonoides Shinoda + Borträger-Kraus + Quinonas Cumarinas Terpenoides y esteroides Naftoquinona y antraquinona Cumarinas Comportamiento ante ácidos y donador de - protones Rodamina y amoniaco - Hidrosulfito de sodio - Hidroxamato férrico - Erlich - Sesquiterpenlactonas Hidroxamato férrico + Triterpenos Lieberman-Buchard + Dienos Homonucleares + Saponinas Espuma - Rosenthal - Baljet - Glucosidos Tollens - cardiotónicos Antrona - Molish - Carotenoides Salkowski - Valser - Mayer - Alcaloides alcaloides Dragendorff - Schleiber - Wagner - +: Resultado positivo. -: Resultado negativo. E.EtH.H: Extracto etanólico hojas. El estudio fitoquímico preliminar indica la presencia de metabolitos secundarios como flavonoides y terpenoides en la planta lo cual confirma lo encontrado por varios autores que destacan la presencia de estos compuestos en especies de la familia Ericaceae, como: Dampc & Luczkiewicz (2013) en el estudio de la especie Rhododendron tomentosum, la especie Agarista mexicana (Andrade- Cetto & 49

59 Heinrich, 2005), la especie Agauria salicifolia (Lhuillier et al., 2007), la especie Arbutus unedo (Malheiro et al., 2012), las especies Arctostaphylos pungens y Arctostaphylos uva-ursi (Panusa, Petrucci, Marrosu, Multari, & Gallo, 2015), la especie Vaccinium corymbosum (Dastmalchi, 2011) y finalmente en las especies del genero Bejaria, como: Bejaria congesta, Bejaria aestuans y Bejaria resinosa (Matulevich Peláez & Gil Archila, 2014) entre otras especies vegetales pertenecientes a la familia Ericaceae. Es importante mencionar que la familia Ericaceae no se caracteriza por encontrar en sus componentes alcaloides (Font Quer, 1999) y en algunas especies se han reportado la presencia de cumarinas Metabolitos Secundarios Aislados A partir de las fracciones de hexano (F.HEX.CcH), diclorometano (F.CH2Cl2.CcH) y acetato de etilo (F.AcEt.CcH) obtenidas del E.EtH.H de Cavendishia compacta se obtuvo por medio del aislamiento e identificación, una mezcla de compuestos de tipo diterpeno conformada por rimueno, biformeno y kaurano, denominada Mezcla CcH1, una mezcla de compuestos aromáticos constituida por acetofenona y benzaldehído denominada Mezcla CcH2, una mezcla de compuestos de tipo triterpeno conformada por α-amirina y β-amirina denominada Mezcla CcH3 y dos flavonoides; morina y miricetina denominados como Compuesto CcH4 y Compuesto CcH5, respectivamente. Las mezclas CcH1 a CcH3 fueron analizadas por CG-EM. Los compuestos CcH4 y CcH5 fueron elucidados por métodos espectroscópicos (EM y RMN 1 H) y por comparación con los datos reportados en la literatura Composición de la Mezcla CcH1 La mezcla CcH1 se obtuvo como un sólido (9,2mg) de color blanco. En el análisis por CG-EM de la mezcla CcH1 se obtuvo tres señales en la corriente iónica total (TIC). Para determinar la posible composición de la mezcla se comparó los espectros de masas obtenidos con los de la librería NIST 08 confirmando la 50

60 presencia de rimueno, biformeno y kaurano. La TIC y los tiempos de retención de los compuestos obtenidos se encuentran en la Figura 5-1 y la Tabla 5-2. a. b. c. Figura 5-1. Corriente iónica total (TIC) obtenida para la mezcla CcH1. Tabla 5-2. Tiempo de retención y resultados de la comparación con la librería NIST 08 para la mezcla CcH1 tr (min) % Área % Coincidencia* Asignación 19,06 13,81 94 Rimueno (a) 19,21 16,03 93 Biformeno (b) 20,43 11,28 95 Kaurano (c) *Comparado con la librería NIST 08 CH 2 H 3 C CH 2 H H 2 C C H 3 H H 3 C H 3 C (a) (b) (c) 51

61 En los espectros de masas se observan los picos de ion molecular a m/z 272 con baja intensidad, correspondiente a la formula molecular C20H32 del rimueno (a) biformeno (b) y kaurano (c). A continuación se presenta el espectro de masas obtenido por ionización electrónica (ver Figura 5-2, Figura 5-5, Figura 5-8) y su comparación con el espectro de masas almacenado en la librería NIST 08 (ver Figura 5-3, Figura 5-6, Figura 5-9) para los posibles compuestos de la mezcla CcH1. Para el rimueno (Figura 5-2 y Figura 5-3) se observa el pico base (m/z 257) que corresponde a la pérdida de un grupo metilo (M-15). A partir del ion molecular se da un reordenamiento por medio del mecanismo Retro Diels Alder (RDA) observándose la señal (m/z 136) y a partir de ella se observa la señal (m/z 121) debido a la pérdida de un grupo metilo (M-15). Figura 5-2. Espectro de masas en modo ionización electrónica para el Rimueno. Figura 5-3. Espectro de masas de la librería NIST 08 para el Rimueno. El esquema de la Figura 5-4 presenta la ruta de fragmentación para el rimueno propuesta por los autores. 52

62 + H 3 C H 2 C m/z H 3 C H 3 C H 2 C H 2 C m/z 257 RDA H 3 C H 2 C H 2 C H 2 C m/z 136 m/z 121 m/z 136 Figura 5-4. Esquema de fragmentación para el Rimueno propuesto por los autores. Según Huang, Peakman, & M (1997) el rimueno es un constituyente de plantas como: Cupressinum dacrydium (Podocarpaceae), Thujopsis dolabrata y Thuja standishii (Cupressaceae). También Brophy, Goldsack, Wu, Fookes, & Forster, (2000); Verma et al., (2014) reportan la presencia de este compuesto en Araucaria cunninghamii, Araucaria heterophylla y en Wollemia nobilis (Araucariaceae) en el aceite esencial. tras de las plantas que presentan estudios en los que se ha reportado el rimueno son Thujopsis dolabrata (Cupraceae) rica en diterpenos siendo este el compuesto mayoritario y Küpeli Akkol et al., (2015) en Thuja occidentalis (Cupraceae). En Illicium griffithii (Illiciaceae) el rimueno está presente en el extracto de hexano (Vijayakumar et al., 2012). En la familia Ericaceae no se 53

63 han reportado estudios acerca de la presencia de rimueno siendo este el primer reporte para el género Cavendishia y para la especie Cavendishia compacta. Para el biformeno (Figura 5-5 y Figura 5-6) se observa el pico base en (m/z 257) que corresponde a la pérdida de un grupo metilo (M-15). A partir de este, se da un rompimiento homolitico observándose la señal (m/z 175) y un rompimiento heterolítico observándose la señal en (m/z 81). Figura 5-5. Espectro de masas en modo ionización electrónica para el Biformeno. Figura 5-6. Espectro de masas de la librería NIST 08 para el Biformeno. El esquema de la Figura 5-7 presenta la ruta de fragmentación para el biformeno propuesta por los autores. 54

64 + CH 2 CH 2 H 3 C m/z CH 2 CH 2 + CH 2 CH 2 m/z 257 m/z 257 CH CH H 3 C 2 m/z 81 m/z 175 Figura 5-7. Esquema de fragmentación para el Biformeno propuesto por los autores. El biformeno fue aislado previamente de la especie Helianthus Decapetalus (Asteraceae) y Nakano et al., (2010) señala que también es producido por medio de la reacción enzimática de diterpenos difosfatados con la enzima Kitasatospora griseola, una Actinobacteria (Streptomycetaceae). También ha sido encontrado en especies como Pinus contorta perteneciente a la Familia Pinaceae (Backlund et al., 2014). En la familia Ericaceae no se han reportado estudios acerca de la 55

65 presencia del biformeno siendo este el primer reporte para el género Cavendishia y para la especie Cavendishia compacta. Para el kaurano (Figura 5-8 y Figura 5-9) se encuentra el pico base (m/z 257) que corresponde a la pérdida de un grupo metilo (M-15) y se observan las señales (m/z 229) y (m/z 201) que corresponden a la perdida -C2H4 (M-28) respectivamente, la señal (m/z 201) es resultante del mecanismo RDA. Figura 5-8. Espectro de masas en modo ionización electrónica para el Kaurano. Figura 5-9. Espectro de masas de la librería NIST 08 para el Kaurano. El esquema de la Figura 5-10 presenta la ruta de fragmentación para el kaurano propuesta por Kalinovsky et al., (2005). 56

66 + CH3 H 3 C m/z C 2 H 4 C + m/z 257 C + CH3 H 3 C m/z 229 -C 2 H 4 H 3 C + H 2 C m/z 201 Figura Esquema de fragmentación del Kaurano. 15 El kaurano es un compuesto ampliamente estudiado en varias familias como las Asteraceas principalmente especies del género Pentacalia tales como Pentacalia corymbosa, Pentacalia ledifolia y Pentacalia pulchella, (Santana, 2010); la familia Compositae en la especie Coespeletia moritziana, especies del género plectranthus como la Plectranthus fruticosus y la familia Annonaceae en especie como Mitrephora celebica (Henry et al., 2006; Peña, 2008); la familia Lamiaceae en especies del género Isodon, género Rabdosia, género Salvia (Velasco Aguirre, 2012) y genero Sideritis para la especie Sideritis cadidans (Hernández Pérez, Sánchez, Montalbetti Moreno, & Rabanal, 2004). En la familia Ericaceae no se han 15 Propuesto por (Kalinovsky et al., 2005) 57

67 reportado estudios acerca de la presencia del kaurano siendo este el primer reporte para el género Cavendishia y para la especie Cavendishia compacta Composición de la Mezcla CcH2 La mezcla CcH2 se obtuvo como un sólido (21,6mg) de color verde. En el análisis por CG-EM de la mezcla CcH2 se obtuvo dos señales en la corriente iónica total (TIC). Para determinar la posible composición de la mezcla se comparó los espectros de masas obtenidos con los de la librería NIST 08 confirmando la presencia de acetofenona y benzaldehído. La TIC y los tiempos de retención de los compuestos obtenidos se encuentran en la Figura 5-11 y la Tabla 5-3. g h Figura Corriente iónica total (TIC) obtenida para la mezcla CcH2. Tabla 5-3. Tiempo de retención y resultados de la comparación con la librería NIST 08 para la mezcla CcH2 tr (min) % Área % Coincidencia* Asignación 8,07 46,43 96 Benzaldehído (g) 9,29 20,93 95 Acetofenona (h) *Comparado con la librería NIST 08 58

68 (g) (h) En los espectros de masas se observan los picos de ion molecular a m/z 106 y m/z 120 con intensidad, correspondientes con las formulas moleculares C7H6 y C8H8 del benzaldehído (g) y acetofenona (h). A continuación se presenta el espectro de masas obtenido por ionización electrónica (ver Figura 5-12, Figura 5-15) y su comparación con el espectro de masas de la librería NIST 08 (ver Figura 5-13, Figura 5-16) para los posibles compuestos de la mezcla CcH2. Para el benzaldehído (Figura 5-12 y Figura 5-13) se observa el ion (m/z 105) característico de aldehídos aromáticos, atribuible a la pérdida del hidrogeno (M-1) para originar un ion benzoilo, el pico base (m/z 77) que corresponde a la pérdida del ion acilo (M-28) originando un ion fenilo y este, a su vez, pierde acetileno (m/z 51). Figura Espectro de masas en modo ionización electrónica para el Benzaldehído. Figura Espectro de masas de la librería NIST 08 para el Benzaldehído. 59

69 El esquema de la Figura 5-14 presenta la ruta de fragmentación para el benzaldehído. + H -H + -C + m/z 106 m/z 105 m/z 77 -C 2 H 2 + Figura Esquema de fragmentación para el Benzaldehído. m/z 51 La acetofenona (Figura 5-15 y Figura 5-16) presenta el pico base (m/z 105) atribuible a la pérdida de un grupo metilo (M-15), los iones (m/z 77) que corresponde a la pérdida del ion acilo originando un ion fenilo el cual a su vez, pierde acetileno para originar la señal de m/z 51. Figura Espectro de masas en modo ionización electrónica para el Acetofenona. Figura Espectro de masas de la librería NIST 08 para el Acetofenona. 60

70 El esquema de la Figura 5-17 presenta la ruta de fragmentación para la acetofenona C + m/z 120 m/z 105 m/z 77 -C 2 H 2 + Figura Esquema de fragmentación para Acetofenona. m/z 51 En la familia Ericaceae no se han reportado estudios acerca de la presencia de benzaldehído y acetofenona, este es el primer reporte para el género Cavendishia y para la especie Cavendishia compacta Composición de la Mezcla CcH3 La mezcla CcH3 se obtuvo como un sólido (30mg) de color blanco. En el análisis por CG-EM de la mezcla CcH3 se obtuvo dos señales en la corriente iónica total (TIC). Para determinar la posible composición de la mezcla se comparó los espectros de masas obtenidos con los de la librería NIST 08 confirmando la presencia de α- amirina y β- amirina. La TIC y los tiempos de retención de los compuestos obtenidos se encuentran en la Figura 5-18 y la Tabla

71 l k Figura Corriente iónica total (TIC) obtenida para la mezcla CcH3. Tabla 5-4. Tiempo de retención y resultados de la comparación con la librería NIST 08 para la mezcla CcH3 tr (min) % Área % Coincidencia* Asignación 29,688 6,63 96 α-amirina (k) 30,408 93,37 97 β- amirina (l) *Comparado con la librería NIST 08 H 3 C H 3 C CH3 CH3 H 3 C (k) H 3 C (l) En los espectros de masas se observan los picos de ion molecular a m/z 426 con baja intensidad, correspondientes a la formula molecular C30H50 de α- amirina (k) y β- amirina (l). A continuación se presenta el espectro de masas obtenido por ionización electrónica (ver Figura 5-19, Figura 5-21) y su comparación con el 62

72 espectro de masas de la librería NIST 08 (ver Figura 5-20, Figura 5-22) para los posibles compuestos de la mezcla CcH3. Para α- amirina y β- amirina (Figura 5-19, Figura 5-20, Figura 5-21, Figura 5-22) se observa el ion (m/z 411) que corresponde a la pérdida de un grupo metilo (M-15), el pico base (m/z 218) resultante del mecanismo RDA a nivel del anillo C y a partir de este se generan los iones (m/z 203) que corresponde a la pérdida de un grupo metilo (M-15) y (m/z 189) que corresponde a la pérdida del grupo C2H5 por la ruptura del enlace que une a los anillos D y E. Figura Espectro de masas en modo ionización electrónica para α- amirina. Figura Espectro de masas de la librería NIST 08 para la α- amirina. Figura Espectro de masas en modo ionización electrónica para β- amirina. 63

73 Figura Espectro de masas de la librería NIST 08 para la β- amirina. El esquema de la Figura 5-23 presenta la ruta de fragmentación sugerida para la mezcla CcH3. H 3 C H 3 C E + C D A H 3 C B m/z 426 RDA C H 3 C H 3 + E C D + m/z 218 H 3 C E H 2 C C H 3 C D m/z 203 Figura Esquema de fragmentación de α y β amirina. 16 La α-amirina y β-amirina han sido estudiadas en familias como la Asclepiadaceae específicamente la especie Hemidesmus indicus (Nair, Sabulal, Radhika, Arunkumar, & Subramoniam, 2014) y en la familia Burseraceae en las especies Protium kleinii y Protium heptaphyllum (Simão Da Silva et al., 2011). 16 Propuesto por (Cely & Loaiza, 2013) 64

74 En la familia Ericaceae se han encontrado estudios en especies como Craibiodendron yunnanense donde se evidencia la presencia de α, β-amirina (C. Zhou, Li, Li, & Li, 2012); el género Rhododendron también reporta la presencia de esta mezcla de triterpenos en la especie Rhododendron dauricum (Cao, Chu, & Ye, 2004); la especie Rhododendron canescens (Balsdon, Espelie, & Braman, 1995), Rhododendrom Tormetosum (Dampc & Luczkiewicz, 2013) y la especie Vaccinium macrocarpon (Cunningham, 2005) y las especies Bejaria congesta, Bejaria aestuans y Bejaria resinosa (Matulevich Peláez & Gil Archila, 2014). En el género Cavendishia no se han reportado estudios acerca de la presencia de α- amirina y β-amirina siendo este el primer reporte para la especie Cavendishia compacta Elucidación Estructural del Compuesto CcH4 El compuesto CcH4 se obtuvo como un sólido (87mg) de color amarillo fue analizado a través de espectrometría de masas por inserción directa. La comparación del espectro de masas (ver Figura 5-24), con la librería NIST 08 con un porcentaje de coincidencia del 98% y haciendo uso de la literatura se pudo concluir que el compuesto CcH4 corresponde a la morina para este compuesto se muestra el ion molecular a m/z 302, el pico base m/z 285 (M-H) y señales en m/z 153, 134, 121,108 resultantes del mecanismo RDA de acuerdo a la literatura (McNab, Ferreira, Hulme, & Quye, 2009) corresponde al flavonol morina (ver Figura 5-25). 65

75 Figura Espectro de masas en modo ionización electrónica para el compuesto CcH4. H -H m/z 302 H RDA m/z 285 H + + H m/z 153 H m/z (H) 2 + -C 2 m/z 121 m/z 108 Figura Mecanismo de fragmentación para la Morina Propuesto por (McNab et al., 2009) y modificado por los Autores. 66

76 El compuesto CcH4 también fue analizado por RMN 1 H para confirmar su estructura. El espectro RMN 1 H (Figura 5-26) del compuesto CcH4, muestra dos singletes en δ 3.90 y 3.93 ppm correspondientes a grupos hidroxilos en la posición C-2 y C-4 del anillo B; dos dobletes en δ 5.93 y 6.43 ppm que corresponden a protones acoplados en posición meta (C-6 y C-8) del anillo A; un doblete en δ 6.59 ppm (C-3 ) y un doble doblete en 6.95 ppm (C-5 ) que corresponden a protones del anillo B y un último doblete en δ 7.53 ppm (C-6 ), todos ellos características de H aromáticos. Solvente CDCl 3 Figura Espectro RMN 1 H (300 MHz, CDCl3) del compuesto CcH4. Luego del análisis de los datos de RMN 1 H, EM y de la comparación con datos reportados en la literatura, se asignaron los desplazamientos químicos para cada uno de los hidrógenos de la molécula la cual se identificó como morina (Figura 5-67

77 27). En la Tabla 5-5 se resumen los desplazamientos químicos obtenidos para el compuesto CcH4 y descritos para morina según Lucia et al., (2008) a diferente frecuencia, RMN 1 H (200MHz) y empleando como solvente CD3D. 3' H 2' 4' B 8 1' 5' 7 2 6' A C H H Figura Asignación de H en la estructura química de la Morina. Tabla 5-5. Comparación de los desplazamientos químicos RMN 1 H del compuesto CcH4 con el de morina. 18 Posición CcH4* Morina** C1 - - C2 - - C3-H - - C4 - - C5-H - - C6-H 5,93 (d,j=3 Hz) 6,15 (d, J=2,0 Hz) C7-H - - C8-H 6,43 (d,j=6 Hz) 6,27 (d, J=2,0 Hz) C9 - - C C1 C2 -H 3,93 (s) - C3 -H 6,59 (d, J=6 Hz) 6,41(d, J=2,2 Hz) C4 -H 3,90 (s) - C5 -H 6,93 (dd,j=3 Hz; 6 Hz) 6,35 (dd, J=2,2; 8,4 Hz) C6 -H 7,55 (d, J= 3Hz) 7,21(d, J=8,4 Hz) *Datos obtenidos a 300MHz para RMN 1 H (solvente: CDCl 3) ** Datos obtenidos a 200 MHz para RMN 1 H (solvente: CD 3D) (Lucia et al., 2008) La morina se ha reportado como un pigmento amarillo en la familia Moraceae (Naso et al., 2013; F. Sultana & Rasool, 2015) y se ha identificado en frutas, verduras, té, vino y en muchas plantas medicinales orientales, entre ellas se 18 (Lucia et al., 2008) 68

78 encuentra en las hojas de guayaba, cebolla y manzana (F. Sultana & Rasool, 2015). En la familia Ericaceae no se han reportado estudios acerca de la presencia de morina, este es el primer reporte para el género Cavendishia y para la especie Cavendishia compacta Elucidación Estructural del Compuesto CcH5 El compuesto CcH5 obtenido como un sólido (160mg) de color verde fue analizado a través de espectrometría de masas por inserción directa. La comparación del espectro de masas (ver Figura 5-28), con la librería NIST 08 con un porcentaje de coincidencia del 98% y haciendo uso de la literatura se pudo concluir que el compuesto CcH5 corresponde a miricetina, para este compuesto se muestra el ion molecular a m/z 318 y señales en m/z 302, 317 (M-H), el pico base en m/z 179 (M-138),136 y 138 de acuerdo a la literatura (Lhuillier et al., 2007) corresponde al flavonol miricetina (ver Figura 5-29). Figura Espectro de masas en modo ionización electrónica para el compuesto CcH5. 69

79 H H H H + H -H - H H H m/z 318 m/z H H H + + H H H - H - H H H H H m/z 302 m/z 317 H m/z H H H H m/z m/z 179 Figura Mecanismo de fragmentación para la Miricetina El compuesto CcH5 también fue analizado por RMN 1 H para confirmar la estructura de la miricetina. El espectro de RMN 1 H (Figura 5-30) del compuesto CcH5, muestra tres singletes en δ 3.90, 3.11 y 3.93 ppm correspondientes al grupo hidroxilo ubicado en las posiciones C-3, C-4 y C-5 (Bilia, Mendez, & Morelli, 1996), un doblete en δ 5.36 y 5.38 ppm correspondientes a un protón unido en las posiciones (C-8) y (C-6), finalmente un singlete de δ 6,93 ppm que corresponde a un protón unido al C-6 (Mok & Lee, 2013). 19 Propuesto por (Lhuillier et al., 2007) y modificado por los Autores. 70

80 Solvente CDCl 3 Figura Espectro RMN 1 H (300 MHz, CDCl3) del compuesto CcH5. A partir del análisis de los datos de RMN 1 H, EM y de la comparación con datos reportados en la literatura, se asignaron los desplazamientos químicos para cada uno de los hidrógenos de la molécula la cual se identificó como miricetina (Figura 5-31). En la Tabla 5-6 se resumen los desplazamientos químicos obtenidos para el compuesto CcH5 y los descritos para miricetina según Bilia et al., (1996); Mok & Lee, (2013) a diferente frecuencia, RMN 1 H (200MHz) y empleando como solvente CD3D. 2' 3' 4' H B 8 1' 7 2 6' 5' 6 A C 3 H 5 H H Figura Asignación de H en la estructura química de la Miricetina. 71