PROTOCOLO Mapeo de tres puntos en D. melanogaster

Transcripción

1 OBJETIVO PROTOCOLO Mapeo de tres puntos en D. melanogaster Coordinadora: Dra Beatriz Goñi Colaboradora: Lic. Ana María Soler Sección Genética Evolutiva Comprender la naturaleza del crossing over, y cómo este fenómeno afecta a los alelos ligados. Asignar posiciones de mapa de tres genes de D. melanogaster ligados al cromosoma X, utilizando frecuencias de crossing over. ALGUNOS CONCEPTOS (ver ANEXO) Mapa Genético y Fracción de Recombinación: Un mapa genético es una representación lineal de los genes de un cromosoma, descifrado a partir de las distancias entre loci marcadores. La distancia normalmente es una representación de la fracción de recombinación (F.R %) expresada como unidades de mapa. La unidad de medida es un centimorgan (cm). La fracción de recombinación es la proporción de cromosomas recombinantes encontrados entre los dos loci. Por lo tanto, la distancia entre dos loci en los que se ha encontrado 1% de recombinación es 1cM. Recombination fraction = numero de recombinates / total La relación entre la fracción de recombinación y la distancia entre los genes se puede aplicar a loci que están situados cerca uno del otro en un cromosoma. Sin embargo, cuando la distancia aumenta la posibilidad de entrecruzamiento es más alta y por lo tanto la adaptación simple no es suficiente para calcular la distancia entre los loci. El resultado de dobles o incluso de numerosos crossing-overs resulta en progenie cuyo fenotipo es de tipo parental, pasando desapercibidos y no registrándose como recombinantes. Esto en gran medida subestima la fracción de recombinación y por lo tanto distorsiona el mapa genético. Existen problemas para el mapeo de tres o más puntos en un genoma ya que las fracciones de recombinación no son de naturaleza aditiva. CERTEZA en los experimentos de mapeo : Como la frecuencia máxima de recombinación detectable entre pares de genes ligados es de 50 %, para genes con distancias mayores a las 20 unidades de mapa, la ocurrencia de múltiples crossing-overs no sería detectada y por lo tanto las distancias reales entre ellos estaría subestimada. Es así que, la construcción de mapas genéticos certeros provienen de análisis entre genes que están muy próximos unos de otros. 1

2 La predicción de las distancias de mapa entre pares de genes funciona para distancias menores a 10 ó 20 unidades de mapa. Existe otro factor que afecta los datos de mapeo. Este factor involucra la reducción del número de dobles crossing-over (DCO) cuando los genes están muy cerca unos de otros en el cromosoma. Esta reducción, de denomina INTERFERENCIA (I), y puede ilustrarse en experimentos de mapeo de tres puntos. La interferencia es el efecto por el cual la ocurrencia de un crossing over (c.o.) en cierta región reduce la probabilidad de otro c.o. en una región cercana. La interferencia puede ser cuantificada mediante la proporción entre los DCO observados (DCOobs) y esperados (DCOesp). Esta proporción se llama coeficiente de coincidencia (CC): CC = DCOobs /DCOesp I = CC Si la interferencia es completa, no se producen dobles crossing-overs, entonces I= 1.0. Si se observan menos dobles crossing over que los esperados, entonces I > 0, la Interferencia es positiva. Si se observan mas dobles crossing-overs que los esperados, entonces I < 0, la Interferencia es negativa. En los sistemas eucariotas, se observa interferencia positiva con mas frecuencia. Como determinar las distancias de mapa? El cruzamiento de tres puntos permite determinar el ORDEN de los genes. Los tipos de gametos parentales estarán necesariamente en mayor frecuencia. La habilidad de identificar en la progenie las clases fenotipicas recíprocas correspondientes a los cromosomas parentales y a los cromosomas recombinantes correspondientes al evento de doble crossing-over le permitirá determinar el orden de los genes. CRITERIOS para realizar mapeo clásico 1. El genotipo del organismo que produzca gametos portadores de eventos de crossing over debe ser HETEROCIGOTA para TODOS los LOCI de interés. 2. Los cruzamientos deben construirse de tal manera que el GENOTIPO de TODOS los GAMETOS pueda DETERMINARSE de manera precisa al observar el FENOTIPO de la PROGENIE. Cada clase fenotípica debe reflejar el genotipo de los gametos producidos por los parentales. 3. Debe producirse un número suficiente de progenie que recobre una MUESTRA REPRESENTATIVA de todas las clases fenotípicas correspondientes a la ocurrencia o no de crossing over. 2

3 ACTIVIDADES EXPERIMENTALES Cada participante recibirá cepas puras mutantes con una, dos o tres mutaciones ligadas al cromosoma X. Los datos de mapeo posibilitarán proponer el mapa genético de los genes (mutaciones) utilizadas. Procedimiento: El experimento de mapeo de tres puntos consta de DOS cruzamientos: Parental y F1xF1, observación de la F1 y el análisis de recombinación de la F2. SEMANA 1: Observación de las cepas marcadoras. Identificación mutantes. Primer cruzamiento EXAMINE las moscas de las cepas mutantes que le brinde el docente. Identifique para cada una de ellas el carácter mutante con respecto a moscas de fenotipo salvaje y anote su fenotipo. Realice el cruzamiento G0, utilizando individuos de las CEPAS PURAS (parentales). Para esto, cruce hembras vírgenes de una cepa con machos de la otra. Prepare un tubo por cada tipo de cruzamiento. Utilice 8-10 vírgenes (se las brinda el docente) y por cada tubo. Ud proporcionará los machos en este cruzamiento. Anote datos de las cepas, fecha y grupo (o estudiante) SEMANA 2: Elimine las moscas parentales entre 5 y 6 días posterior al cruzamiento. Tire las moscas a la morgue. Coloque papel absorbente en el medio de cultivo para proporcionar superficie seca para que pupen las larvas. SEMANA 3: Observación de la F1 y segundo cruzamiento Anestesie SUAVEMENTE la progenie del cruzamiento realizado en el práctico anterior. Cual es el fenotipo de los individuos (machos, hembras) de la F1, y a qué conclusiones llega, son los fenotipos esperados? Realice el 2do cruzamiento. Para esto, cruce F1 x F1 del cruzamiento anterior. Realice TRES tubos con 8-10 moscas de cada sexo. Que fenotipos espera en la F2 para cada sexo, cuales corresponden al producto de gametos recombinantes y no recombinantes de este cruzamiento? SEMANA 4: Elimine las moscas parentales (F1xF1) SEMANA 5: Observación y análisis de la F2. Propuesta de mapeo de los loci incógnitas. Anestesie la progenie F2 del cruzamiento anterior. Para examinar la progenie siga un orden establecido, examine UN TUBO por vez. Separe los sexos ( porque?). Luego clasifique los individuos (cuales?) según su fenotipo. COMO CLASIFICAR las moscas? Separe PRIMERO por UN carácter (mutante o salvaje?) más fácil de identificar. 3

4 Luego, dentro de cada grupo, identifique el siguiente carácter y así sucesivamente. Cuente las moscas de cada grupo y coloque los datos en la TABLA 1 (abajo), para la cual previamente se ha determinado las diferentes clases fenotípicas (y los genotipos) ESPERADAS en la progenie F2. En base a SUS DATOS, CALCULE las fracciones de recombinación entre los genes, estimada a partir de la proporción de gametos recombinantes. Para ello necesita determinar: a) La FASE de LIGAMIENTO (CIS o TRANS) de los PARENTALES, y b) el HAPLOTIPO de los gametos transmitidos por la hembra F1. - AGRUPE las CLASES RECOMBINANTES según la ocurrencia de uno o doble crossing-over en cada intervalo. - Determine el ORDEN de los GENES. Los datos que indiquen los gametos (clases) recombinantes correspondiente al DCO serán importantes. - Determine las DISTANCIAS entre los GENES. Calcule la F.R. (%) para cada región a partir de la proporción de los gametos (clases) recombinantes. - CALCULE el Coeficiente de Coincidencia y determine la Interferencia (positiva, neutra o negativa). Dibuje el mapa genético y muestre las distancias de recombinación entre los pares de genes adyacentes. - CONSTRUYA el mapa de recombinación PROBABLE integrando sus datos con los datos obtenidos por otros participantes utilizando los genes empleados en el práctico. Determine la posición en el mapa (propuesta) de cada gen (mutación) a partir de la posición del gen de referencia yellow (X-0.00). Considere las distancias relativas entre los genes y tenga en cuenta la PREDICCION de que las distancias de mapa (para distancias pequeñas) son aditivas. BIBLIOGRAFIA y material de consulta A Database of Drosophila Genes & Genomes. Klug WS and Cummings MR Concepts of Genetics. Essentials of Genetics(5th Edition) (Hay biblioteca) Ashburner, M. (1989). Drosophila: A Laboratory Handbook and Manual. Two volumes. : xliii pp; 434pp. VER. Chaper 5. MAPPING. (Genetic Linkage and Mapping) Chaper 5. Basics of Linkage and Gene Mapping. Julius van der Werf Chapter 1.+Glossary of Terms. Handbook of Statistical Genetics, Volumen 1 editado por David J. Balding, Martin Bishop,Chris Cannings. (COPIA subespacio) 4

5 TABLA 1. Resumen de los datos del cruzamiento de Tres Puntos G0, Cruzamiento x parental (genotipo) (genotipo) Fecha: Cruzamiento F1* x F1 x F1 (genotipo) (genotipo) Fecha: *Indique el genotipo de la hembra F1, mostrando el orden correcto de los genes: Progenie F2: Parentales (No crossing over) Crossing over Region I Crossing over Region II Doble crossing over RI + RII Genotipo Fenotipo Total Proponga el mapa genético de los mutantes utilizados en el práctico, mostrando distancias y orden de los genes (considere la posición del gen de referencia yellow, X-0.00). A que genes correspondería cada una de las mutaciones utilizadas? (ver mapa genético parcial, abajo) Detecto Interferencia? 5

6 FIGURA 1. Diagrama del mapa genético parcial de los cuatro cromosomas de D. melanogaster (Klug and Cummings 1997). 6