Western Blot. Western Blot

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Francisco Javier Sandoval Salas
hace 8 años
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1 Western Blot Western Blot Inmunométodo para la detección de proteínas específicas en un soporte sólido. Preparación de la muestra (dosaje de proteínas totales) Electroforesis en gel de poliacrilamida Transferencia a un soporte sólido Inmunodetección de la proteína de interés

Preparación de la muestra (dosaje de proteínas totales)

2 MUESTRA Suero Plasma Homogenatos Medio de cultivo Medio de cultivo Western Blot

3 FRACCIONAMIENTO CELULAR Homogenización Tejido o células Homogenato Supernadante Pellet enriquecido con núcleos y restos celulares Centrifugación diferencial Pellet enriquecido con mitocondrias Pellet enriquecido con microsomas (membranas celulares) Pellet enriquecido con ribosomas

Centrifugación diferencial Pellet enriquecido con mitocondrias Pellet

4 Western Blot Preparación de la muestra (dosaje de proteínas totales) Electroforesis en gel de poliacrilamida Western Blot

5 Western Blot Western Blot Transferencia de las proteínas a un soporte Inmunodetección de las proteínas Western Blot

6 Western Blot

7 Western Blot Western Blot Semicuantificación (Scion Image) Western Blot

8 Western Blot Western Blot Resultados ** * Control Budesonide Crónico (* = p < 0.05, ** = p< 0.01 ) Western Blot Cantidad Relativa (Unidades de Area)

9 Western Blot Aplicaciones de de western blot - Enfermedades Infecto-Contagiosas - Enfermedades Inflamatorias - Perfil de Citoquinas en Modelos Experimentales - Factores de Crecimiento - Proteínas de Secreción

Inflamatorias - Perfil de Citoquinas en Modelos

10 Western Blot Aplicaciones de de western blot - Enfermedades Infecto-Contagiosas - Enfermedades Inflamatorias - Perfil de Citoquinas en Modelos Experimentales - Factores de Crecimiento - Proteínas de Secreción

11 MICROARRAY

12 MICROARRAY ( BIOCHIPS) FUNDAMENTO La tecnología microarray permite el análisis comparativo y simultáneo de cómo se expresan cientos de genes en un solo experimento.

14 GENERALIDADES BIOCHIP o MICROARRAY: Son micromatrices (soporte de silicona, vidrio, plástico o membrana de nylon) donde existen miles de sondas de material genético las cuales tienen una secuencia conocida. Se fabrican a partir de: Cadenas de oligonucleótidos Una colección purificada de DNA s Proteínas Tejidos

material genético las cuales tienen una secuencia conocida.

15 Microarray Printer

16 Microarray Printer A close up of the head of our microarray spotting robot. These 48 little pins are dipped in little wells containing different solutions of DNA probes and they are then put in contact with each glass slides thus producing 0.7 nanoliter drops on the surfaces

These 48 little pins are dipped in little wells containing different

17 Secuencia de eventos en un estudio comparativo de expresión génica 1- Elección de la población celular a estudiar. 2- Extracción del mrna y Transcripción Reversa. 3- Marcación de los cdna. 4- Hibridación al DNA del Biochip o Microarray. 5- Escaneo del array hibridado. 6- Interpretación de la imagen escaneada.

2- Extracción del mrna y Transcripción Reversa. 3- Marcación de los cdna.

18 Secuencia de eventos en un estudio comparativo de expresión génica 1- Elección de la población celular a estudiar. A- Estudios comparativos de genes específicos de tejidos B- Estudios de defectos genes reguladores en el cáncer C- Respuestas celulares al ambiente D- Variaciones del ciclo celular

A- Estudios comparativos de genes específicos de tejidos B- Estudios de

19 Secuencia de eventos en un estudio comparativo de expresión génica 1- Elección de la población celular a estudiar. 2- Extracción del mrna y Transcripción Reversa. - Objetivo: Comparar la cantidad de diferentes mrna presentes en 2 poblaciones celulares seleccionadas. - Se realiza una trascripción reversa de mrna a cdna que es una forma más estable.

- Objetivo: Comparar la cantidad de diferentes mrna presentes en 2 poblaciones

20 Secuencia de eventos en un estudio comparativo de expresión génica 1- Elección de la población celular a estudiar. 2- Extracción del mrna y Transcripción Reversa. 3- Marcación de los cdna. Empleo de moléculas fluorescentes: Obtención de cdna probes Rojo Rodamina Verde Fuoresceína

2- Extracción del mrna y Transcripción Reversa.

21 Secuencia de eventos en un estudio comparativo de expresión génica 1- Elección de la población celular a estudiar. 2- Extracción del mrna y Transcripción Reversa. 3- Marcación de los cdna. 4- Hibridación del cdna marcado al DNA del Microarray.

22 Secuencia de eventos en un estudio comparativo de expresión génica 1- Elección de la población celular a estudiar. 2- Extracción del mrna y Transcripción Reversa. 3- Marcación de los cdna. 4- Hibridación al DNA del Biochip o Microarray. 5- Escaneo del array hibridado. Revelado mediante Escáner óptico Microscopio láser confocal

23 Secuencia de eventos en un estudio comparativo de expresión génica 1- Elección de la población celular a estudiar. 2- Extracción del mrna y Transcripción Reversa. 3- Marcación de los cdna. 4- Hibridación al DNA del Biochip o Microarray. 5- Escaneo del array hibridado. 6- Interpretación de la imagen escaneada. Empleo de software comerciales y gratuitos

24 Estufa de Hibridación Imagen de hibridación

26 EN BIOMEDICINA APLICACIONES EN LA CLÍNICA EN LA INDUSTRIA FARMACÉUTICA EN BIOTECNOLOGÍA VENTAJAS Permite generar un volumen importante de datos que luego se analizan, interpretan y reúnen en una base informática. Acelerar descubrimientos biológicos, Encontrar genes con objetivos terapéuticos Clasificar enfermedades basándose en genes

27 PERSPECTIVAS DE DESARROLLO EN INDUSTRIAS FARMACÉUTICAS Desarrollar nuevas herramientas de diagnóstico micromatriciales en las áreas siguientes: -genotipado del VIH-1 para detectar mutaciones de resistencia, -resecuenciación del gen p53 en el cáncer, - predicción del riesgo de cáncer colorrectal, - fibrosis cística, - genotipado del virus del papiloma humano (HPV). (La infección por el HPV es la primera causa de cáncer cervical.) Estas micromatrices aportarán información sobre la dotación genética de una persona o revelarán características distintivas de la enfermedad o el agente infeccioso, cuyo conocimiento influirá en la elección y la duración del tratamiento.

29 Estas variaciones afectan a la tasa de metabolismo individual de cada paciente de numerosos medicamentos utilizados para tratar muy diversas enfermedades, como cardiovasculopatías -incluida la hipertensión-, la depresión, el trastorno por déficit de atención con hiperactividad, etc. El conocimiento de estas variaciones, puede ayudar al médico a encontrar con mayor rapidez el mejor medicamento y la dosis adecuada para un paciente, además de evitar los fármacos que podrían causarle graves reacciones adversas. Roche estima que las pruebas basadas en la tecnología micromatricial de AmpliChip CYP450 pueden generar unos ingresos anuales superiores a los 100 millones de dólares en el año 2008.

30 RESUMEN "Microarrays : técnica consolidada como una herramienta poderosa para investigar en un solo ensayo la expresión de miles de genes. * Los experimentos combinan la hibridización de ácidos nucleicos y detección por fluorescencia. * Los transcriptos marcados provenientes de la muestra a investigar son enfrentados a sondas fijadas en un portaobjetos. Sólo en aquellos puntos donde haya ocurrido hibridización se podrá detectar fluorescencia y será proporcional al nivel de expresión de cada gen.

31 RESULTADOS * Visión global de la actividad de genomas completos en respuesta a diferentes condiciones * Usados para caracterizar y describir cuantitativamente la expresión de grupos selectos de genes correlacionando el genotipo con un fenotipo particular.

37 Department of Energy's Lawrence Berkeley National Laboratory (Berkeley Lab) has invented a technique in which DNA or RNA assays the key to genetic profiling and disease detection can be read and evaluated without the need of elaborate chemical labeling or sophisticated instrumentation. Based on electrostatic repulsion in which objects with the same electrical charge repel one another the technique is relatively simple and inexpensive to implement, and can be carried out in a matter of minutes.

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