XIII CONGRESO CHILENO DE INGENIERIA SANITARIA Y AMBIENTAL AIDIS CHILE. Antofagasta, Octubre de

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1 XIII CONGRESO CHILENO DE INGENIERIA SANITARIA Y AMBIENTAL AIDIS CHILE Antofagasta, Octubre de EVALUACION MICROBIOLOGICA DE UNA LAGUNA DE ESTABILIZACION MEDIANTE EL USO DE COLIFORMES FECALES Y COLIFAGOS. Juan Silva 1, Francia Collao 1, Alejandra Morán 1, Juan Trigo 1 y Gabriela Castillo Depto. de Tecnol. Médica-INDES, Casilla 170, Universidad de Antofagasta. 2. Depto. Ingeniería Civil. Universidad de Chile, Casilla 228-3, Santiago, Chile. jsilva@uantof.cl INTRODUCCION En el diseño y operación de los sistemas de tratamientos de aguas servidas, Escherichia coli y las bacterias coliformes son usualmente considerados como indicadores de la eliminación de microorganismos patógenos de las aguas servidas. Las bacterias coliformes son habitantes normales del intestino humano y/o animales, por lo que su presencia en grandes cantidades en las aguas podría asociarse a la presencia de microorganismos patógenos para el ser humano. En el caso de las Plantas de Tratamientos, la calidad de las aguas servidas recicladas para ser usadas en el regadío sin restricción, debe contener menos de 1000 coliformes fecales x 100 ml de agua, según las normas sanitarias chilenas. Sin embargo, en los últimos años E. coli ha sido cuestionado como indicador de contaminación fecal, debido a su aparente presencia natural en ciertos cuerpos de agua y también, la remoción de las bacterias coliformes no representa la eliminación de parásitos y virus entéricos humanos (Toranzos y col, 1986; Naranjo y col, 1989; El-Abagy y Kamel, 1989 Hernández Delgado y col, 1990). Tanto los virus como los parásitos tienen características distintas a las bacterias, en cuanto a su eliminación de las aguas servidas, supervivencia en ellas, resistencia a desinfectantes y dosis infectantes diferentes. Debido a ello, en los últimos años, se han estado introduciendo nuevos indicadores de contaminación fecal. Uno de ellos, los constituyen los colifagos que son virus que infectan a cepas de E. coli, y estos bacteriófagos se encuentran normalmente en el intestino humano y por lo tanto, están siempre presentes en las aguas servidas (APHA, 1992; Grabow y Croubrough, 1986; Havelaar y col, 1983). Este principio parte de la premisa de que el colifago de origen fecal no puede replicarse en el medio ambiente y requiere de las células huésped de E. coli (Toranzos y col, 1990)

2 La enumeración de colifagos ha sido poco utilizado en nuestro país, solamente existe información de algunos estudios realizados por Castillo y col (1990) en Lagunas de Estabilización. En este trabajo se demostró que los colifagos son más resistentes al tratamiento en las lagunas, que las bacterias entéricas y que no reflejan cambios con el clima como ocurre con las bacterias entéricas. Estos autores sostienen que el uso de colifagos puede ser una técnica complementaria para ser usado como indicador en Lagunas de Estabilización. En todos los estudios realizados con colifagos, se señala que estos bacteriófagos tienen un potencial de ser usados como indicadores de contaminación fecal en ambientes acuáticos, en relación a su largo tiempo de sobrevida y porque, su dilución en el agua prevee su constante detección (Hernández-Delgado y col, 1990; Ijzerman y col, 1994, Grabow y col, 1986). Además, la técnica para enumerar colifagos es muy simple y pueden obtenerse resultados en un corto periodo. Este procedimiento implica el uso de una cepa de E. coli, como células hospederas, a las cuales los bacteriofagos van a infectar y producen placas de lisis, las cuales pueden ser contadas y corresponden al número de colifagos. En el norte de Chile, el agua es un elemento vital para el desarrollo de la actividad urbana e industrial. La escasez de agua constituye un problema regional de gran importancia y se han diseñado varias estrategias para dar solución a esta problemática, y una de ellas, son las Plantas de Tratamiento para recuperar las aguas servidas urbanas. En la II Región, se han instalado diversas Plantas de Tratamiento; entre las cuales figura, La Laguna de Estabilización de Cerro Negro, Calama. Esta Planta estaba en período de evaluación y en atención a ello, en este trabajo quisimos comparar la eficiencia de la Planta de Tratamiento en la eliminación de los coliformes fecales y colifagos en las aguas servidas recicladas. Figura 1. Diagrama de la Laguna de Estabilización de Cerro Negro Calama.

3 MATERIAL Y METODOS Laguna de Estabilización de Cerro Negro Calama. La Laguna de tratamiento de aguas servidas para Cerro Negro Calama consiste en una laguna facultativa y dos lagunas facultativas en serie, para tratar 30 l/s de aguas servidas domésticas de la ciudad de Calama. Su objetivo es recuperar sus aguas y reutilizarlas en el regadío irrestricto de parcelas del sector de Cerro Negro. Sus principales características son; un área total de m 2, un volumen total de m 3 y una permanencia total de las aguas de 12,7 días (Figura 1). Recolección de las muestras de agua. Las muestras de agua fueron recolectadas de la Planta de Tratamiento por Laguna de Estabilización de Cerro Negro Calama. En ella, se establecieron 5 estaciones de muestreo; afluente (AF), laguna anaeróbica (P1), laguna facultativa 1 (P2), Laguna facultativa 2 (P3), y efluente (EF) (Figura 1). Las muestras de agua fueron recolectadas duplicado, en frascos estériles, cada 15 días por un período de 3 meses. Las muestras fueron transportadas refrigeradas para su análisis posterior. Determinación del Indice de Coliformes. Se determinó mediante el Número Más Probable (NMP) de coliformes totales y fecales, empleando el test de los tubos múltiples, usando una serie de 3 tubos. Las muestras de agua se diluyeron convenientemente para ser distribuídas en los tubos de caldo lactosado, posteriormente traspasados a tubos con caldo verde brillante y a tubos con caldo EC, para finalmente aislar las cepas de E.coli y coliformes en placas de agar McConkey. Los resultados se expresaron como el NMP de coliformes totales o fecales x 100 ml de agua. Foto 1. Placas virales de lisis producidas por colifagos (bacteriófagos) sobre un cultivo de Escherichia coli ATCC 13706, que se encontraban en aguas tratadas previamente diluídas de la Laguna de Estabilización de Cerro Negro Calama.

4 Determinación de colifagos. La enumeración de colifagos se realizó por medio de la técnica de Isbister y col (1983). En todos los ensayos se usó la cepa de E. coli ATCC 13706, como célula hospedera. Se mezcló 5,5 ml de agar tripticasa (doble concentración) que estaban a 50 C, 1 ml de cultivo en caldo tripticasa de la cepa de E. coli, 5 ml de la muestra de agua previamente diluída, y 0,08 ml de trifeniltetrazolium clorhidrato. La mezcla se depositó en una placa de Petri estéril y se incubó a 35 C. También, se incluyó un control negativo, el cual no llevaba la muestra de agua problema. Los ensayos se repitieron 4 veces por cada dilución de la muestra de agua. Los colifagos son virus que infectan y destruyen a E coli, lo que permite observar la formación de placas de lisis (placas virales) en los cultivos y con ello se visualiza la lisis de las bacterias (ver Foto 1). Los resultados se expresaron como Unidades Formadoras de Placas, UFP x 100 ml de agua, los cuales fueron registrados a las 6 horas de incubación y se reconfirmaron a las 24 horas. RESULTADOS Los valores promedios de los recuentos de coliformes totales, fecales y colifagos de las 5 estaciones establecidas en la Planta de Tratamiento por Laguna de estabilización de Cerro Negro, Calama, muestran claramente la reducción de los microorganismos indicadores. En las Tablas 1,2 y 3, se presentan los valores obtenidos de los microorganismos indicadores de contaminación fecal agrupados, según estación de muestreo y de acuerdo con el número de muestreos realizados en los 3 meses, durante la obtención y análisis de las muestras de agua. En la Tabla 1, se observa que los recuentos de coliformes totales en aguas de la estación AF; cuyos valores fluctúan entre 2.0 a 7.0 x 10 7 Coliformes Totales x 100 ml de agua, a medida que transcure el tratamiento en las distintas piscinas de la Laguna de Estabilización, éstos disminuyen en la la estación EF (salida de las aguas tratadas) a 8,6 x 10 3 a 4,6 x 10 4 Coliformes Totales por 100 ml de agua reciclada. Tabla 1 Número más probable de Coliformes Totales presentes en las aguas servidas de la Laguna de Estabilización de Cerro Negro Calama (NMP x 100 ml). ESTACION AF P1 P2 P3 EF Muestreo x x x x x 10 3 Muestreo x x x x x 10 4 Muestreo x x x x x 10 4 Muestreo x x x x x 10 4 Muestreo x x x x x 10 4 Muestreo x x x x x 10 4

5 En la Tabla 2 se muestran los resultados de los Coliformes Fecales. Se observa que existe una menor proporción de Coliformes Fecales respecto a los Coliformes Totales, ya que en las aguas servidas que ingresan a la Laguna (estación AF), el número de los coliformes feclales fluctúa entre 2,5 a 8,5 x 10 6 Coliformes Fecales x 100 ml y disminuyen proporcialmente en las distintas etapas, encontrándose valores al final del tratamiento de las aguas (estación EF) entre 1,3 a 4,6 x 10 3 de Coliformes fecales x 100 ml de agua tratada. Tabla 2 Número más probable de Coliformes Fecales presentes en las aguas servidas de la Laguna de Estabilización de Cerro Negro Calama (NMP x 100 ml). ESTACION AF P1 P2 P3 EF Muestreo x x x x x 10 3 Muestreo x x x x x 10 4 Muestreo x x x x x 10 3 Muestreo x x x x x 10 2 Muestreo x x x x x 10 3 Muestreo x x x x x 10 3 En la tabla 3, se presentan la enumeración de los colifagos. El número de colifagos presentes en las aguas servidas que ingresan al sistema de tratamiento son menores son menores que coliformes fecales, su valores fluctúan entre 2,3 a 7.0 x 10 5 UFP x 100 ml de agua. Sin embargo, también son removidos en igual forma que los coliformes totales y fecales durante el tratamiento de las aguas. Al final del proceso, alcanzan entre 1,1 a 3,0 x 10 3 UFP x 100 ml de agua tratada. Tabla 3 Número de Colifagos presentes en las aguas servidas de la Laguna de Estabilización de Cerro Negro Calama (UFP x 100 ml). ESTACION AF P1 P2 P3 EF Muestreo x x x x x 10 3 Muestreo x x x x x 10 3 Muestreo x x x x x 10 3 Muestreo x x x x x 10 3 Muestreo x x x x x 10 3 Muestreo x x x x x 10 3

6 Con el objeto de comparar los resultados promedios de todos los microorganismos indicadores, éstos fueron incluídos en la Figura 2. En ella, se puede apreciar claramente como todos los indicadores microbiológicos son removidos eficientemente de las aguas servidas que ingresan a la Laguna de Estabilización, a valores que están dentro los requerimientos sanitarios para el uso de aguas tratadas en el regadío de hortalizas sin restricción. Figura 2 Valores promedios de los indicadores microbiológicos de contaminación fecal en aguas de la Laguna de Estabilización de Cerro Negro Calama. log x 100 ml AF P1 P2 P3 EF Estaciones de Muestreo C. Totales C. Fecales Colifagos DISCUSION El microorganismo ideal para ser usado como indicador de contaminación fecal debe estar siempre presente en lugar de los organismos patógenos, encontrándose cuantitativamente al menos como abundantes, además debe ser menos resistente a los tratamientos y tener una sobrevida mayor. Entre los indicadores, uno de los más utilizados es el índice de coliformes fecales, debido a su bajo costo, técnica simple y que puede usarse en cualquier laboratorio de rutina. Sin embargo, últimamente ha sido cuestionado por la falta de correlación con la presencia de bacterias patógenas, virus y parásitos (Toranzos y col, 1986). A pesar de ello, en nuestro estudio la determinación de los coliformes fecales representó un buen índice para evaluar la calidad bacteriológica de la Laguna de Estabilización de Cerro Negro Calama.

7 En este trabajo se comparó la técnica de los tubos múltiples para determinar el número de coliformes fecales y la enumeración de colifagos, virus que infectan a E. coli, en el control de aguas servidas tratadas. Al comparar sus resultados, en todos los ensayos realizados, el número de colifagos presenta un valor mas bajo aproximadamente en un logaritmo de los recuentos de coliformes fecales, pero ambos microorganismos fueron removidos eficientemente durante el tratamiento de las aguas servidas a valores muy similares. Los resultados obtenidos durante los 3 meses del estudio, demuestran claramente que los valores de los coliformes fecales y los colifagos disminuyeron proporcional a medida que el agua va siendo tratada en la Laguna de Estabilización de Cerro Negro Calama, aunque se aprecia que los colifagos son más resistentes al tratamiento. Esto permite señalar, que la enumeración de colifagos en las aguas servidas tratadas parece ser un buen método para establecer la remoción de bacterias y virus entéricos patógenos. El uso de sistemas de indicadores prácticos basados en la combinación de indicadores microbianos que permitan asegurar la eficiencia del tratamiento, ha sido sugerido por muchos investigadores (Havelaar y col, 1995; Castillo y col, 1990, Toranzos, 1990). CONCLUSIONES 1. Se concluye que la técnica de enumeración de colifagos en placa, es de fácil manejo y con resultados a las 6 horas de procesadas las muestras de aguas. Es una técnica que no requiere de muchos equipos y materiales, ya que basta con elementos mínimos de un Laboratorio de Microbiología Ambiental y solamente, es necesario contar con una cepa hospedera de colifagos, Escheriochia coli ATCC La enumeración de colifagos es un buen procedimiento alternativo que debe ser implementado para controlar la calidad bacteriológica de los sistemas de tratamientos de aguas servidas, pues es un buen indicador para establecer la remoción de los virus de las aguas de las aguas servidas tratadas, lo cual no es posible determinar con el índice de coliformes fecales. BIBLIOGRAFÍA. American Public Health Association. Standard methods for the examination of water. 18 th American Public health Association, Washington, DC Castillo, G., Trumper, B., Thiers, R. and Cañas, P. Coliphage and others indicators in stabilization ponds. Proc. Sec. Biennal Water Quality Symposium. Microbiological Aspects. Viña del Mar, El-Abagy, M.M. and Kamel, M.M. The coliphage test: a simple, rapid and economical methods of potable and natural water in Egypt. Wat. Quality Bull. 14: , Grabow, W.O.K. and Crobrough, P. Practical direct plaque assay for coliphages in 100 ml samples of drinking water. Appl. Environ. Microbiol. 52: , Havelaar, A.H. and Hogeboom, W.M. Factors affecting enumeration of coliphages in sewage and sewage poluted water. Antonie Leuwenhoek. 49: , 1983.

8 Havelaar, A.H. and Nieuwstand, T.J. Bacteriophage and fecal bacteria as indicators of colonization efficiency of biologically treated waste water. J. Water Pollut. Control. Fed. 57: , Hernández-Delgado, E.A., Sierra, M.L. and Toranzos, G.A. Coliphages as alternate indicators of fecal contamination in tropical waters. Proceedings Second Biennal Water Quality Symposium Microbiological Aspects. Viña del Mar, Chile Isbister, J.D., Simmonds, J.A., Scott, W.M. and Kitchen, J.F. A simplified method for coliphages detection in natural waters. Acta Microbiol. Pol. 32: , Ijzerman, M.M., Falkinhan III, J.O., Reneau Jr, R.B. and Hagedorm, C. Field evaluation of two colorimetric coliphages detection methods. Appl. Environ. Microbiol. 60: , Naranjo, J.E., De León, R., Gerba, C.P. and Rose, J.B. Monitoring for viruses and parasites in reclaimed waters. The Bench Sheet. 11: 8-10, Toranzos, GA., Hansen, H. And Gerba, CP. Ocurrence of enterovirus and rotavirus in drinking waters in Colombia. Water Sci. Tech. 18: , Toranzos, GA. Current and possible alternate indicators of fecal contamination in tropical waters: a short review. Proceedings Second Biennal Water Quality Symposium. Microbiological Aspects. Viña del Mar, Chile, 1990.