MANUAL DE LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS

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1 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BÁSICAS ACADEMIA DE MICROBIOLOGÍA MANUAL DE LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS PRIMERA EDICIÓN ELABORADO POR: REFUGIA PÉREZ SÁNCHEZ MIRIAM JUÁREZ JÚAREZ LEONOR PATRICIA RODRÍGUEZ PASCUAL SEGUNDA EDICIÓN ELABORADA POR: Refugia Pérez Sánchez Julio del

2 NOMBRE DEL ALUMNO: PROFESORES GRUPO: CARRERA: INGENIERÍA BIOTECNOLÓGICA Ciclo escolar: 2

3 ÍNDICE Índice 3 Instrucciones generales 4 Práctica No. 1 Microscopia 9 Práctica No. 2 Preparaciones fijas y en fresco 16 Práctica No. 3 Esterilización de material para microbiología 23 Práctica No. 4 Nutrición y cultivo de microorganismos aeróbicos 30 Práctica No. 5 Aislamiento y recuento de microorganismos aerobios 44 Práctica No. 6 Conservación de microorganismos 49 Práctica No. 7 Crecimiento microbiano 59 Practica No. 8 Producción de ácido láctico 67 Práctica No. 9 Cuantificación de microorganismos coliformes por la técnica del número más probable (NMP) 72 Practica No. 10 Identificación de bacterias aeróbicas 78 Practica No. 11 Identificación de mohos y levaduras 97 Práctica No. 12 Efecto de los factores fisicoquímicos sobre el crecimiento microbiano 106 Agares 119 Caldos 124 Medios semisólidos 129 Soluciones y reactivos 130 Colorantes y decolorantes 132 Nefelómetro de McFarland 134 Bibliografía (Normas Oficiales mexicanas) 135 3

4 INSTRUCCIONES GENERALES I.- EVALUACIÓN 1.- El laboratorio representa el 100 % del curso total y cada práctica se evalúa de la siguiente forma: Trabajo experimental: 20% Examen exploratorio 20% Examen escrito de conocimientos 20 % Discusión de la práctica: 20% Informe de la práctica 20 % 1. Objetivos 0.5 % 2. Análisis de resultados: 7% 3. Discusión: 7% 4. Conclusiones: 5% 5. Bibliografía: 0.5 % 2.- Para aprobar el curso de laboratorio se requiere haber asistido al 80% de las sesiones prácticas, aprobar el 80% de las prácticas efectuadas y obtener un promedio mínimo de seis. 3.- La calificación del trabajo práctico se obtendrá promediando las sesiones de las que conste la práctica. Si el alumno no cumple en alguna de las tres etapas, se le calificará con cero en la parte correspondiente. 4.- La calificación de cada departamental será el promedio de las calificaciones de las prácticas que estén dentro del periodo y el examen. 5.- Si un alumno no asiste a una sesión tendrá cero en trabajo práctico, si la justifica se mantiene la calificación, pero no se cuenta la falta para el computo final de asistencias. 6.- Se elige un reporte al azar de cada equipo, revisando que todos los alumnos miembros del equipo hayan elaborado el reporte. Si no es así el alumno que no lo presento tendrá cero. 7.- Cuando a un equipo le toque preparar los materiales para utilizarse en la práctica o bien la esterilización de material limpio y /o sucio y no lo realice tendrá cero en la práctica. II.- ORGANIZACIÓN CON LOS ALUMNOS 8.- Para asistir al laboratorio el alumno deberá traer: Una bata limpia y con botones Manual de laboratorio Dos asas bacteriológicas Una fotografía tamaño infantil Colores Un marcador indeleble de punto mediano 9.- El cuaderno de reporte de prácticas debe ser de tamaño profesional forrado de color blanco (2BM1), Negro (2BM2) y gris (2BM3) y en la portada se colocará una etiqueta con el título de la asignatura, el nombre de los tres alumnos que conforman el equipo, colocando en primer término el del dueño del cuaderno, de manera remarcada o con letra más grande y en la parte superior derecha se pondrá una etiqueta de 5 cm con el número de equipo. 4

5 Por equipo deberá traer: Un rollo de Masking tape Papel periódico 5 cm de altura Una tijera de punta recta Una pinza de punta roma Tres botes de lámina 250 g de algodón Una llave del candado Una esponja Una jeringa de 10 ml Una caja de portaobjetos Una regla graduada Un metro de franela Un jabón para las manos Dos frascos de boca ancha de vidrio Dos frascos largos de vidrio Una caja de ligas Cerillo o encendedor Un rollo de papel sanitario 250 ml de alcohol Una brocha de cerdas suaves 10.- Por sección Por sección se deberá traer un candado Jabón líquido para trastes Una caja de cubreobjetos Un barniz de uñas transparentes 11.- Por grupo deberá traer. Un rollo de gasa hospitalaria de 92 cm X 91 m con tejido de 20 X 12 tipo VII III.- DEL HORARIO Y COMPORTAMIENTO DE LOS ALUMNOS Se impartirán dos sesiones por semana de 3.0 horas cada una Cada sesión principiará y terminará a la hora indicada Se pasará lista cada día al empezar la práctica Se anotarán las faltas y asistencias con todo rigor y por ningún motivo se pondrán retardos Cuando el alumno abandone el laboratorio antes de terminar la práctica y sin el consentimiento del profesor, se considerará que no asistió a la práctica Las faltas al laboratorio se calificarán con cero La asistencia al laboratorio es obligatoria, ya que uno de los objetivos del trabajo práctico es que el alumno adquiera habilidades y destrezas. La lista de asistencia se efectuará a la hora indicada con una tolerancia de 10 minutos y con la bata debidamente abrochada. En caso de llegar ya no se le permitirá la entrada a menos que sea discusión con su correspondiente falta El reporte se entregará una semana después de realizada la discusión, excepto la práctica que este cercana al periodo de evaluación y no se permitirá que el reporte se entregue escrito todo o alguna fracción con lápiz, se sugiere el uso solo de colores negro, azul, rojo y en caso de esquemas lápices de colores El alumno utilizará el Manual de Prácticas de Laboratorio, obligatoriamente en cada sesión, apegándose a la metodología a seguir, así como a las instrucciones del profesor y corregirá lo que se vaya cambiando El material y equipo roto, deteriorado o extraviado, deberá ser repuesto por el equipo responsable, para ello tiene como mínimos una semana, de lo contrario el vale se irá al expediente del alumno. 5

6 22.- El alumno revisará el material que reciba y reportará cualquier anomalía antes de iniciar el trabajo práctico para evitar que se le responsabilice del material deteriorado que se le entregue Después de terminada la práctica, el material debe ser entregado limpio por el equipo responsable a la persona encargada del almacén Evitará su permanencia en el laboratorio después de terminada la práctica Se debe guardar el comportamiento adecuado para evitar accidentes, ya que el laboratorio es un lugar de trabajo donde se manejan cultivos y aparatos delicados La entrada de los alumnos al laboratorio en horas que no correspondan a la sesión, estará condicionada a la autorización del profesor responsable de la práctica, y en caso de retirar su material de la incubadora deberá traer bata, además traerá su material que va a necesitar Una vez esterilizado el material que contenga agar se dejará enfriar y posteriormente se depositará en una bolsa de plástico para su desecho Equipo que no traiga el material biológico solicitado en la práctica no se le permitirá la entrada. IV BREVES REGLAS DE SEGURIDAD PARA UN LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA 1.- Las reglas de seguridad son para TODAS las personas que estén en el laboratorio. 2.- Uso de bata de laboratorio. Las batas protegen de contaminaciones químicas o biológicas, por ello se recomienda su cambio al salir de laboratorio. 3.- Lavarse las manos al inicio y al final cada práctica: Recordar que se manejan microorganismos patógenos. 4.- El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Cualquier material que no se utilice en la realización de la práctica debe estar apartada del área de trabajo. Antes de comenzar desinfectar la superficie de trabajo. 5.- Prohibido comer, beber, fumar y mascar chicle. Cuando se manipulan microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la boca, nariz ojos u oídos. 6.- No se debe pipetear nunca con la boca. Utilizar siempre pipeteadores o pipetas automáticas. 7.- Evitar generar aerosoles que contengan microorganismos, ya que son fácilmente inhalados. Todas las operaciones bruscas como el manejo rápido de las asas pueden generar microparticulas que pueden ser inhaladas por el analista. Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la flama del mechero en un área de 15 cm o en una campana de seguridad. 8.- Evitar desplazarse en el laboratorio. 9.- Las ventanas deben estar cerradas, ya que las corrientes de aire originan contaminaciones en los cultivos El transporte y almacenamiento de placas y recipientes que contengan cultivos. Se debe realizar con una canastilla y si se saca de la incubadora o refrigerador, sacar dicho material de una sola vez y siempre colocar el material de forma segura para evitar que se caigan Bajo ningún concepto se deben sacar muestras contaminadas del laboratorio El material contaminado debe esterilizarse antes de procesarlos como residuos. El material de vidrio debe esterilizarse para luego lavarse, secarse y volverse a emplear El material de vidrio roto depositarlo en los contenedores específicos y designados en el laboratorio 14.- El botiquín de primeros auxilios está en el interlaboratorio 6

7 15.- La mesa de trabajo se debe limpiar con una esponja que contenga benzal como desinfectante, este proceso se hace antes y después de terminar la sesión de laboratorio En caso de accidente. Avisar inmediatamente al profesor, en caso de derrame del cultivo se deberá cubrir con un desinfectante y dejar actuar por cinco minutos, para luego limpiar con la esponja Tomar las precauciones necesarias en el suministro de gas, evitar la presencia de sustancias inflamables, revisar periódicamente las instalaciones y la flama del mechero beberá estar en azul, para ello el mechero cuenta con una entrada de la cantidad de aire con el que se obtiene una mezcla de aire-gas, de forma que la llama tenga oxigeno suficiente Incendio de disolventes. En el caso de que se produzca un accidente al incendiarse un solvente, nunca soplar, se deberá emplear una franela mojada para cubrir el recipiente. Si el fuego se extiende, usar el extintor dirigiéndolo a la base de las llamas Utilización de luz Ultravioleta. Nunca se debe mirar directamente el foco emisor, deberán protegerse los ojos con las gafas y cualquier zona de la piel expuesta a la radiación con guantes Durante el desarrollo de la práctica, queda prohibida la entrada de personas ajenas al grupo que visiten a los alumnos y a profesores Los alumnos con el pelo largo se lo recogerán, no se permite el uso de flecos Queda prohibido el uso de celulares y aparatos electrónicos durante el desarrollo de la práctica Al entrar al laboratorio evitar, traer chamarra, bufanda, guantes y la bata deberá estar abrochada. 7

8 Actividades: I.- Lectura y discusión de Normas Oficiales Mexicanas (NOM) A. NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental - Salud ambiental - Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y especificaciones de manejo. B. NOM-026-STPS-1998, Colores y señales de seguridad e higiene, e identificación de riesgos por fluidos conducidos en tuberías Desinfección del área de trabajo Código de colores (instalaciones de gas) Uso del contenedor para punzocortantes Botiquín Extinguidores C. Norma oficial mexicana NOM-120-SSA1-1994, bienes y servicios. prácticas de higiene y sanidad para el proceso de alimentos, bebidas no alcohólicas y alcohólicas. II.- Conocimiento del material básico de laboratorio a. Material de cristalería b. Uso del mechero III.- Equipo de laboratorio a. Cuarto de incubación b. Cuarto de refrigeración c. Incubadoras d. Balanza de dos platillos, granataria, digital y analítica e. Campana de flujo laminar f. Campana de extracción IV.- Material para la gaveta a. Frasco con benzal b. Frasco con alcohol c. Frasco con torundas d. Frasco con benzal para pipetas e. Varilla acodada y base de caja de Petri f. Frasco con benzal para material de desecho 8

9 PRÁCTICA No. 1 MICROSCOPÍA UNIDAD: I Normatividad en el laboratorio y microscopía 1. OBJETIVOS: 1.1 Objetivo general El alumno aprenderá a enfocar correctamente una preparación para ser observada en el microscopio compuesto, así como la forma correcta de utilizarlo 1.2 Objetivos específicos El alumno manejará la forma correcta de utilizar el microscopio compuesto El alumno realizará correctamente la técnica de iluminación de Köhler 2.- INTRODUCCIÓN El microscopio es un instrumento óptico que amplifica la imagen de un objeto pequeño. Es el instrumento que más se usa en los laboratorios que estudian los microorganismos. Mediante un sistema de lentes y fuentes de iluminación se puede hacer visible un objeto microscópico. Los microscopios pueden aumentar de 100 a cientos de miles de veces el tamaño original. Los diversos elementos que existen en la naturaleza, presentan tamaños, formas y composiciones distintas, la mayoría de ellas pueden verse, algunas a simple vista, y otras mediante instrumentos. Para poder observar a la célula es necesario recurrir a equipos como el microscopio, de este existen diversas variedades, los cuales están diseñados a lo que pretendemos observar y como ejemplo tenemos a: Microscopio óptico Es un instrumento (de un lente o varios lentes), que amplifica una imagen y permite la observación de mayores detalles de los posibles a simple vista. El microscopio más simple es una lente de aumento o un par de anteojos. El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para ver dos objetos separados estos deben estar como mínimo a esa distancia. El microscopio aumenta la imagen hasta el nivel de la retina, para captar la información. La resolución depende de la longitud de onda de la fuente luminosa, el espesor del espécimen, la calidad de la fijación y la intensidad de la coloración. Teóricamente la máxima resolución que se puede alcanzar es de 0,2 µm dada por una luz con longitud de onda de 540 nm, la cual pasa por un filtro verde (muy sensible por el ojo humano) y con objetos condensadores adecuados. El ocular aumenta la imagen producida por el objetivo, pero no puede aumentar la resolución. El microscopio compuesto esta formado por tres sistemas: 1. Sistema de iluminación; 2. Sistema óptico 3. Sistema mecánico. El sistema de iluminación corresponde a la fuente de luz y sus aditamentos para iluminar eficazmente la preparación y esta formado principalmente por la lámpara (6V), el diafragma de campo y el condensador (lente frontal, diafragma de iris y lente auxiliar) El sistema óptico esta formado por una serie de lentes de vidrio en los objetivos y oculares que permiten agrandar la imagen y esta formado por los objetivos, tubo y el ocular. El sistema mecánico esta formado por una serie de engranes y botones que permiten realizar el movimiento y cambio de las lentes así como el enfoque de la preparación y esta formado por la base, 9

10 estativo, tornillos macrométrico y micrométrico, platina, revolver y portarevolver. Función básica de cada parte del microscopio: a.- Sistema mecánico Base. Pieza metálica que sostiene a todo el aparato Estativo. Lugar de donde se debe tomar para trasladar al microscopio Platina. Es una plancha cuadrada y gruesa de metal con un orificio central en donde descansa la preparación, la cual es fijada por dos pequeñas pinzas, se puede mover hacia arriba y hacia abajo con los tornillos macrométrico y micrométrico por medio de un sistema de engranes. Posee escalas numéricas que permiten ubicar fácilmente la posición de lo que se observa y, al mismo tiempo, deslizar la preparación en forma de cruz (ejes X y Y) para su localización. Pinzas. Sirve para sujetar al portaobjetos. Tornillo macrométrico. Permite el enfoque mayor. Tornillo micrométrico. Permite el enfoque con precisión. Tubo del ocular. Sostiene el lente del ocular. Revolver: Es un dispositivo giratorio en donde se atornillan las lentes de los objetivos. Tubo binocular. Cada uno de los tubos contiene en el interior un sistema de prismas y espejos que dividen el haz de luz en dos haces, cada uno de los cuales se envía por separado a cada tubo, estos tubos se deslizan hacia los lados para ajustar la distancia interpupilar ya que cada persona posee una diferente separación entre sus ojos. Los microscopios binoculares tienen entre los tubos una escala grabada para poder ajustar la distancia y cada persona debe memorizar su valor de apertura interpupilar; uno de los tubos tiene el ocular fijo y el otro tiene un sistema mecánico que sube o baja. Para realizar el enfoque de cada ojo primero se enfoca con el tornillo micrométrico el tubo que tiene el ocular fijo y después se enfoca el que tiene el ocular móvil, pero en este caso sin mover el tornillo micrométrico, girando el ocular móvil hasta encontrar el foco. b.- Sistema de iluminación Lámpara. Es la encargada de proporcionar los haces de luz y tiene las siguientes características: 6V, 5-15 W ó 12 V, W Diafragma de campo. Esta situada en la base del microscopio y su función es la de regular el diámetro de la emisión de la luz a fin de que se ilumine solo el área de campo visual, es decir controla la cantidad de luz que atraviesa la preparación. Condensador. Es un sistema de tres lentes convergentes que concentran los rayos luminosos sobre el objeto a observar, el condensador utilizado es capaz de agrupar los rayos que provienen del foco y permite aprovechar toda la luz posible que inciden sobre él y los dirige hacia el plano focal del objeto. c. Sistema óptico Oculares.- El ocular es la parte óptica final externa, situados en el tubo a través de los cuales se obtiene la imagen final, el ocular tiene aumento propio (los aumentos son denominados con la letra X), en nuestro caso es de 10X. El ocular consta de una lente cercana al ojo, collar, tubo del ocular y una lente cercana al objetivo. Tubo.- El tubo es la parte óptica mecánica, situada en la parte superior del microscopio, este puede ser monocular o binocular, además está adaptada para poderle colocar una cámara fotográfica ó una 10

11 cámara de televisión. El tubo generalmente está diseñado para trabajar a una distancia mecánica fija entre ellos y este valor puede ser de 160 mm, el factor del tubo del microscopio a utilizar en el laboratorio es de 1,25X, dato que nos sirve para calcular el aumento total. Objetivos.- Son lentes que captan la imagen a observar, están construidos de cristal o fluorita, poseen aumento propio, apertura numérica y está diseñada para trabajar con diferentes campos. Todos los objetivos tienen anillos de colores y números grabados sobre el tubo metálico, que nos permite saber a detalle cuáles son sus ventajas, la disposición de estos caracteres es la siguiente: 1.- El anillo de color superior indica los aumentos (tabla 1) 2.- El lado superior izquierdo indica el número de aumentos 3.- El lado superior derecho la apertura numérica. 4.- El lado inferior la distancia mecánica 5.- El lado inferior derecho el espesor del cubreobjetos 6.- El anillo de color inferior indica en qué medio se hace la inmersión del objetivo (tabla 2) En ocasiones el objetivo puede traer en lugar de 0.17, el número 1, el cual indica que: Acepta cubreobjetos desde 0,17 a 0,22 mm de espesor, 10= No requiere cubreobjetos ó 0,11 0,27 = Es ajustable a diferentes espesores de los cubreobjetos, desde 0,11 mm hasta 0,27 mm. Anillo superior.- Los anillos de color cerca del anillo moleteado facilitan el reconocimiento del aumento: Correspondencia entre los aumentos y los anillos de colores Aumentos Color anillo superior 1.0X Negro 2.5 X Pardo 4.0 X Rojo 6.3 X Anaranjado 10 X Amarillo 16 X Verde claro 25 X Verde oscuro 40 X Azul claro 63 X Azul oscuro 100X Blanco Colores para el anillo inferior que indican en qué medio se debe hacer la inmersión del objetivo Carácter Sustancia Índice de Color del refracción anillo Oil Aceite 1,515 Negro W Agua 1,333 Blanco Glyz Glicerina 1,455 Anaranjado Metileno Yoduro de 1,740 metileno Amarillo Aumentos totales: El número total de aumentos que se puede lograr en un microscopio se obtiene multiplicando el número de aumentos que tiene el ocular por el número de aumentos que tiene el tubo y por el número de aumentos que tiene el objetivo con el que se esta observando. Distancia mecánica: Se llama distancia mecánica a la distancia que recorre a luz por el interior del microscopio desde que penetra por el objetivo, pasando por los tubos y espejos, hasta llegar al ocular, la distancia mecánica se mide desde la superficie de la rosca del objetivo hasta la base del ocular, esta distancia en el caso de nuestro microscopio es de 160 mm. Poder de resolución: El poder de resolución de una lente se define como la capacidad que tiene 11

12 para discernir entre dos puntos muy cercanos entre sí y que puedan verse separada. El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm, el microscopio óptico de 0,2 µ y el microscopio electrónico de 6 Ángstrom. Apertura numérica: Es una medida de la amplitud del cono luminoso que se forma por las lentes del microscopio, ya sea del condensador o del objetivo. Microscopio de contraste de fase Permite observar células sin colorear y resulta especialmente útil para células vivas. Este aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una célula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor índice de refracción experimenta una deflexión y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de anillos ópticos del objetivo y del condensador, anula la amplitud de la porción fuera de fase inicial del haz de luz y produce un contraste útil sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del espécimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto estos microscopios se utilizan para observar células vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados. La resolución de este microscopio no puede ser mejor que la del microscopio de campo oscuro porque emplea la misma fuente de longitud de onda, sin embargo puede detectar partículas individuales más pequeñas en las imágenes de campo oscuro, debido al contraste creado. Es útil para observar autorradiografías, cristales en la orina y para detectar espiroquetas en particular el Treponema pallidum microorganismo causante de la sífilis. Cada uno de los microscopios tiene una función determinada, en este y en este caso este tipo de microscopio utiliza un microscopio auxiliar y un filtro verde, además en este tipo de microscopio también se realiza la técnica de iluminación de Köhler 3. MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS 3.1 MATERIAL POR EQUIPO Microscopio compuesto Papel seda 3.2 REACTIVOS Aceite de inmersión 3.3 MATERIAL QUE DEBE TRAER EL ALUMNO Colores 4. DESARROLLO EXPERIMENTAL Preparaciones fijas de bacterias Atomizador con benzal a) Acudir con el profesor al cuarto donde están los microscopios. b) Transportar el microscopio de forma vertical tomándolo del brazo con una mano y en la otra la base. c) Colocar el microscopio sobre la mesa de trabajo, y observar si presenta alguna irregularidad en caso de presentarla informar al profesor (cable en mal estado, falta de un objetivo, etc.) d) Con una perilla retirar el polvo de la parte mecánica y de la parte óptica. e) Limpiar la parte mecánica del microscopio con una brocha de cerdas suaves. 12

13 f) Limpiar la parte óptica del microscopio con papel seda, nunca hacerlo con la bata. g) Se dará la clasificación del microscopio según el sistema mecánico, óptico y el de iluminación. h) Conectar el microscopio a la toma de corriente i) Bajo las instrucciones del profesor realizar la técnica de Köhler. 4.1 Cuidado y limpieza del microscopio Un proceso de limpieza debe considerar los siguientes aspectos: a) Para limpiar la parte óptica, se elimina primero las partículas de polvo, ya sea con un bulbo inyector de aire, un pincel o soplando fuertemente sobre la lente. b) Algunos solventes como la acetona disuelven los revestimientos de barniz, la pintura y aún el cemento de las molduras y los objetivos compuestos, por lo que no se deben usar. c) Las partes mecánicas se deben lubricar y se limpian por fuera con una brocha de cerdas suaves. Se enlistan algunos compuestos recomendados sólo para ciertas partes del microscopio. d) Espuma de jabón suave.- Solo para remover lo sucio de la superficie de instrumentos e) Agua destilada con algún detergente sin aditivos alcalinos.- para un prelimpiado de la óptica. f) Solución para limpiar la óptica.- etanol al 40 %, éter al 20 %, para limpiar superficies de la óptica o remover residuos de aceite de inmersión. 4.2 TÉCNICA DE ILUMINACIÓN DE KÖHLER A fin de evitar toda serie de inconvenientes y poder utilizar lámparas de filamento espirilado, Köhler propone un método que actualmente es utilizado. Su iluminación se forma de dos diafragmas: un diafragma denominado de campo, situado generalmente a nivel de la lámpara colectora y un diafragma llamado de abertura, situado generalmente debajo del condensador. Pasos a seguir para la iluminación de Köhler. 1.- Luz amarilla (bajo voltaje) 2.- Ajustar la distancia interpupilar 3.- Ajustar las dioptrías 4.- Abrir el diafragma de campo e iris Pasos a seguir para la iluminación de Köhler en un microscopio 5- Subir completamente el condensador con la lente frontal introducida 6.- Enfocar la preparación con el objetivo 4X o 10X y utilizando los tornillos macro y micrométrico 7.- Observar y cerrar el diafragma dispuesto en el pie del microscopio 8.- Bajar algo el condensador, hasta obtener máxima nitidez de la imagen del diafragma 13

14 9.- Centrar el diafragma de campo luminoso en el campo visual, recurriendo a los dos tornillos el condensador 10.- Abrir el diafragma de campo luminoso casi hasta el borde del campo visual, centrando con exactitud y abrirlo hasta que desaparezcas detrás del borde del campo visual Regular el contraste de la imagen con ayuda del diafragma del condensador Insertar el filtro azul, regular la intensidad de la luz con el control del voltaje A cada cambio de objetivo: enfocar con el micrométrico y contrastar con el diafragma del condensador Al utilizar objetivos panorámicos de bajo aumento rebatir la lente frontal del condensador sin alterar su altura. 4.3 OBSERVACIONES DE UNA PREPARACIÓN FIJA. a) Tomar una preparación y enfocarla a 10 y 40 X. b) Adicionarle aceite de inmersión y observarlo a 100 X c) Observar la preparación que contiene una bastante muestra y realizar el esquema biológico d) Ahora mover la preparación en la periferia donde hay poca cantidad de muestra y realizar un esquema, en donde se anote el aumento real e) Ahora colocar el filtro azul y observar nuevamente f) Compara y analiza lo realizado y concluye lo más conveniente. 5.- RESULTADOS Y CUESTIONARIO Esquematiza la preparación observada a 40 y 100X, anota el nombre de la muestra (etiqueta): 40x 100x Forma: Agrupación 14

15 5.1 Consulta la bibliografía y llena la siguiente tabla Tipo de microscopio Poder de resolución Aplicaciones Compuesto Contraste de fase Electrónico 5.2 En la siguiente tabla resume la función de cada una de las siguientes partes: Parte del microscopio Función Sistema al que pertenece (mecánico, óptico de iluminación) Condensador Diafragma Objetivo Filtro azul Lámpara Ocular Platina Revolver Tornillo macrométrico 6.- ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 6.1 Discutir las ventajas y desventajas de utilizar la iluminación de Köhler. 6.2 Discutir las ventajas y desventajas de un microscopio óptico, así como la cantidad de muestra que presente una preparación. 7.- CONCLUSIONES Elabora tus conclusiones tomando en consideración los objetivos de la práctica, los resultados obtenidos y la bibliografía consultada. 8.- BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA PARA LA ELABORACIÓN DE ESTA PRÁCTICA 8.1 Barrera E. Héctor El Microscopio Óptico 1ª edición Editores Plaza y Valdez, S.A. de C.V Freifelder, D. Técnicas de Bioquímica y Biología Molecular. Reverté Mexicana, S.A. de C.V Locquin Marcel, Manual de Microscopía I 1 edición, Ed. Labor S.A. 8.4 Rincón-Sánchez A.R.y Reyes Ortiz N. Manual de Microscopía Óptica 1ª edición Editado por la Asociación de Químicos del INN. 15

16 PRACTICA No. 2 PREPARACIONES FIJAS Y EN FRESCO UNIDAD I: Normatividad en el laboratorio y microscopía. 1. OBJETIVOS Objetivo general El alumno realizará preparaciones en fresco para ser observadas en el microscopio óptico, realizará preparaciones fijas para ser observada en el microscopio óptico. I.2 Objetivo específicos El alumno realizará una preparación en fresco de una muestra de agua estancada El alumno realizará varios frotis para realizar preparaciones fijas simples y diferenciales 2. INTRODUCCIÓN La gran mayoría de los microorganismos son invisibles para el ojo humano, por lo que el uso del microscopio resulta indispensable para observar a estos seres vivos. Para lograr una buena observación microscópica es necesario tomar en cuenta la preparación de la muestra, debido a que los objetos deben tener un cierto grado de contraste con el medio circundante para poder ser percibidos a través del microscopio, además de que los microorganismos carecen de una coloración natural, hay que teñirlos previamente para hacerlos resaltar de manera artificial del fondo de la imagen. Una forma de conseguir este contraste consiste en realizar tinciones simples con un colorante Tinción simple: En las tinciones simples se usa un único colorante, que siempre es de tipo básico, se utiliza solamente para incrementar el contraste de la célula que adsorberá el colorante y quedará teñido del mismo color. Tinción diferencial: Se utilizan una combinación de colorantes para dar diversos complejos coloridos y como ejemplo tenemos la tinción de Gram y la tinción de Ziehl-Neelsen. Tinciones específicas: Incrementan el contraste en las células microbianas y revelan estructuras particulares, entre las que se incluyen las endosporas, los flagelos y la cápsula. Estas técnicas se basan en la estructura que se desea poner de manifiesto tiene un grado de afinidad por los colores utilizados mayor que el resto de la célula. Las bacterias no teñidas muestran pocos detalles morfológicos, el diagnóstico bacteriológico generalmente se basa en las diferentes afinidades tintoriales de las bacterias para identificarlos más adecuadamente, Sin embargo, también resultan útiles las preparaciones no teñidas en la determinación de la movilidad. Aunque cuando tenemos la necesidad de observar preparaciones en fresco podemos utilizar el microscopio de contraste de fases, en donde la característica más importante de este tipo de microscopio es que nos permite ver a los microorganismos sin la necesidad de teñirlos. 3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO 3.1 EQUIPO Microscopio óptico 3.2 MATERIAL Portaobjetos Frasco gotero con solución de fucsina fenicada 16

17 Cubreobjetos Pipeta Pasteur Gradilla Un tubo de ensaye de 13 X 100 mm Asa bacteriológica Frasco gotero con solución de cristal violeta Frasco gotero con solución de lugol Frasco gotero con solución de alcohol acetona Frasco gotero con solución de safranina 3.3 CEPAS MICROBIANAS Staphylococus aureus Saccharomyces cerevisiae 3.4 MUESTRA BIOLÓGICA Muestra de agua estancada 4. DESARROLLO EXPERIMENTAL 4.1 Preparación de Frotis: Método A: Cultivo en tubo en medio sólido inclinado Procedimiento Frasco gotero con solución de alcohol ácido Frasco gotero con solución de azul de metileno Frasco gotero con solución de verde de malaquita Solución salina o agua de la llave Mechero Asa y porta asa Puente de coloración Gradilla metálica Lámpara de alcohol Escherichia coli Penicillium sp a) Limpiar el portaobjetos con una torunda con alcohol y que contenga alcohol. b) Colocar la etiqueta sobre la superficie superior del portaobjetos, la etiqueta será preferentemente pegada a la izquierda de la preparación, (si es necesario colocar otra del lado derecho), con la siguiente información: Nombre del microorganismo, el nombre de la tinción, el equipo, el grupo y la fecha. c) En la gradilla se tiene un tubo de ensaye de 13 X 100 mm con dos ml de agua, de ahí tomar con el asa una pequeña gota de agua y colocarla en el centro de la superficie de un portaobjetos. d) En el mechero, flamear el asa al rojo vivo y en un radio de 15 cm de la flama, abrir el tubo de ensaye y flamearlo, tomar la muestra con el asa, volver a flamear la boca del tubo y taparlo. Dejar el tubo sobre la gradilla y con la mano izquierda tomar el portaobjetos y con la mano derecha en la que tenemos el asa extender el inoculo aproximadamente un cm 2 para obtener una película delgada de microorganismos. Flamear el asa para esterilizarla. e) Dejar secar el frotis a temperatura ambiente. f) Fijar el frotis con calor, pasarlo rápidamente por la flama, luego colocarlo en el dorso de la mano, si soportamos el calor pasarlo nuevamente. Realizar esta operación una vez más. Dejar enfriar el portaobjetos antes de teñir. Método B: A partir de una suspensión microbiana a. Si se proporciona un tubo con una suspensión bacteriana, entonces encender el mechero. 17

18 b. En un radio de 20 cm abrir el tubo, flamearlo y con el asa tomar un inóculo de la suspensión. c. Flamear la boca del tubo de ensaye, cerrar el tubo y colocarlo en la gradilla d. Colocar el inóculo en el centro de un portaobjetos limpio. Extender el inóculo por lo menos 1 cm 2, y flamear el asa. Dejar secar el frotis y fijarlo al calor. 4.2 Examen en fresco de agua estancada y de una muestra con azul de algodón lactofenol a) De la muestra de agua estancada, colocar una gota en un portaobjetos limpio b) Con la pipeta Pasteur colocar en el centro una gota de la muestra y cubrirla con un cubreobjetos. c) Al colocarle el cubreobjetos dejarlo caer con un movimiento rápido para evitar formar burbujas. d) Observar al microscopio con el objetivo de 10 X y 40 X. e) Tomar un portaobjetos limpio y desengrasado y colocarle una gota de azul de algodón lactofenol. f) Con la ayuda del asa tomar un poco del cultivo del moho y colocarlo en el portaobjetos. g) Colocarle un cubreobjetos y si se prefiere sellarlo con barniz para conservar la preparación. h) Observar al microscopio y realizar un esquema. 4.3 Tinción simple a) Tomar la preparación fija de Saccharomyces cerevisiae y colocarla el colorante según el siguiente cuadro: b) Tomar el tiempo por 1 minuto Equipo Colorante 1 y 6 Cristal violeta 2 y 7 Azul de metileno 3 y 8 Safranina 4 y 9 Verde de malaquita 5 y 10 Lugol c) Enjuagar el portaobjetos en el recipiente que contiene el agua d) Dejar secar la preparación y observarla al microscopio con el objetivo de 40 y 100 X. 4.4 Tinciones diferenciales Tinción de Gram: a) Colocar los frotis correspondiente de cada uno de los microorganismos Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus y Saccharomyces cerevisiae, en el puente de coloración. b) Cubrir los frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto. c) Lavar los frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante. d) Cubrir los frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto. e) Lavar los frotis con agua de la llave. f) Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (decolorante) durante 15 segundos. g) Lavar inmediatamente con agua de la llave. 18

19 h) Cubrir los frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos i) Lavar los frotis con agua de la llave. j) Dejar secar los frotis, colocar una gota de aceite de inmersión y observarlos al microscopio con el objetivo de 100X. (Previamente realizar la técnica de iluminación de Köhler y enfocar a 10 y 40X) 4.5 Tinción de Gram con exceso de decoloración Colocar un frotis fijado de Bacillus subtilis y de Escherichia coli en el puente de coloración. a) Cubrir los frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto. b) Lavar los frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante. c) Cubrir los frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto. d) Lavar los frotis con agua de la llave. e) Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (decolorante) durante 90 segundos. f) Lavar inmediatamente con agua de la llave. g) Cubrir los frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos h) Lavar los frotis con agua de la llave. i) Dejar secar el frotis, colocar una gota de aceite de inmersión y observarlos al microscopio a 100 X. 4.6 Tinción de Gram aplicada a una suspensión de microorganismos: a) Colocar un frotis fijado de una mezcla de Escherichia coli y Staphylococcus aureus. b) Cubrir el frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto. c) Lavar el frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante. d) Cubrir el frotis con lugol (mordente) durante un minuto. e) Lavar el frotis con agua de la llave. f) Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (decolorante) durante 30 segundos. g) Lavar inmediatamente con agua de la llave. h) Cubrir el frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos i) Lavar el frotis con agua de la llave. j) Dejar secar el frotis, colocar una gota de aceite y observar al microscopio con el objetivo de 100 X. 4.7 Tinción de Ziehl-Neelsen. a. Colocar el frotis correspondiente en el puente de coloración b. Cubrir los frotis con fucsina-fenicada y calentar con una lámpara de alcohol, hasta que emita vapores, aplicar calor periódicamente durante cinco minutos sin que se seque la preparación y esperar a que se enfríe. c. Enjuagar con agua de la llave. d. Cubrir los frotis con alcohol ácido por un minuto. e. Enjuagar con agua de la llave. f. Cubrir los frotis con azul de metileno por un minuto g. Enjuagar y dejar secar los frotis y observarlos con el microscopio utilizando lente de inmersión 19

20 4.8 Tinción específica Tinción de Shaeffer Fulton a. Cubrir el frotis correspondiente con verde de malaquita y calentar con una lámpara de alcohol, hasta que emita vapores, aplicar calor periódicamente durante cinco minutos, sin que se seque la preparación. b. Dejar que el frotis se enfríe y lavar con agua de la llave. c. Cubrir el frotis con safranina por un minuto. d. Enjuagar, dejar secar y observar con el microscopio utilizando lente de inmersión. Diferentes tipos de posición de las esporas En la realización de las tinciones podemos tener ciertos errores como son: b) Edad del cultivo: Un microorganismo Gram positivo de un cultivo joven presenta una pared celular sin alteración. El mismo microorganismo, si sufre daño en la pared por alguna causa puede teñirse y observarse como una bacteria Gram negativa. Esto indica la importancia de la pared para la retención o salida del colorante. c) Tinción de Gram decolorada: Esto nos ocurre cuando dejamos actuar por más de 30 segundos el alcohol-acetona, entonces la preparación resultará Gram negativa, debido al tiempo prolongado de exposición con el decolorante. 5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO 5.1 Realiza el esquema de la preparación en fresco. 5.2 En tu reporte realiza un esquema de lo observado en el microscopio de cada una de las observaciones, anotando el aumento real, y el nombre de las estructuras observadas. Aumento Agua estancada Tinción Simple Tinciónes diferenciales Gram Gram decolorada Mezcla de microorganismos Ziehl- Neelsen Tinción específica Shaeffer y Fulton 40X 100X 5.3 Cuales son los inconvenientes al realizar un frotis con una gran carga microbiana? 5.4 Cual es la finalidad de observar una muestra en fresco? 20

21 5.5 Por qué se coloca un cubreobjetos sobre la muestra? 5.6 Cuál es el propósito de fijar los frotis con calor? 5.7 Cómo afecta la edad del cultivo en la técnica de Gram? 5.8 Por qué la tinción de Gram no se emplea para teñir mohos? 5.9 Cuando es recomendable utilizar una preparación simple y que colorante utilizarías? 6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 6.1 Discutir cuales son los inconvenientes de tener una preparación en fresco y una preparación fija, así como el tiempo que nos dura dicha preparación para su correcta observación. 7. CONCLUSIONES 7.1 Elaborar las conclusiones con base al análisis y discusión de las ventajas y desventajas en la realización de preparaciones en fresco y fijas, así como a la bibliografía consultada y los objetivos de la práctica. 8 BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA PARA LA ELABORACIÓN DE ESTA PRÁCTICA 8.1 Lymch, M.J.; S.S. Raphael: L. D. Mellor; D.D. Spare, M. J., Inwood. Métodos de Laboratorio. 2ª Edición. Interamericana. México pags. 21

22 UNIDAD II: Esterilización 1. OBJETIVOS 1.1 Objetivo general PRACTICA No. 3 ESTERILIZACIÓN DE MATERIAL PARA MICROBIOLOGÍA El alumno preparará material de uso en microbiología para su esterilización y elegirá el método adecuado de acuerdo al tipo de material o sustancia. I.2 Objetivo específicos El alumno preparará el material de vidrio e instrumental para esterilizarlo por calor seco y húmedo El alumno esterilizará el material previamente preparado, por calor seco y calor húmedo El alumno realizará el proceso de filtración a través de membrana El alumno utilizará bioindicadores de acuerdo al método empleado. 2. INTRODUCCIÓN La esterilización se conoce como un proceso de destruir a todos los microorganismo de una superficie, existen varios métodos físicos y químicos de esterilización, para seleccionar el más adecuado es necesario conocer la naturaleza del material, aunque algunos pueden tener varias formas de esterilización. 1 Métodos físicos Calor húmedo: La aplicación de calor húmedo es el método más simple para esterilizar un material, a condición de que no sufra daño en sí mismo. Una temperatura de 100 C matará a todas las formas vegetativas, pero no las esporas, para matar a estas es necesario una temperatura de 121 C, 15 minutos y 15 libras de presión en una autoclave. La muerte microbiana se produce por la desnaturalización de las proteínas, generalmente se utiliza vapor, tanto porque las bacterias se mueren más rápidamente cuando se encuentran húmedas como porque el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en todas las partes del recipiente. Calor seco: Para esterilizar materiales que deben permanecer secos se dispone de hornos eléctricos por los que circula aire caliente, en vista de que el calor es menos eficaz en materiales secos, se aplica una temperatura de C durante una h. El calor como método de esterilización actúa desnaturalizando las proteínas y los ácidos nucleicos de la célula y fragmentando las membranas celulares. Flameo: La llama es un agente esterilizador eficaz, y el más simple de todos. Es frecuentemente utilizado para esterilizar el asa bacteriológica para sembrar o resembrar un cultivo. Al flamear el asa, debe evitarse de ser posible, que dicha asa lleve grandes cantidades de material biológico, pues éste podría saltar diseminándose partículas infectantes. 22

23 A veces para instrumentos como tijeras, hojas de bisturí o pinzas, se puede esterilizar el material mojándolo con alcohol y encendiéndolo éste. Se debe repetir varias veces para lograr una esterilización completa. El método es rápido pero produce carbonización y pérdida del filo. Radiaciones ionizante y no ionizante: La radiación ultravioleta provoca daño en el DNA, la luz ultravioleta induce el entrecruzamiento entre pirimidinas adyacentes en una u otra de las dos tiras de polinucleótidos, formando dímeros pirimidínicos, las radiaciones ionizantes producen roturas en las tiras sencillas y en las dobles. Pueden emplearse también ondas supersónicas o ultrasónicas para romper o desintegrar a la célula. Filtración a través de Membranas Algunas sustancias no pueden ser esterilizadas por calor húmedo o seco pues son termolábiles, es decir que se desnaturalizan o que pierden alguna propiedad deseable, en tal caso se utilizan sistemas de filtración de membranas para retener a los microorganismos. Aquí debemos de conocer las dimensiones del microorganismo a eliminar para poder utilizar el filtro adecuado (diámetro). Los filtros utilizados son fabricados con porcelana, cuarzo, tierra de diatomeas, vidrio pulverizado, asbesto o esteres de celulosa, para el caso de los filtros de la marca Millipore se utiliza como bioindicador a Pseudomonas diminuta para filtros con un diámetro de poro de 0,45 µm 2 Métodos químicos Gases (oxido de etileno) y líquidos (formaldehído y propiolactona) Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrógeno lábiles como los que tiene grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos e hidroxilos. Es utilizado en la esterilización gaseosa, generalmente en la industria farmacéutica, sirve para esterilizar material termosensible como el plástico, equipos electrónicos, bombas cardiorrespiratorias. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo y además cancerígeno, por lo que se suministra normalmente con una concentración entre el 10 y el 20 % de CO 2. La concentración de óxido de etileno, la humedad y la temperatura influyen sobre la velocidad de esterilización. Un objeto limpio puede esterilizarse si se trata de 5 a 8 h a 38 C o de 3 a 4 h a 54 C, cuando la humedad relativa se mantiene entre el 40 y el 50 % y la concentración de oxido de etileno es de 700 mg/l. Una vez esterilizado el material es necesario airear para eliminar el oxido de etileno residual porque es muy tóxico. La -propiolactona se emplea para esterilizar vacunas y suero, se degrada hasta una forma inactiva después de varias h y, por ello, no es tan difícil de eliminar. Destruye a los microorganismos más rápidamente que el oxido de etileno, pero no penetra tan bien en los materiales y puede ser cancerígena. 3 Métodos bacteriológicos para verificar las técnicas de esterilización (Pruebas de esterilidad). En todo lugar en donde se realice esterilización se debe de contar con indicadores de calidad que manifiesten que la esterilización se ha llevado correctamente y que dicho material se encuentra estéril, para ello existen en el mercado varios indicadores que se introducen con el material a esterilizar y posteriormente se verifica un cambio de color o turbidez de la ampolleta. Método de la tira de papel Existen en el mercado tiras impregnadas con esporas de Geobacillus stearothermophilus se presentan en una envoltura con dos compartimientos. En el primero está la tira testigo, que se ha esterilizado (testigo negativo) y en el otro compartimiento se encuentran dos tiras, una de las tiras se 23

24 saca (problema y testigo positivo) y se coloca en un recipiente que se va a esterilizar en la forma habitual. Luego las tiras se vuelven a su compartimiento correspondiente y se incuban por 7 días a 55 C en caldo de soya y tripticaseína. Las esporas sobre las tiras testigos se desarrollan, pero si la esterilización no fue la correcta habrá desarrollo en la tira testigo. Método de la ampolleta: Son ampolletas que contiene una suspensión de Geobacillus stearothermophilus en medio de cultivo. La temperatura óptima para el desarrollo de este microorganismo se encuentra entre 50 y 65 C; dentro del medio líquido se encuentra un indicador que es el púrpura de bromocresol. Al utilizarla se debe colocar la ampolleta en el interior del compartimiento que va a esterilizar el material, después de terminar la esterilización, las ampolletas (sin abrir) se incuban entre 55 y 65 C durante 24 h, el enturbamiento y la aparición de un color amarillo indica una esterilización defectuosa, en cambio si el color permanece igual durante varios días de incubación el equipo está funcionando bien. Debe llevarse el control constituido por una ampolleta que no se pone en el equipo, incubada en las mismas condiciones, debe mostrar desarrollo bacteriano y el medio se vuelve amarillo. Métodos físicos para esterilizar: A veces, para instrumentos como hojas de bisturí, tijeras o pinzas, se puede esterilizar el material mojándolo con alcohol y encendiendo éste. Se debe repetir varias veces para lograr una esterilización completa. El método tiene la ventaja de ser rápido peor se produce carbonización y perdida de filo. Pueden emplearse ondas supersónicas o ultrasónicas de 9000 ciclos / s, para romper y desintegrar las células. Se cree que las bacterias se dañan y destruyen por la formación de pequeñas burbujas de gas en la suspensión a consecuencia de las ondas sonoras. 3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO 3.1 EQUIPO Autoclave a 121 C Autoclave a 110 C Horno a 170 C Incubadora a 35 C Baño María a 55 C Termómetros de 150 y 200 C 3.2 MATERIAL (Material para demostración del profesor por sección) Dos botes de lámina Un cilindro pipetero Un cilindro para cajas de Petri Dos filtros estériles swinnex con empaque Tres matraces de 125 ml con 50 ml de CN estéril Contenedor para punzocortantes Material por equipo Tres cuadros de papel aluminio de 8X8 cm para tapón de tubo Tres cuadros de papel aluminio de 20X20 cm para envolver pinza o tijera Tres cuadros de papel aluminio de 12X12 cm para tapón de matraz Una jeringa de 5 ml Una pinza de disección Una tijera de disección Un matraz de 125 ml con 50 ml de suspensión de Escherichia coli (suspensión turbia) Frasco con benzal Una tira de 3 X 0,5 cm impregnada con esporas de Geobacillus stearothermophilus Dos tubos de 16 X 150 mm sin tapón. Cuatro cajas de Petri limpias Tres pipetas de 10 ml limpias 24

25 Tres cuadros de papel Kraf de 18X14 cm para gorro de matraz Tres cuadros de papel Kraf de 15X25 cm para gorro de matraz Tres cuadros de papel Kraft de 20 X 20 cm para cubrir un bote de lámina. Tres cuadros de papel Kraf de 6 X 60 cm para envoltura de pipeta de 10 ml. Tres cuadros de papel Kraf de 33 X 40 cm para caja de Petri Tres cuadros de papel Kraf de 22x22 cm para envoltura de pinza o tijera. Tres cuadros de gasa doble de 12X20 cm para tapón de matraz. Tres cuadros de gasa doble de 15 X 25 cm para tapón de matraz. Un clip o aguja de disección Cuatro matraces de 125 ml Un matraz de 250 ml. Algodón suficiente para tapones de matraces Tres tubos de ensaye de 13 X 100 mm sin tapón Un tubo de ensaye de 13 x 100 sin tapón Dos tubos de ensaye con 3 ml de caldo nutritivo sin esterilizar (se preparan el día de la práctica) Tres tubos de ensaye con 3 ml de caldo nutritivo estéril Un frasco con alcohol Cuatro matraces con 50 ml de caldo nutritivo estéril Tres cuadros de gasa doble de 7 X 15 cm para tapón de tubo 3.3 MEDIOS DE CULTIVO Caldo nutritivo 3.4 CEPAS MICROBIANAS Reactivos comerciales (esporas indicadoras de esterilización). Ampolletas con un disco con esporas. Un matraz con 50 ml de una suspensión microbiana de Escherichia coli 4. DESARROLLO EXPERIMENTAL PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN 4.1 Lavado de material de vidrio e instrumental a) Utilizando escobillones para pipetas, tubos y matraces y una fibra suave para las cajas de Petri, el material plano y el instrumental metálico lavar el material que se va a esterilizar, utilizando de preferencia extran. b) Enjuagar suficientemente con agua de la llave c) Enjuagar con agua destilada, escurrir y secar en el horno o dejarlos secar a temperatura ambiente. 4.2 PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO TUBOS DE ENSAYO a. Tapar 2 tubos de 16 x 150 mm con tapones de algodón siguiendo las indicaciones del profesor b. Colocar los tubos en un bote de lámina, taparlos con papel Kraft y asegurarlos con una liga, anotar fecha, equipo, grupo, medida de los tubos y cantidad preparada CAJAS DE PETRI a) Envolver 8 cajas de Petri con papel Kraft siguiendo las indicaciones del profesor. Anotar en el papel, la cantidad de cajas envueltas, fecha, equipo, número de equipo de laboratorio y grupo. 25

26 4.2.3 PIPETAS a. Colocar en la boquilla de cada una de las pipetas un tapón de algodón cuidando que no quede muy compactado, utilizar para ello una aguja de disección o un clip b. Flamear en la flama del mechero las boquillas de las pipetas a fin de eliminar el exceso de algodón c. Envolver de manera individual cada una de las pipetas con una tira de papel Kraft, fijar el extremo con masking-tape y anotar sobre el papel la capacidad de la pipeta, la fecha, el grupo y el número de equipo de laboratorio. Con una fecha indicar el sentido de la punta de la pipeta MATRACES a. Colocar en la boca de cada matraz un tapón compacto de algodón, envuelto con gasa, siguiendo las instrucciones del profesor. b. Con papel Kraft, elaborar un gorro ligeramente más grande que el tapón de algodón. c. En una tira de Masking-tape anotar la fecha, grupo y equipo, adherir el Masking-tape al matraz. No anotar los datos sobre el gorro de papel PINZAS Y TIJERAS a. Envolver con papel Kraft una pinza o tijera y con lápiz señalar con una flecha la punta. b. Anotar en el papel la pieza de que se trate, la fecha, grupo y equipo. 4.3 PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO TUBOS DE ENSAYE a. Colocar en 2 tubos de ensaye, una cubierta de papel aluminio y colocarlos en una canastilla metálica. b. Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, grupo y equipo, sujetar el papel con masking-tape. c. Los tubos o frascos con tapa de baquelita, nunca deben cerrarse completamente CAJAS DE PETRI a. Colocar en el interior de un cilindro de acero inoxidable para cajas de Petri dos cajas en posición invertida perfectamente secas. (NUNCA ESTERILIZAR POR ESTE MÉTODO MATERIAL CONTAMINADO) b. Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, el número de cajas que contiene el cilindro, el grupo y la fecha. Colocar la tira de papel entre la tapa del cilindro PIPETAS a. Poner en la boquilla de cada una de las pipetas un tapón de algodón cuidando que no quede muy compactado. b. Flamear las boquillas en la flama a fin de eliminar el exceso de algodón. c. Colocar en el interior de un cilindro pipetero, las pipetas preparadas. d. Anotar en una tira de papel Kraft la cantidad de pipetas, su capacidad, fecha, grupo y equipo. Fijar la tira entre la tapa del cilindro pipetero MATRACES a) Colocar en la boca de un matraz de 125 ml una tapa de papel aluminio. b) En una tira de papel Kraft anotar fecha, grupo y equipo. Fijar la tira al cuello del matraz sujetándolo con masking-tape o etiquetar con un marcador indeleble. 26

27 4.3.5 PINZAS Y TIJERAS a) Envolver en papel aluminio una pinza o una tijera. b) En una tira de masking-tape, anotar fecha, grupo y equipo. Fijar el masking-tape a la envoltura REDUCCIÓN DE LA CARGA MICROBIANA (PROCEDIMIENTO DE ESTERILIZACIÒN POR CALOR HUMEDO) a. En un tubo de ensaye de 13 X 100 mm con 3 ml de caldo nutritivo estéril etiquetarlo. (Etiqueta con la siguiente información, grupo, equipo, temperatura efectuada y fecha) y colocarle una tira de esporas de Geobacillus stearothermophilus. b. Someterlo a una presión de 10 libras por 10 minutos. c. Sacar el tubo e incubar el tubo a 55 o C 2 C durante 5 días en baño maría y observar diariamente durante el tiempo señalado. Anotar en la bitácora de laboratorio cualquier cambio en cuanto a la aparición de turbidez. 4.5 ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO a) Tomar un tubo de de 13 X 100 mm con 3 ml de caldo nutritivo estéril y etiquetarlo b) En un tubo de 13 X 100 mm con 3 ml de caldo nutritivo colocar una tira de esporas de Geobacillus sthearothermophilus, cerrar el tubo y esterilizarlo a 121 C, 15 min y 15 lb. c) Sacar el tubo e incubarlo a 55 o C 2 C por 5 días en baño maría y observar diariamente. Anotar en la bitácora cualquier cambio en cuanto a la aparición de turbidez. Pasos para realizar una buena esterilización: -Tener cuidado de eliminar todo el aire del autoclave. -Colocar agua suficiente hasta el nivel de la rejilla o en la marca de la autoclave vertical - -Observar que el manómetro registre la presión -Si se está utilizando la autoclave vertical utilizar agua destilada. -Al terminar de esterilizar dejar el autoclave sin agua 4.6 ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO a. Encender el horno una hora antes y colocar el material para esterilizar por calor seco, cuando la temperatura este a 170 o C tomar el tiempo de 1 h, verificando que la temperatura sea la indicada. b. En un tubo de ensaye sin esterilizar y vacío, colocar una tira de papel filtro que contenga esporas de Bacillus subtilis var. niger, cubrir el tubo con papel aluminio y colocarlo junto con el material a esterilizar. Esterilizar a 170 o C/1 h, etiqueta el tubo de preferencia con un marcador indeleble. c. Después de transcurrido el tiempo de esterilización, apagar el horno y esperar a que el termómetro indique la temperatura ambiente. Abrir, retirar el material y el tubo de ensaye con la tira de esporas. d. Con ayuda de la pinza estéril (flamear con alcohol) y bajo condiciones de esterilidad, colocar la tira de papel filtro conteniendo las esporas de Bacillus subtilis a un tubo de ensaye que contenga 3 ml de caldo nutritivo estéril y etiquetado. Incubar a 55 2 o C durante 5 días. Observar diario y anotar cualquier cambio en cuanto a la aparición de turbidez. 4.7 CONTROL POSITIVO Y CONTROL NEGATIVO a) Colocar un tubo con 3 ml de caldo nutritivo estéril con una tira de esporas de Geobacillus stearothermophilus como testigo positivo del procedimiento. 27

28 b) Colocar un tubo con 3 ml de caldo nutritivo estéril sin tira de esporas, es el testigo (-). 4.8 PROCESO DE FILTRACIÓN A TRAVÉS DE MEMBRANA Sistema de filtración Swinnex marca Millipore a. Colocar 10 ml de la sustancia a filtrar en una jeringa desechable, remover el swinnex estéril del empaque de papel al que previamente se le ha colocado la membrana y ensamblar la jeringa. b. Filtrar gota a gota y recibir el filtrado en un matraz con caldo nutritivo estéril, la jeringa y el filtro colocarlo en un bote de lámina para su esterilización. Incubar el filtrado a 35 2 o C de 48 a 72 h. c. Observar diariamente y anotar en la bitácora del laboratorio cualquier cambio en cuanto a la aparición de turbidez durante 3 días. d. El bioindicador utilizado en la filtración a través de membrana es Pseudomonas diminuta, para membranas con un diámetro de poro de 0,2 m Esterilización de material de desecho -El material (pipetas o cajas de Petri) utilizado con suspensiones microbianas o con medio de cultivo, nunca se esterilizan por calor seco -5. CUESTIONARIO 5.1 Cuál es la finalidad de utilizar agua destilada en el enjuagado del material? 5.2. Porque utilizamos el papel Kraft para envolver el material? 5.3 Completa el siguiente cuadro, anotando si hubo no turbidez en los tubos Método Tratamiento 110 C/10 10 lb Calor húmedo 121 C/15 /15lb Calor seco 170 C/2 h Filtración través membrana a de Control positivo Control negativo Resultado (turbidez) 5.4 Explicar por qué utilizamos un tapón de algodón en las pipetas, en matraces y tubos de ensaye 5.5 Qué explicación darías si después de la esterilización, el tubo que contiene la tira de esporas hay crecimiento después de la incubación. 6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 6.1 Discutir cuales son los inconvenientes o riesgos de preparar el material con papel aluminio y papel Kraf para su esterilización por calor seco y húmedo. 7. CONCLUSIONES 7.1 Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al análisis y discusión de estos, así como a la bibliografía consultada y los objetivos de la práctica. 8. BIBLIOGRAFÍA 8.1 Enlistar la bibliografía consultada 28

29 PRACTICA No.4 NUTRICIÓN Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS AERÓBICOS No. DE UNIDAD: III Nutrición y Cultivo Microbiano 1.- OBJETIVOS 1.1 Objetivo General. El alumno preparará diferentes medios de cultivo en base a sus componentes, uso y consistencia, utilizando la NOM-065 SSA Que establece las especificaciones sanitarias de los medios de cultivo y los utilizará para cultivar microorganismos. 1.2 Objetivos específicos 2.1 El alumno preparará medios de cultivos complejos, diferenciales, enriquecidos, indicadores y sintéticos de acuerdo a la NOM 065-SSA-1993, a las necesidades nutricionales de un microorganismo, los esterilizará y vaciará para su uso. 2.2 Utilizará los medios de cultivo de acuerdo a su presentación final para cultivar microorganismos y comparará el crecimiento de acuerdo a la clasificación. 2.- INTRODUCCIÓN Las células están formadas por grandes cantidades de pequeñas moléculas como agua, iones inorgánicos, carbohidratos y aminoácidos y contienen un número todavía más pequeño de moléculas grandes, los polímeros de las células, siendo los más importantes las proteínas y los ácidos nucleicos. La célula puede obtener la mayoría de las moléculas pequeñas de su medio ambiente de manera preformada, mientras que las grandes moléculas son sintetizadas dentro de ellas. Existen complejas interrelaciones entre los compuestos incorporados por la célula y los que son sintetizados. Nutrición. A las sustancias en el medio ambiente utilizadas por los organismos para el catabolismo y el anabolismo se les llama nutrientes, y pueden dividirse en dos clases: a.- Nutrientes necesarios, sin los cuales la célula no podría crecer. b.- Nutrientes útiles pero no indispensables, que se emplean si están presentes pero no son esenciales. Algunos nutrientes son monómeros a partir de los cuales las células forman las macromoléculas y otras estructuras, mientras que otros nutrientes sirven solo para la obtención de energía sin ser incorporados directamente en las sustancias celulares, aunque en ocasiones un nutriente puede desempeñar ambas funciones. Las sustancias pueden dividirse en dos grupos: macronutrientes y micronutrientes, dependiendo de si son necesarios en cantidades grandes o pequeñas respectivamente y factores de crecimiento como compuestos orgánicos, vitaminas, ácidos orgánicos etc. Es fácil detectar cuando se requiere un macronutriente, simplemente porque se necesita en gran proporción. Frecuentemente los micronutrientes son necesarios en cantidades tan pequeñas que es imposible determinar cuánto se requiere; muchas veces ni siquiera se sospecha que un micronutriente esté presente en el medio en que un microorganismo está creciendo, debido a que los componentes del medio pueden contener tales micronutrientes en pequeña cantidad como contaminantes. Los microorganismos se desarrollan a partir de sustancias nutritivas que obtienen del medio que las rodea. Los microorganismos se desarrollan en medios de cultivo que contienen los nutrimentos adecuados para cada uno y requeridos para la síntesis de sus constituyentes celulares, además estos medios proporcionan las condiciones de ph, osmolaridad y humedad que le permiten crecer. 29

30 Existe una gran diversidad de sustancias que pueden utilizarse en la preparación de medios de cultivo, formulado con un fin específico, y el cual deberá contener: a) Fuente de carbono b) Fuente de nitrógeno c) Fuente de azufre d) Factores de crecimiento (que actúan como cofactores, oligoelementos como aminoácidos o vitaminas que no pueden sintetizar) e) Fuente de enriquecimiento para microorganismos exigentes (huevo, sangre, suero etc). f) Inhibidores de crecimiento microbiano como los colorantes, sales biliares, detergentes, antibióticos o metales pesados. g) Indicadores de potencial oxido-reducción. h) Agar como el agente gelificante o soporte. Medios de cultivo: Según la NOM-065-SSA Que establece las especificaciones sanitarias de los medios de cultivo. Generalidades. Medios selectivos. Son medios que contienen sustancias que impiden el desarrollo de algunos microorganismos, pero en una flora mixta permiten el aislamiento y recuperación del germen o grupo de gérmenes de interés. Medios selectivos de enriquecimiento. Son medios líquidos que estimulan la multiplicación de algún germen determinado e impiden o inhiben la reproducción de otros. Medios diferenciales. Son aquellos que contienen indicadores de ácido base, redox o sustancias que detectan cambios en el medio o en las características típicas de las colonias. Medios para cultivar gérmenes anaeróbicos. Son medios de cultivo para aquellos gérmenes que requieran condiciones de anaerobiosis o de microaerofilia. Medios de transporte. Sirven para transportar los especímenes que contienen a los microorganismos, del sitio de la toma del producto hasta el laboratorio donde va a efectuarse el estudio. Estos medios impiden que se altere la proporción original de la flora microbiana en los especímenes. Medios para filtración a través de membrana. Pueden ser líquidos o sólidos. En el primer caso, se preparan a la concentración usual y permiten el crecimiento de microorganismos presentes en la membrana. Los medios sólidos tienen un contenido mínimo de agar para favorecer la difusión de nutrientes del medio de la membrana. Medios especiales para cultivo de hongos y levaduras. En el caso de los hongos, el medio de cultivo que más se utiliza es el agar de papa y dextrosa, ya que tiene un ph de 3,5 lo que inhibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias. Este medio puede ser más selectivo al adicionarle ciertos antibióticos tales como: cloranfenicol, eritromicina o gentamicina; para eliminar los hongos filamentosos de rápido crecimiento se adiciona cicloheximida (este medio se llama mycosel o micobiótico). Se emplea también el medio de agar extracto de malta y el agar rosa de bengala se emplea para inhibir el crecimiento radial de hongos con micelio cenocítico. En la formulación de un medio de cultivo deben considerarse, no sólo el tipo de microorganismo, y el objetivo final que se persiga: aislamiento, recuento, identificación u obtención de masa celular. 30

31 Por otro lado, es de suma importancia los cuidados que deben observarse en la preparación de los medios de cultivo como son: a. La calidad del agua utilizada (que se prefiere libre de sales) b. Los materiales que deben encontrase en condiciones de limpieza c. Si se debe aplicar calor y cuánto para no incurrir en problemas de homogeneidad, desnaturalización, caramelización o pérdida de actividad nutricional. d. ph final del medio que deberá ajustarse según indicaciones del fabricante e. Esterilidad del medio de cultivo de acuerdo a indicaciones del fabricante si es una formulación comercial, o en otras condiciones si los componentes lo requieren. Cultivo microbiano. Los microorganismos obtenidos a partir de suelo, aire, alimentos se encuentran en consorcio y en raras ocasiones se encontrará un solo tipo de microorganismo. A partir del cultivo inicial de una muestra, se encontrará una variedad de tipos de colonias y posteriormente se pretenderá lograr un cultivo puro. Un cultivo puro es aquel que está constituido por microorganismos de la misma especie. El cultivo de microorganismos se puede realizar en medio sólido, semisólido o líquido. Se conoce como cultivo en medio sólido al que se hace en una caja Petri con el medio de cultivo gelificado (agar). Las variantes del cultivo en caja son diversas pero todas se centran en la formación de estrías sobre la superficie del medio de cultivo con el asa en el caso de bacterias y por picadura (introduciendo el asa en el agar) si se trata de hongos filamentosos. Las siembras en tubos con medio sólido, por lo general se emplean para la conservación de un cultivo proveniente de una placa. Existen dos variedades de cultivo en tubo: a) Por estrías: se utilizan los medios de cultivo inclinados, se toma una muestra de alguna colonia inclinada y en forma recta, se toma la colonia y se arrastra el asa en forma zigzagueante en el medio por la superficie inclinada del agar. b) Por picadura: se utilizan los medios de cultivo en un tubo solidificado ó semisólido en forma inclinada y en forma recta, se toma la colonia y se introduce en el medio picándolo longitudinalmente. La siembra en tubos de cultivo en medio líquido se realiza tomado el inóculo con el asa y se introduce en el medio líquido agitando suavemente el asa. a) Desarrollo en medio sólido inclinado. Se siembran los microorganismos por estría en tubos con agar inclinado b) Desarrollo en medio líquido. Las características que se observan en el cultivo son: turbidez, un sedimento, una película superficial, o combinados. c) Desarrollo en medio semisólido por picadura hasta ¾ partes del tubo Mediante la evaluación de las características de las colonias descritas y la acción en el medio, se puede hacer una identificación preliminar de los diferentes microorganismos aislados en un cultivo primario. Estas características son útiles para seleccionar otros medios y pruebas diferenciales apropiadas para completar la identificación de los microorganismos, aunque cabe señalar que la identificación de microorganismos por el estudio de sus características de cultivo es solo parcial ya que se requiere otras pruebas bioquímicas, fisiológicas e inmunológicas. Agar bacteriológico El agar utilizado en bacteriología es un medio que está libre de metales, compuestos nitrogenados, sales insolubles, azúcares libres, microorganismos muertos, bacterias termófilas y pigmentos. 31

32 El agar es una sustancia coloidal desecada que se extrae de algunas especies marinas de algas rojas, particularmente de los géneros Gelidium, Gracilaria, Pteroclaida y Acanthopeltis, químicamente el agar es una mezcla de dos polisacáridos: agarosa y la agaropectina, cuyas estructuras se revelan como polímeros de la galactosa en sus distintas formas. La proporción de agarosa y agaropectina es variable, con valores extremos de 75 % de agarosa y 25 % de agaropectina, según la clase de algas utilizadas. El agar con agua destilada fría tiene un poder de hinchamiento superior a veces al 3000%, en agua hirviendo el agar se disuelve totalmente en pocos minutos. La tendencia a la unión de sus partículas, que en frío se mantienen independientes producen un gel limpio y transparente que al enfriarse, ya no cede el exceso de agua absorbida. La viscosidad del gel aumenta paulatinamente a medida que la solución disminuye en su temperatura, gelificando a los C. Los ácidos diluidos en frío, no alteran sensiblemente el agar, desde que se introdujo el agar a los medios de cultivo como agente gelificante ha resultado muy bueno debido a que: a) Su estructura le confiere gran estabilidad frente a las enzimas microbianas, muy pocas bacterias marinas son capaces de hidrolizar como Pseudomonas carragenomora. b) Su estabilidad química, le permite mantener el medio en estado sólido. c) Su punto de fusión, superior a 80 C, permite cultivar en medio sólido bacterias termófilas que se incuban hasta temperaturas de 65 C. d) Su temperatura de gelificación, inferior a los 39 C, permite mezclarlos en forma líquida. e) Su elevado poder gelificante permite su utilización a muy bajas concentraciones, generalmente al 1,5 % (m/v) permitiendo obtener geles muy firmes, lo que permite sembrar microorganismos. f) Su empleo en concentraciones muy bajas permiten la obtención de medios semisólidos en los cuales se pueden realizar pruebas de movilidad. Clasificación de medios de cultivo I Los medios de cultivo por su estado de agregación pueden ser: líquidos, semisólidos y sólidos a) Medios líquidos. Este medio no contiene agar y se emplea para obtener grandes cantidades de microorganismos o bien para la producción de algún metabolito. b) Medios semisólidos. Se utiliza para determinar si un microorganismo tiene movilidad. c) Medios sólidos. Se utiliza para obtener colonias aisladas de microorganismos. II.- Por su uso se clasifican en: a) Medios selectivos.- Son medios que contienen sustancias que inhiben el crecimiento de algunos microorganismos, pero en una flora mixta permiten el aislamiento y recuperación del microorganismos o grupo de microorganismos de interés. b) Medios de enriquecimiento. Son medios que estimulan la multiplicación de algún microorganismo. c) Medios selectivos de enriquecimiento.- Son medios que estimulan la multiplicación de algún germen determinado e impiden la reproducción de otros. d) Medios diferenciales.- Son aquellos que contienen indicadores ácido base y de redox para detectar cambios en el medio o en las características típicas de la colonia. e) Medios para cultivar gérmenes anaeróbicos.- Son medios de cultivo para aquellos gérmenes que requieran condiciones anaeróbicas o de microaerofilia. Incluyendo medios reductores como el caldo tioglicolato y el uso de jarras de anaerobiosis. 32

33 III. Por su composición a) Si a un medio se le conoce completamente su formulación química se denomina medio sintético como el caldo glucosa sales. b) Si un medio de cultivo no conocemos su composición química se le denomina un medio complejo como el agar base sangre. Acorde a la presentación de un medio, podemos tener cultivos líquidos en matraz, en tubo medios semisólidos y en placa medios sólidos. IV.- Medios de cultivo para medir la actividad antimicrobiana (antibiograma). Los medios para realizar antibiogramas o para medir los halos de inhibición de sustancias desinfectantes o antisépticas generalmente son medios que no contienen inhibidores como el agar Mueller Hinton, agar cuenta estándar y agar de soya y tripticaseína. Para cada medio de cultivo se deben de introducir controles, por ejemplo para el Agar de papa y dextrosa se siembran las siguientes cepas de referencia. Microorganismo Cepa Resultado Candida albicans ATCC Bueno Saccharomyces cerevisiae ATCC9763 Bueno Trichophyton mentagrophytes ACTT9533 Bueno Para el agar con eosina y azul de metileno los controles de actividad son: Microorganismos Cepa Resultado Escherichia coli ATCC Colonias moradas con brillo metálico azul verdoso Enterobacter aerogenes ATCC Colonias mucoides con centro oscuro por lo general sin brillo metálico Salmonella typhimurium ATCC Colonias incoloras y transparentes Shigella flexneri ATCC Colonias incoloras y transparentes Staphylococcus aureus ATCC Crecimiento parcialmente inhibido o colonias puntiformes Candida albicans ATCC Colonias plumosas de color rosa pálido. Esto se realiza para garantizar que el medio de cultivo funciona adecuadamente y puede ser utilizado, además es parte del control de calidad de los medios de cultivo. 3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS 3.1 MATERIAL POR GRUPO Sesión I Balanza granataria Autoclave Horno 170 C Papel Kraf Incubadora a 28 C 3.2 MATERIAL POR EQUIPO (Sesión I) Un mechero Fisher Un espátula Potenciómetro Algodón Gasa Refrigerador Incubadora a 37 C Una pipeta de 10 ml Cinco tubos de ensaye de 13 x 100 mm 33

34 Seis matraces de 250 ml Siete tubos de ensaye de 16 x 150 mm Dos matraces de 125 ml Sesión II Tres tubos con 3 ml de medio SIM Tres cajas con agar EMB Tres tubos con agar PDA Tres cajas con agar nutritivo 3 tubos con 3 ml de caldo glucosa sales 3.3 REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO Agar nutritivo (AN) Agar eosina azul de metileno (EMB) Agar de papa y dextrosa (PDA) Medio SIM Glucosa Agar base sangre 3.4 CEPAS MICROBIANAS Escherichia coli Bacillus sp. 4.- DESARROLLO EXPERIMENTAL Una probeta de 100 ml Un termómetro Seis cajas Petri Un matraz con 50 ml de caldo glucosa sales Un matraz con 50 ml de caldo nutritivo Tres tubos con agar nutritivo Tres cajas con un medio enriquecido 3 tubos de caldo nutritivo (NH 4 ) 2 SO 4 K 2 HPO 4 MgSO 4 7H2O MnSO 4 4H2O Agar bacteriológico Agar rosa de bengala Penicillum sp. Aspergillus sp. Recomendaciones generales para la preparación de los medios de cultivo. a) Preparar el volumen de medio que se vaya a utilizar en el período recomendado para su empleo. b) Utilizar agua destilada y material de vidrio libre de detergentes. c) Pesar la cantidad del medio que marca el fabricante (en la etiqueta) d) El medio de cultivo en polvo debe de guardarse en su frasco y en un lugar fresco. e) Emplear recipientes con el doble de capacidad al volumen que se va a preparar para evitar la proyección en el momento de la ebullición. f) Añadir una pequeña cantidad de agua para permitir la disolución y después completar el volumen. g) En general los medios se mezclan hasta disolución completa para aclararse, pero debe evitarse que se derramen. Nunca deben calentarse a la flama directa del mechero para evitar que se proyecten. h) El ph de los medios debe ajustarse antes de la esterilización y a una temperatura de 25 C. i) Es conveniente evitar el sobrecalentamiento durante la esterilización por calor para evitar la pérdida de materiales nutritivos y agua que puedan cambiar la consistencia del medio. j) Los medios de cultivo ya preparados y esterilizados deben mantenerse en refrigeración (4 C) y protegidos de la luz. Antes de emplearlos verificar que no exista contaminación, precipitación, cambio de color o de consistencia etc. 34

35 k) Un medio contenido en un matraz y que ya contenga sustancias de enriquecimiento ó ácido tartárico no puede ser esterilizado una segunda ocasión. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO 4.2 MEDIO SINTÉTICO (glucosa-sales caldo y agar) a) Preparar 100 ml de caldo o la cantidad que indique el profesor. b) Pesar cuidadosamente los componentes del medio de acuerdo a la siguiente formulación: Reactivo Cantidad Glucosa 5.0 (NH4) 2 SO KH 2 PO K 2 HPO MgSO 4 7H 2 O 0.25 MnSO 4 4H 2 O Agua destilada 100 ml c) Disolver los componentes por separados y colocarlos en un matraz de 250 ml, adicionar en primer lugar los metales, luego los fosfatos, el amonio y finalmente la glucosa. Ajustar el ph a 7.0 ± si fuera necesario, para ello utilizar el potenciómetro. d) Una vez disueltos los componentes transferir 30 ml a un matraz Erlenmeyer de 125 ml, colocarle el tapón de algodón su gorro de papel Kraf y colocarlo en el autoclave. e) Tomar 3 tubos y colocarles 3 ml de caldo glucosa sales, taparlos y colocarlo en un bote de lámina f) Medir el volumen que sobra del caldo y realizar la operación matemática, de tal forma que la concentración de agar a adicionarle sea 1.5 g de agar bacteriológico/ 100ml de medio. g) Calentar a ebullición hasta que se haya fundido completamente. h) Tomar 3 tubos de ensaye y colocarle aproximadamente 3 ml, taparlos y colocarlos en el bote de lámina para su esterilización. i) El medio que ha sobrado colocarle el tapón y su gorro e introducirlo a la autoclave. j) Esterilizar todo el material anterior en autoclave a 110 C durante 15 minutos. Una vez que se ha llevado a cabo la esterilización, inclinar los tubos que tienen agar. k) Enfriar el matraz hasta 45 C y en condiciones asépticas transferir del matraz de 15 a 20 ml de medio en cajas de Petri estériles y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente. l) Etiquetar con los datos correspondientes cada caja (en la base de la caja) colocar el masking tape o con marcador indeleble Finalmente guardar en bolsas de plástico nuevas en posición invertida. m) Dejar una muestra para control de esterilidad por 5 días y el resto de material conservarlo en refrigeración para su uso MEDIO COMPLEJO (agar nutritivo para placas de Petri) a) Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad de medio indicada por el profesor. b) Colocar el medio en un matraz del doble de volumen y adicionar el agua necesaria. c) Calentar suavemente hasta disolverlo completamente. d) Tapar el matraz que contiene el medio con un tapón y gorro de papel Kraft. 35

36 e) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase. f) Enfriar el matraz hasta 45 C y en condiciones estériles transferir del matraz de 15 a 20 ml de medio en cajas de Petri estériles y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente. g) Etiquetar con los datos correspondientes cada caja (en la base de la caja) colocar el masking tape o con marcador indeleble Finalmente guardar en bolsas de plástico nuevas en posición invertida MEDIO COMPLEJO (agar nutritivo para preparar tubos de ensaye) a) Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad de medio indicada por el profesor. b) Colocar el medio en un matraz del doble de volumen y adicionar el agua necesaria. c) Calentar suavemente hasta disolverlo completamente. d) En un tubo colocar 3 ml de agua para ser utilizado como tubo de comparación y no usar una pipeta. e) Vaciar aproximadamente 3 ml de medio en cada uno de los tubos de ensaye de 13 x 100 mm limpios y etiquetados, taparlos con un tapón de algodón-gasa y colocarlos en un bote f) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase, al término de esta y calientes inclinar los tubos con el agar y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente. g) Finalmente guardar en bolsas de plástico nuevas MEDIO COMPLEJO (caldo nutritivo en matraz y tubo de ensaye) a) Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar 60 ml de medio. b) Colocar el medio en un matraz del doble de volumen y adicionar el agua necesaria. c) Calentar solo si es necesario hasta disolverlo completamente. d) Medir con una probeta 50 ml y colocarlo en un matraz de 125 ml, colocarle su tapón y gorro e) Vaciar 3 ml de medio en cada uno de los tubos de ensaye de 13 x 100 mm limpios y etiquetados, taparlos con un tapón de algodón-gasa y colocarlos en un bote de lámina. f) Esterilizar a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase y guardar en refrigeración. 4.4 MEDIO DIFERENCIAL Agar Eosina Azul de Metileno (EMB) a) Pesar cuidadosamente la cantidad que dice el envase para preparar la cantidad que se indique. b) Colocar el medio en un matraz con el doble del volumen y adicionarle el agua necesaria. c) Calentar suavemente hasta disolución completa. d) Tapar el matraz con un tapón de algodón-gasa y gorro de papel Kraft. e) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del frasco f) Enfriar el matraz hasta 45 C y en condiciones asépticas transferir del matraz de 15 a 20 ml de medio en cajas de Petri estériles y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente. g) Etiquetar con los datos correspondientes cada caja (en la base de la caja) colocar el masking tape o con marcador indeleble Finalmente guardar en bolsas de plástico nuevas en posición invertida MEDIO SELECTIVO (Agar Papa y Dextrosa para preparar cajas de Petri) a) Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad de medio indicada por el profesor. b) Colocar el medio en un matraz del doble de volumen y adicionar el agua necesaria. 36

37 c) Calentar suavemente hasta disolverlo completamente. d) Tapar el matraz que contiene el medio con un tapón y gorro de papel Kraft. e) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase. f) Enfriar el matraz hasta 45 C y en condiciones estériles transferir del matraz de 15 a 20 ml de medio en cajas de Petri estériles y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente. g) Etiquetar con los datos correspondientes cada caja (en la base de la caja) colocar el masking tape o con marcador indeleble Finalmente guardar en bolsas de plástico nuevas en posición invertida MEDIO COMPLEJO (Agar Papa y Dextrosa para preparar tubos de ensaye) a) Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad de medio indicada por el profesor. b) Colocar el medio en un matraz del doble de volumen y adicionar el agua necesaria. c) Calentar suavemente hasta disolverlo completamente. d) En un tubo colocar 3 ml de agua para ser utilizado como tubo de comparación y no usar una pipeta. e) Vaciar aproximadamente 3 ml de medio en cada uno de los tubos de ensaye de 13 x 100 mm limpios y etiquetados, taparlos con un tapón de algodón-gasa y colocarlos en un bote f) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase, al término de esta y calientes inclinar los tubos con el agar y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente. g) Finalmente guardar en bolsas de plástico nuevas MEDIO SELECTIVO (Agar Papa y Dextrosa para preparar matraces con 80 ml) h) Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar 80 ml del medio. i) Colocar el medio en un matraz de 125 ml y adicionar el agua necesaria. j) Calentar suavemente hasta disolverlo completamente. k) Tapar el matraz previamente etiquetado que contiene el medio con un tapón y gorro de papel Kraft. l) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase. m) Este medio se utilizará para la realización de la técnica de vaciado en placa y para ello será necesario fundir el medio y cuando este a 45 C se le adicionará 1.4 ml de ácido tartárico al 10% estéril por cada 100 ml de medio preparado y homogeneizar. 4.6 MEDIO INDICADOR medio SIM (Sulfur Indol Motility). a) Pesar con cuidado la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad que indique el profesor. b) Colocar el medio en un matraz del doble de capacidad y adicionarle agua necesaria. c) Calentar suavemente hasta disolución completa y colocar 3 ml en tubos de 13 x 100 mm. d) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase e) Dejar los tubos en el bote y dejar que estos solidifiquen en posición vertical. 4.7 MEDIO ENRIQUECIDO AGAR SANGRE a) Pesar la cantidad indicada para preparar cuatro placas según la etiqueta del frasco. b) Fundir el medio con agua destilada, hasta que el medio este claro y sin grumos. 37

38 c) Colocar el tapón de algodón y el gorro y esterilizar, según indica el frasco. d) Una vez esterilizado el medio, enfriarlo hasta que este a 45 C. e) Cuando este a esa temperatura, adicionar 5 % de sangre estéril desfibrinada. f) Mezclar bien la sangre y vaciar rápidamente en las placas previamente esterilizadas y etiquetadas. g) Dejar solidificar el medio y colocarlas en una bolsa de plástico nueva en posición invertida y guardarlas en el refrigerador. 4.8 AGAR ROSA DE BENGALA a) Pesar la cantidad indicada para preparar cuatro placas según la etiqueta del frasco. b) Fundir el medio con agua destilada, hasta que el medio este claro y sin grumos. c) Colocar el tapón de algodón y el gorro y esterilizar, según indica el frasco. d) Una vez esterilizado el medio, enfriarlo hasta que este a 45 C y vaciar en placas estériles e) Dejar solidificar el medio y colocarlas en una bolsa de plástico nueva en posición invertida y guardarlas en el refrigerador. 4.9 CONTROL DE ESTERILIDAD a) Tomar una muestra de cada uno de los medios preparados para el control de la esterilización e incubarlos a 35 C durante 3 a 5 días. b) Verificar que no presente crecimiento, cambio de color o precipitación. NOTA: ESTOS MEDIOS SE UTILIZARAN PARA LA SIGUIENTE SESIÓN QUE ES CULTIVO DE MICROORGANISMOS. SESIÓN II 4.1 Revisar los medios de cultivo que se prepararon 4.2 CULTIVO EN MEDIO SÓLIDO EN PLACA (ESTRÍA CRUZADA, SIMPLE, POR PUNTO Y MASIVA) Se utilizarán cajas con agar EMB o Agar sangre para la realización de la estría cruzada. a) Tomar el asa y esterilizarla al rojo vivo en la flama del mechero. b) Destapar el tubo que contenga el microorganismo, pasar la boca del tubo por la flama del mechero. c) Enfriar el asa en el interior del tubo y tomar con ella el inóculo. d) Pasar la boca del tubo nuevamente por la flama del mechero y colocarle el tapón. e) Destapar la caja de EMB y sembrar al microorganismo por estría cruzada como se indica en el esquema y esterilizar el asa cada vez que se realiza una estría. f) Una vez sembrado el microorganismo incubar la caja sembrada a 37 C, durante 24 horas. g) Observar el crecimiento a las 24 h y anotar las características del crecimiento en el medio cultivo. 38

39 4.3. CULTIVO DE MICROORGANISMOS POR ESTRÍA SIMPLE EN PLACA a) Tomar el asa y esterilizarla en la flama. b) Destapar el tubo que contenga el microorganismo, pasar la boca del tubo por la flama. c) Enfriar el asa en el interior del tubo y tomar con ella el inóculo. d) Pasar la boca del tubo nuevamente por la flama del mechero y colocarle el tapón. e) Destapar la caja de Agar nutritivo y sembrar como se indica en el esquema f) Esterilizar el asa al terminar de efectuar la estría e incubar la caja sembrada a 37 C, durante 24 h. g) Observar el crecimiento a las 24 h y anotar las características del crecimiento en el medio cultivo CULTIVO DE MICROORGANISMOS POR PUNTO (generalmente para mohos) a) Tomar la placa y dividirla en cuatro fracciones que corresponden una para cada alumno y testigo b) Tomar el asa y esterilizarla al rojo vivo en la flama. c) Destapar el tubo que contenga el microorganismo, pasar la boca del tubo por la flama del mechero. d) Enfriar el asa en el interior del tubo y tomar el inóculo. e) Pasar la boca del tubo nuevamente por la flama del mechero y colocarle el tapón. f) Destapar la caja de agar de papa y dextrosa y sembrar como se indica en el esquema. g) Esterilizar el asa al terminar de efectuar la estría e incubar la caja sembrada a 28 C, de 3 a 5 días. h) Observar el crecimiento a las 24h, 48h, 72h y 5 días, anotar las características del crecimiento CULTIVO DE MICROORGANISMOS POR ESTRÍA MASIVA a) Tomar un hisopo estéril. b) Destapar el tubo que contenga la suspensión del microorganismo y pasar la boca del tubo por la flama del mechero. c) Tomar un hisopo estéril y humedecerlo en la suspensión. d) Pasar la boca del tubo por la flama y colocarle el tapón. e) Destapar la caja de agar de soya y tripticaseína y sembrar como se indica en el esquema f) Colocar el hisopo en el benzal para su desinfección e incubar la caja sembrada a 37 C/24 h, y observar el crecimiento. 4.6 CULTIVO EN TUBO EN MEDIO SÓLIDO INCLINADO a) Se utilizarán tubos con agar nutritivo y agar papa dextrosa inclinada y AGS b) Tomar una asada de la bacteria proporcionada y sembrar por estría en S la superficie del medio inclinado de agar nutritivo. c) Tomar una asada del (micelio y esporas) proporcionada y sembrar por estría en 39

40 S la superficie del medio inclinado de agar de papa y dextrosa. d) Esterilizar el asa una vez realizada la siembra e Incubar los tubos sembrados a 37 C para bacterias y a 28 C para hongos, durante 24 y 48 h respectivamente e) Observar los cultivos a las 24 y 48 horas y anotar las características del cultivo. 4.7 CULTIVO EN MEDIO LÍQUIDO (Se emplearán tubos y matraz con caldo nutritivo y glucosa sales) a) Tomar el inóculo de bacterias con el asa y disgregar éste agitándolo en las paredes del tubo o matraz, evitar la formación de grumos. b) Tomar el inóculo de hongos con el asa en forma de L y sembrarlo en el matraz o en tubo, procurando tomar esporas y micelio para disgregarlo en el medio. c) Esterilizar el asa una vez realizada la siembra. d) Incubar los tubos y matraz con bacterias a 35 C/24 h, y el matraz con hongos a 28 C/ 5 días en agitación a 120 rpm e) Observar los cultivos a las 24 y 48 h y anotar las características observadas. f) Los equipos designados por el profesor dejarán su matraz con moho o bacterias sin agitación. 4.8 CULTIVO EN MEDIO SEMISÓLIDO (Se emplearán tubos con medio SIM) a) Tomar un inóculo de bacterias con el asa recta. b) Sembrar por picadura, sumergiendo el asa hasta ¾ partes del medio SIM sin tocar el fondo y sacar el asa verticalmente. (El crecimiento debe de darse en la línea de trazo en el caso de que la bacteria sea no móvil, cuando es móvil el crecimiento se difunde a través del medio). Esterilizar el asa una vez realizada la siembra. c) Incubar los tubos a 37 C/ 24 h. d) Observar los cultivos a las 24 h y anotar las características del cultivo. 4.9 MORFOLOGÍA COLONIAL Morfología colonial en placa para bacterias y levaduras Una vez sembrada la placa la descripción de cada una de las colonias SEPARADAS debe incluir: a. Tamaño: Diámetro en mm, La mayoría de los microorganismos forman colonias de tamaño limitado al tiempo de incubación. b. Forma: Es la apreciación general de su figura la cual puede ser: c.- Elevación: Que puede ser: d. Borde: Se refiere al contorno de las colonias y puede ser: Entero, ondulado, Lobulado, crenado, filamentoso o rizado. 40

41 e. Color: Blanco, amarillo, negro, marrón, anaranjado, etc. f. Aspecto: Húmedo o seco g. Consistencia: Suave (butirosa), viscosa, membranosa o dura. Esta prueba se realizar con el asa. Morfología colonial en placa para mohos: Tiempo de crecimiento: Los mohos filamentosos, tienen colonias de 2-3 cm de diámetro y va de 3 a 5 días. Aspecto: puede ser: aterciopelado, pulverulento, velloso y algodonoso. Pigmentación: Al reverso de la colonia se observa el pigmento del micelio y puede ser de color olivo, verde claro, grises, blancas, rojas, amarillas. 5.- RESULTADOS Y CUESTIONARIO 5.1 CARACTERÍSTICAS Tamaño Forma Elevación Aspecto Consistencia Gram Morfología microscópica Medio de Cultivo: En un cuadro anota los medios de cultivo que se prepararon, sus condiciones de esterilización, el aspecto final del medio y cuál es su clasificación en base a su consistencia y composición. Medio de cultivo Condiciones de Clasificación por su Clasificación por su Presentación del esterilización consistencia composición medio Caldo Glucosa sales Ejemplo Agar Glucosa sales Agar Nutritivo 110 C /10 Líquido Simple /sintético Tubo y matraz EMB PDA SIM Agar sangre Agar rosa de bengala 41

42 5.2 Qué cuidados deben tenerse al preparar un medio de cultivo sólido en caja de Petri? 5.3- De los siguientes medios, mencionar en qué consiste su capacidad diferencial o selectiva y qué tipos de microorganismos crecen en ellos? Agar Rosa de Bengala y Agar Papa Dextrosa. 5.4 Cuál es la función de los colorantes e indicadores en los medios de cultivo? 5.5 De los medios usados indica cuáles son específicos para mohos y cuáles para bacterias y por qué? 5.6 Cuando se siembran hongos en medio líquido, describe cómo es el crecimiento con y sin agitación. 5.7 En qué casos se siembra en medio semisólido y cuáles son las precauciones que se deben tomar? 5.8 Anota la morfología colonial de un moho y de una bacteria, indicando de que medio lo obtuviste. 6.- ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS Discutir con base a la Norma Oficial Mexicana la clasificación de los medios y a las características de la morfología colonial (macroscópica) para cada especie microbiana. 7.- CONCLUSIONES Elabora tus conclusiones utilizando los resultados obtenidos, al análisis y discusión de éstos, la bibliografía consultada y al objetivo de la práctica. 8. BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA PARA LA ELABORACIÓN DE ESTA PRÁCTICA 8.1 Lynch, M.J.; S.S. Raphael: L. D. Mellor; D.D. Spare, M. J., Inwood. Métodos de Laboratorio. 2ª Edición. Interamericana. México. 140 p. 8.2 Manual de medios de cultivo Bioxon parte 1 y NOM-065-SSA1-1993, Bienes y servicios. Que establece las especificaciones sanitarias de los medios de cultivo. Generalidades. 8.4 Schiegel, G. Microbiología General. Edición. Omega España. 654 p. 42

43 PRACTICA No 5 AISLAMIENTO Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBICOS UNIDAD IV: Ubicuidad y aislamiento de microorganismos 1. OBJETIVOS: El alumno practicará las técnicas de aislamiento y cuantificación de microorganismos de muestras biológicas siguiendo las recomendaciones de las Normas Oficiales Mexicanas. 1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS: El alumno practicará las diferentes técnicas de aislamiento y recuento de microorganismos Aplicará la técnica de las diluciones para disminuir la carga microbiana de las muestras con base en las normas oficiales, NOM-109-SSA Procedimientos para la Toma, Manejo y Transporte de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico y NOM-110-SSA Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico, 092 NOM-092-SSA-1994, Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa y NOM-111-SSA1 1994, Bienes y servicios. Método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos 2. INTRODUCCIÓN Se entiende por aislamiento, al proceso que permite separar uno o más microorganismos presentes en una muestra, forzándolos a crecer en medios de cultivos. No todos los microorganismos pueden cultivarse en medios de cultivo como el caso de los organismos biotróficos y consorcios microbianos difíciles de separar (parásitos obligados), los cuales se desarrollan sobre tejido vivo de su hospedante (virus, rickettsias, hongos). En el estudio microbiológico, el primer paso es la separación de la población mixta a un cultivo puro y luego su posterior identificación (familia, género y especie). -Cultivo puro: es aquel que contiene una sola especie o tipo de microorganismo y que presumiblemente se ha obtenido a partir de una sola célula. En un cultivo puro, no necesariamente todas las células que lo componen tienen que ser exactamente iguales, ya que es factible que algunas de ellas sufran mutaciones y se diferencien de las restantes. Cada uno de los cultivos puros que componen una especie se denomina cepa. Las diferentes técnicas de aislamiento son la estría cruzada, el vaciado en placa y la extensión con varilla, pero en ocasiones la muestra tiene gran cantidad de microorganismos que tenemos que recurrir a la realización de: Realización de diluciones (NOM-110-SSA1 1994, Bienes y servicios. Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico) La dilución primaria tiene por objeto obtener una distribución lo más uniforme posible de los microorganismos contenidos en la muestra destinada para el análisis. La preparación de diluciones decimales adicionales, si son necesarias, tiene como objetivo reducir el número de microorganismos por unidad de volumen, para permitir, después de la incubación, la observación de la prueba en el caso de tubos o matraces y la cuenta de colonias en el caso de placas. Dilución primaria, es la suspensión o emulsión obtenida después de pesar o medir una cantidad del producto bajo examen y mezclarla con una cantidad de nueve veces en proporción de diluyente. Diluciones decimales adicionales, las suspensiones o soluciones obtenidas al mezclar un determinado volumen de la dilución primaria con un volumen de nueve veces un diluyente y que por repetición de 43

44 esta operación con cada dilución así preparada, se obtiene la serie de diluciones decimales adecuadas para la inoculación de medios de cultivo. Estría cruzada en placa: Esta técnica consiste en establecer un gradiente de diluciones por medio de las estrías cruzadas sobre la superficie de un medio sólido, para separar a los microorganismos, dando origen a colonias separadas que generalmente corresponden a un cultivo puro, aquí no se puede hacer un recuento. TÉCNICA DE VACIADO EN PLACA: El fundamento de la técnica consiste en contar las colonias, que se desarrollan en el medio de elección después de un cierto tiempo y temperatura de incubación, presuponiendo que cada colonia proviene de un microorganismo de la muestra bajo estudio. El método admite numerosas fuentes de variación, algunas de ellas controlables, pero sujetas a la influencia de varios factores. En la lectura seleccionar aquellas placas donde aparezcan entre 25 a 250 UFC, para disminuir el error en la cuenta en caso contrario seguir las indicaciones de la NOM 092 Unidades Formadoras de Colonias (UFC), término que debe utilizarse para reportar la cuenta de colonias en placa, las cuales pueden surgir de una célula o de un cúmulo de células. TÉCNICA DE EXTENSIÓN EN PLACA CON VARILLA ACODADA Esta técnica se utiliza para el aislamiento y recuento de microorganismos, donde el inóculo se distribuye con la varilla, previamente esterilizada. La cantidad de inóculo utilizado puede ser de 0,1 o 0,5 ml. En algunos casos el aislamiento lo podemos hacer directamente en un medio selectivo, pues lo que deseamos es ver la producción de un metabolito, por ejemplo para el aislamiento de microorganismos productores de amilasas se utiliza el medio denominado agar almidón. El aislamiento nos sirve para obtener la morfología colonial, microscópica y observar alguna característica como hidrólisis o hemólisis. 3. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS 3.1 MATERIAL POR EQUIPO Cuatro Cajas de Petri estériles Cajas de Petri con EMB o medio selectivo Matraz con 100 ml de ACS o PDA Balanza granataria 3.2 MATERIAL QUE DEBE TRAER EL ALUMNO Muestra de queso, agua de sabor, leche en punto de venta, helado, etc. 4. DESARROLLO EXPERIMENTAL Cuatro cajas de Petri con Agar Nutritivo Cilindro con pipetas de un ml estériles Seis frascos de dilución con 90 ml de solución salina al 0.85% 4.1 Realizar diluciones de la muestra como lo indique el profesor y según el siguiente esquema DILUCIONES a. Para muestras líquidas no viscosas (agua, leche, refrescos, etc.) en las cuales la distribución de microorganismos es homogénea o fácilmente homogeneizable por medios mecánicos (agitación, etc.). b. Para muestras congeladas de un alimento originalmente líquido o licuable, fundir por completo en baño de agua de 40 a 45 C un tiempo máximo de 15 minutos y homogeneizar agitando vigorosamente. 44

45 c. Para la parte líquida de una muestra heterogénea la cual sea considerada suficientemente representativa de la muestra total (por ejemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales). d. Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 10 ml de la muestra si es muestra líquida y 10 g si es muestra sólida y diluir con 90 ml del diluyente el cual debe encontrarse a una temperatura similar a ésta, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente (todo en condiciones de esterilidad). e. Utilizar pipetas diferentes para cada dilución inoculando simultáneamente las cajas que se hayan seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la pipeta. f) La selección de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular, dependen del número esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de análisis previos y de la información que se obtenga del personal de inspección que la haya colectado. En ausencia total de información, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta. 4.2 AISLAMIENTO Y RECUENTO POR LA TÉCNICA DE VACIADO EN PLACA. Agar cuenta estándar (ACS) o agar de papa y dextrosa (PDA) NOM-092-SSA-1994, Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa y NOM-111-SSA1 1994, Bienes y servicios. Método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos a) Una vez realizadas las diluciones se procede a inocular las placas b) Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la inoculación; la adición de medio de cultivo y homogenización, se puedan realizar cómoda y libremente. Marcar las cajas en la base de la misma con los datos pertinentes previamente a su inoculación y correr por duplicado. c) Se inocula un ml de las dos últimas diluciones según las diluciones que se hayan realizado en las cajas Petri estériles, agregar de 12 a 15 ml del medio preparado que es agar cuenta estándar, mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas. Dejar solidificar. 45

46 d) Incluir una caja sin inóculo por cada lote del medio preparado como testigo de esterilidad. e) El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos. f) Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se requieran. g) Para bacterias y levaduras 37 C 24 a 48 horas. h) Contar todas las colonias en aquellas cajas que tengan entre 25 y 250 colonias i) Si se cuenta la última dilución y no tiene entre 25 y 250 sino más, y las colonias están bien distribuidas, dividir la placa en dos y contar solo una mitad, el resultado se multiplica por dos, si aún tenemos muchas colonias, dividir la placa en cuatro y solo contar un cuadrante y el resultado se multiplica por cuatro, y si todavía tenemos muchas contar 5 cm 2, sumarlos y sacar un promedio, el resultado se multiplica por 65, cuando la placa utilizada sea de 100 X 15 mm. j) Para el aislamiento y recuento de mohos es el mismo procedimiento solo que ahora hay que acidificar el PDA con 1.4 ml de acido tartárico al 10 % por cada 100 ml de medio, incubar a 28 C de 3 a 5 días y contar todas las colonias en aquellas cajas que tengan entre 15 y 150 colonias. 4.3 AISLAMIENTO Y RECUENTO POR LA TÉCNICA DE EXTENSIÓN EN PLACA (Agar Nutritivo) a. Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la inoculación; la adición de medio de cultivo y homogenización, se puedan realizar cómoda y libremente. b. Etiquetar las cajas en la base previamente a su inoculación y correr por duplicado. c. Inocular 0.1 ml de las dos últimas diluciones de las muestras preparadas sobre la superficie del medio. d. Humedecer una varilla de vidrio en forma de L con alcohol y pasarla por la flama del mechero. e. Enfriar la varilla, una vez fría extender el inoculo por toda la superficie del agar nutritivo. f. Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de esterilidad. g. El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos. h. Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se requieran, según el tipo de alimento y microorganismo de que se trate. i. Para bacterias 37 C 24 a 48 horas. j. Se procede a contar el número de bacterias haciendo los cálculos como en la técnica de vaciado en placa. 46

47 4.4 AISLAMIENTO POR ESTRIA CRUZADA (Medio selectivo) a. Este sistema de siembra en estrías en placas de Petri con medios sólidos y es el procedimiento habitual para aislar microorganismos. (En caso de duda ver la práctica anterior.) b. Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se requieran, según el tipo de producto y/o microorganismo de que se trate. c. Realizar la morfología colonial de las colonias que estén previamente aisladas. 5 CUESTIONARIO: 5.1 Informe de resultados de la técnica de Vaciado en placa: Técnica Vaciado en placa ACE/PDA Extensión con varilla (AN) No. de UFC/ml 5.2 Reportar como: Unidades formadoras de colonias, UFC/g o ml de bacterias aerobias en placa en agar cuenta estándar, incubadas: horas a C Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o ml) de mohos en agar papa - dextrosa acidificado, incubadas a 25 ± 1 C durante 5 días. Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o ml) de levaduras en agar papadextrosa acidificado, incubadas a 25 ± 1 C durante 5 días. Reportar como: Unidades formadoras de colonias, UFC/g o ml de bacterias aerobias en placa en agar cuenta estándar, incubadas: horas a C. 5.3 Informe de resultados de la técnica de Extensión en con varilla. 5.4 En qué casos aplicarías la técnica de estría cruzada? 5.5 La técnica de estría cruzada permite contar el número de colonias? 5.6 Cuál es el fundamento de la técnica de vaciado en placa? 5.7 Cuál es el fundamento de la técnica de extensión en placa? 5.8 En qué casos aplicarías utilizar diluciones? 6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS. Discutir las ventajas y desventajas de cada una de las técnicas de aislamiento y analizar los resultados obtenidos en cada una de las técnicas. 7. CONCLUSIONES Elabora tus conclusiones tomando en cuenta los resultados obtenidos. 8. BIBLIOGRAFÍA 8.1 NOM-109-SSA Procedimientos para la Toma, Manejo y Transporte de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico 8.2 NOM-110-SSA Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico 8.3 NOM-092-SSA-1994, Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa 8.4NOM-111-SSA1 1994, Bienes y servicios. Método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos 8.5 Koneman, Diagnóstico Microbiológico 3ra. Edición, Edit. Panamericana

48 UNIDAD III: Identificación bacteriana TEMA: 3.4 Conservación de microorganismos 1. OBJETIVOS: PRÁCTICA No. 6 CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS El alumno diferenciará cada uno de los métodos de conservación de cepas de acuerdo a sus características y deducirá el mejor método para conservar al microorganismo de acuerdo al resultado de viabilidad. 1.2 Objetivos específicos El alumno conocerá métodos de conservación de cepas y conservará algunas cepas para concluir cual es el más adecuado en función del resultado de viabilidad y tipo de microorganismos El alumno realizará pruebas de viabilidad microbiana para elegir el mejor método de acuerdo al tipo de microorganismos conservado. 2. INTRODUCCIÓN En un laboratorio de microbiología existen cepas microbianas las cuales hay que preservar, teniéndose varios métodos para su conservación, aunque necesario tomar en cuenta las características del microorganismo, los materiales y los recursos con que se cuenta para elegir el mejor método, pues sucede que nuestra cepa de interés puede en un momento dado sufrir daños como la deshidratación, cambios genéticos o perdida de la viabilidad. Las tres condiciones que hay que alcanzar para conservar correctamente las cepas microbianas en un laboratorio son: Que el cultivo a conservar sea puro, evitando que se produzcan contaminaciones durante el proceso de conservación; Que durante el tiempo de conservación sobrevivan al menos del 70-80% de las células, y Que estas células permanezcan genéticamente estables. Las dos primeras condiciones no son muy difíciles de conseguir cuando se conoce bien la técnica microbiológica, pero el tercero puede presentar dificultades, y este es el motivo por el cual existen varios métodos de conservación. Los métodos de conservación de cepas se van a agrupar en tres apartados, que son: Métodos de elección o de conservación a largo plazo, métodos alternativos y métodos restringidos. A.- Métodos de elección o de conservación a largo plazo. Son los mejores porque en ellos se detiene el crecimiento de las células microbianas, pero éstas no han muerto. Así se garantiza al máximo la estabilidad genética, por evitarse la aparición de generaciones sucesivas. Aún así no se puede descartar algún cambio originado por el método. Los métodos de conservación pertenecientes a este grupo son dos: Congelación y liofilización. Conservación por congelación. Se congelan las células en suspensión en un líquido con un agente crioprotector y se guardan a temperaturas inferiores a 0 C, con lo que el agua se congela. De esta forma, al no disponer las células de agua en forma líquida, no hay crecimiento. Cuando se quiere trabajar con las células así conservadas, se recuperan subiendo la temperatura. Este es el mejor método de conservación desde todos los puntos de vista, pero tiene el inconveniente de requerir aparatos especiales. Los cuatro factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las células conservadas por este método es la edad de las células, velocidad en la congelación y descongelación, temperatura de almacenamiento: y empleo de agentes crioprotectores. 48

49 Conservación por liofilización. Tampoco se da crecimiento en las células conservadas por este método, puesto que se les ha quitado el agua mediante la liofilización, que es un proceso suave. Con ello la estabilidad genética es alta, pero a veces no tanto como en la congelación, porque la liofilización se consigue por sublimación del hielo de las células. Por lo tanto, primero tenemos que congelar el agua libre de las células y después eliminarla mediante el vacío, sin que haya necesidad de subir la temperatura, lo que acabaría afectando a la viabilidad del microorganismo. Para este proceso se emplean los aparatos denominados liofilizadores. Las células microbianas así conservadas se someten a un tratamiento más complejo que en el caso de la congelación, pues la liofilización se hace en dos etapas y se añade la sublimación del agua a la congelación previa. Sin embargo, este es un método muy recomendable por su comodidad para el almacenamiento y para el envío de las cepas, pues una vez conseguidos los liófilos pueden almacenarse a temperatura ambiente (18ºC-20ºC), con lo cual su envío es fácil. Los factores que debemos tener en cuenta para hacer una buena liofilización son los mismos que influyen en la congelación, a los que hay que añadir otros que surgen como consecuencia de la deshidratación. La congelación puede hacerse rápida o lentamente, la primera sumergiendo los tubos en nitrógeno líquido. Respecto a los crioprotectores, se pueden utilizar varios dependiendo del tipo de microorganismo, pero para liofilizar no se debe utilizar glicerol, debido a su elevado punto de evaporación y a su higroscopicidad, que provoca que los liófilos queden muy viscosos. Tampoco es conveniente utilizar el dimetilsulfóxido, porque es algo tóxico, y al concentrarse por la evaporación del agua puede dañar a las células microbianas. Por lo tanto, para la liofilización se recomiendan como crioprotectores el inositol para la mayoría de las bacterias y la leche descremada para mohos y actinomicetos, pero para algunos microorganismos pueden ser más convenientes otros crioprotectores, como por ejemplo el glutámico-glutamato para las bacterias lácticas y mezclas de glucosa con caldo hígado (sin carne) para bacterias anaerobias. Los nuevos factores que influyen específicamente en la eficacia de la liofilización como medio de conservación son: el tipo de microorganismos, la concentración celular, el grado de deshidratación alcanzado, la atmósfera de oxígeno en el tubo y las condiciones de almacenamiento. B.- Métodos alternativos. Son los que se utilizan cuando no se pueden emplear los métodos de elección, bien por carecer de los equipos necesarios, o bien porque la cepa microbiana no resiste los tratamientos de la conservación por estos métodos. Conviene tener en cuenta que nunca se debe usar un único método alternativo, sino que se recomienda conservar el microorganismo empleando varios de estos métodos. a).- Conservación por transferencia periódica. La cepa microbiana se guarda en forma de cultivo activo en el medio de cultivo en el que ha crecido. Sin embargo, estas células no pueden permanecer indefinidamente en el mismo tubo, porque al seguir activas excretan productos tóxicos del metabolismo que se acumulan, provocando el envejecimiento y muerte celular, por lo que es necesario transferirlas a otro tubo con medio de cultivo fresco. Este es el peor método para conseguir la estabilidad genética, puesto que al estar las células creciendo hay una alternancia de generaciones, y al cabo del tiempo las células que se están guardando serán descendientes lejanas de las células iniciales y es posible que ya no conserven algunas de sus características. A veces se suele recubrir el crecimiento con una capa de aceite mineral estéril. Con esto se consigue también evitar en la medida de lo posible la desecación del medio de cultivo, que podría ser tóxico para las células al aumentar su concentración. Hay que tener en cuenta que los microorganismos muy aerobios, como por ejemplo los mohos filamentosos, no se pueden guardar en tubos completamente cerrados. Por último, otro inconveniente que tiene la transferencia periódica es que la contaminación de los cultivos resulta más fácil al tener que manejar los tubos a lo largo del tiempo y también por la posibilidad de entrada de ácaros en los mismos. b).- Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar estéril. Es un método alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de viabilidad en diversos tipos de microorganismos, tanto mohos filamentosos como levaduras y algunas bacterias. Consiste en 49

50 suspender en agua estéril células del cultivo que se quiere conservar. Se pueden preparar en criotubos, en este caso la concentración celular no debe ser superior a células /ml en el caso de bacterias y levaduras. Para los mohos filamentosos que no esporulan, se pueden poner en suspensión trocitos de agar con el crecimiento del hongo. En el caso de microorganismos marinos, la suspensión se hace en agua de mar diluida. C.- Métodos restringidos. En este grupo se engloban métodos no empleados habitualmente, pero a los que es necesario recurrir a la hora de conservar grupos de microorganismos muy determinados que no resisten bien la liofilización o la congelación, como por ejemplo los géneros bacterianos Spirillum, Rhodospirillum, etc. a).- Desecación en papel de filtro. Se utiliza un papel bastante absorbente que se impregna con una solución muy densa de células y se deja secar al aire (en condiciones estériles). También es posible desecarlos por el procedimiento que se llama desecación líquida porque se utiliza para ello el liofilizador, pero sin que haya habido congelación previa de las células. El vacío producido por el liofilizador deseca las células, pero hay que evitar que un vacío excesivo provoque evaporación brusca con ebullición o que la temperatura disminuya demasiado, ocasionando la congelación incontrolada de las células. b).- Desecación en suelo, arena, silicagel, etc. Se añaden las células a estos sustratos que las protegerán al desecar. Los microorganismos productores de esporas se pueden conservar durante bastante tiempo por este método, este método es barato y de fácil conservación. c).- Desecación en bolitas de alginato. Éste es un procedimiento eficaz, las células se encuentran en una matriz de alginato y la eliminación del agua se hace por tratamiento con soluciones hipertónicas sucesivas y posterior desecación al aire hasta que se pierde un 70% de su contenido en agua. Estas bolitas de alginato se pueden conservar en tubos cerrados herméticamente y a temperaturas de entre 4ºC y 18ºC, pudiéndose guardar incluso a 80ºC debido al bajo contenido en agua de las células y la protección que suministra el soporte de alginato. Este es un método que se está utilizando para la conservación de algas y células vegetales. Para demostrar la eficiencia de un método de conservación en cepas se tiene que determinar el porcentaje de viabilidad en diferentes periodos, determinar la estabilidad morfológica y fisiológica, bioquímica, la virulencia y la antigenicidad, para garantizar que l cepa es efectiva. 3. MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS 3.1. EQUIPO Incubadora a 35 C Congelador Refrigerador Autoclave Horno Balanza digital 3.2. MATERIAL Cajas de Petri Portaobjetos Pipetas de un ml Gasa y algodón para un tapón Un tubo eppendorff de dos ml Una espátula de acero inoxidable 3.3. MEDIOS DE CULTIVO: Dos tubos de 13 X 100 con TSA Un matraz con 30 ml de caldo BHI 50

51 inclinado con tapón de baquelita Un tubos con 4 g de arena estéril Un matraz con 80 ml de ACS Un tubo de 13 X 100 con TSA o agar base sangre con tapón de algodón Cinco tubos con 9 ml de solución salina Un matraz con 30 ml de BHI Un tubo de 16X150 mm con PDA inclinado en tubos con tapón de baquelita (Cosecha de esporas) Dos tubos de 13 X 100 con PDA inclinado con tapón de baquelita Un tubo de 13 X 100 con PDA con tapón de algodón. Un matraz con 80 ml de PDA Un tubo de 13 X 100 mm estéril con tapón de baquelita 3.4. REACTIVOS: Glicerol al 60 % estéril Acido tartárico Colorantes para tinción de esporas Aceite mineral Colorantes para tinción de Gram Azul de algodón lactofenol 3.5. CEPAS MICROBIANAS Y MEDIOS SELECTIVOS PARA SU IDENTIFICACIÓN COLONIAL Escherichia coli Agar eosina azul de metileno Rhizopus sp Agar de papa y dextrosa Bacillus subtilis Agar nutritivo Aspergillus niger Agar de papa y dextrosa Micrococcus luteus Agar nutritivo Penicillium sp Agar de papa y dextrosa Staphylococcus aureus Agar de sal y manitol Pseudomonas. aeruginosa Agar cetrimida Saccharomyces cerevisiae Agar cuenta estándar Lactobacillus delbrueckii Medio MRS 4. DESARROLLO EXPERIMENTAL: Para la conservación de cepas la distribución será la siguiente: Equipo Cepa a conservar Equipo Cepa a conservar 1,6 Escherichia coli 4,9 Saccharomyces cerevisiae 2,7 Bacillus subtilis 5,10 Aspergillus niger 3,8 Micrococcus luteus 11 y 12 Lactobacillus delbrueckii PARA BACTERIASY LEVADURAS: DÍA 1 1) Realizar una tinción de Gram para verificar la pureza de la cepa, en caso de ser un microorganismo esporulado, realizar la tinción de esporas. 2) Sembrar un matraz con 30 ml de caldo infusión cerebro y corazón (BHI) estéril con dos asadas del microorganismo que te ha tocado según el número del equipo, incubarlo a 35 C durante toda la noche en agitación a 150 rpm. 51

52 DÍA 2 3) A partir del matraz sembrar por estría simple 3 tubos con agar de soya y tripticaseína, e incubarlo a 35 C y por 24 horas. Recuerda que se te debe proporcionar 2 tubos con tapón de baquelita y uno con tapón de algodón. 4) Etiquetar cada uno de los tubos, anotando el nombre de la cepa, fecha de siembra, fecha de conservación y fecha en que se determinará la viabilidad. DÍA 3 Después de la incubación realizar lo siguiente Tubo No. 1 que tiene el tapón de algodón Se conservará a temperatura ambiente Tubo No. 2 que tiene el tapón de baquelita Se conservará a temperatura en refrigeración a 4 C Tubo No. 3 que tiene el tapón de baquelita Matraz con 30 ml de BHI y la cepa que te ha tocado Se le adicionará aceite mineral y se conservará a temperatura de refrigeración de 4 C La suspensión es para obtener el número de células / ml Del matraz realizar lo siguiente: 4) Tomar un ml con pipeta estéril del cultivo del matraz y colocarlo en un tubo eppendorff previamente etiquetado, adicionarle un ml de glicerol al 60 % estéril, mezclar y conservarlo en el congelador. Conservación en congelación 5) Con la misma pipeta anterior tomar un ml del cultivo del matraz y colocarlo en el tubo que contiene arena estéril previamente etiquetado, homogenizarlo y conservarlo a temperatura ambiente 6) Determinación del número de UFC/ ml (No): Con la misma pipeta tomar un ml de la suspensión microbiana y realizar diluciones, hasta 10-5 y por la técnica de vaciado en placa sembrar las dos últimas diluciones. Incubar a 35 C durante 24 h y contar para obtener las UFC/ ml, de esa manera sabemos cuántos hemos conservado en el glicerol y arena. En la bitácora llevar el registro de la conservación, continuación. con un cuadro como el que se muestra a Nombre de la cepa Fecha de siembra del matraz Fecha de siembra de los tubos Fecha conservación de Determinación de viabilidad (1era. vez) Determinación de viabilidad (2da.da vez) % de Viabilidad Conservar los tubos por dos meses, y una vez transcurrido este tiempo realizar lo siguiente: Al tubo 1, 2 y 3 Sembrar el cultivo por estría cruzada o simple y verifica si hay crecimiento del microorganismo, recordar utilizar el medio adecuado según el tipo de microorganismos que se ha conservado y consulta a los demás equipos para llenar el siguiente cuadro. 52

53 Cepa a conservar Medio de cultivo Conservación a temperatura ambiente Escherichia coli Bacillus subtilis Micrococcus luteus EMB AN AN S. aureus ASM S. cerevisiae ACS P. aeruginosa Agar cetrimida L. delbrueckii Medio MRS Al tubo (eppendorff) 1.- Etiquetar 5 tubos con 9 ml de solución salina 2.- Tomar un ml del tubo eppendorff y realizar las cinco diluciones Conservación a 4 C 3.- Sembrar la dilución 10-4 y 10-5 por duplicado por la técnica de vaciado en placa 4.- Utilizar ACS para la siembra e incubar las placas e incubar las placas 5.- Realizar el recuento (Nf) para calcular el % de viabilidad Al tubo con arena 1.- Etiquetar 5 tubos con 9 ml de solución salina 2.- Tomar un g de arena y realizar las cinco diluciones 3.- Sembrar la dilución 10-4 y 10-5 por duplicado por la técnica de vaciado en placa 4.- Utilizar ACS para la siembra e incubar las placas 5.- Realizar el recuento (Nf) para calcular el % de viabilidad PARA MOHOS: DÍA 1 Conservación con aceite mineral y a 4 C 1.- Realizar una preparación en fresco del moho (Lo correcto para verificar la pureza es un microcultivo, pero en este momento aún no conoces la técnica). 2.- Sembrar un tubo de 13 X 100 mm con PDA inclinado con tapan de algodón 3.- Sembrar dos tubos de 13 X 100 mm con PDA y tapón de baquelita 4.- Sembrar un tubo de 16 X 150 mm con PDA y tapón de baquelita 5.- Incubar los tubos por 5 días a 28 C DÍA 6 Después de la incubación realizar lo siguiente Tubo No. 1 que tiene el tapón de algodón Se conservará a temperatura ambiente Tubo No. 2 que tiene el tapón de baquelita Se conservará a temperatura en refrigeración a 4 C Tubo No. 3 que tiene el tapón de baquelita Se le adicionará aceite mineral y se conservará a temperatura de refrigeración de 4 C Tubo de 16 X 150 mm con tapón de baquelita Realizar una suspensión, para ello colocarle aproximadamente 3 ml de solución salina y con la ayuda del asa resuspender para tener la cosecha de esporas y poder obtener el No de células / ml Del tubo de 16 X 150 mm que tiene la suspensión de esporas realizar lo siguiente: 1.- Depositar la suspensión en un tubo estéril, para facilitar el trabajo 53

54 2.- Tomar un ml con pipeta estéril del cultivo del matraz y colocarlo en un tubo eppendorff previamente etiquetado, adicionarle un ml de glicerol al 60 % estéril, mezclar y conservarlo en el congelador. 3.- Con la misma pipeta anterior tomar un ml del cultivo del matraz y colocarlo en el tubo que contiene arena estéril previamente etiquetado, homogenizarlo y conservarlo a temperatura ambiente 4.- Determinación del número de UFC/ ml (No): Con la misma pipeta tomar un ml de la suspensión microbiana y realizar diluciones, hasta 10-5 y por la técnica de vaciado en placa sembrar las dos últimas diluciones. Incubar a 28 C durante 5 días y contar para obtener las UFC/ ml, de esa manera sabemos cuántos hemos conservado en el glicerol y arena. En la bitácora llevar el registro de la conservación, con un cuadro como el que se muestra a continuación. Nombre de la cepa Fecha de siembra del matraz Fecha de siembra de los tubos Fecha de conservación Determinación de viabilidad (1era. vez) Determinación de viabilidad (2da.da vez) % de Viabilidad Conservar los tubos por dos meses, y una vez transcurrido este tiempo realizar lo siguiente: Al tubo 1, 2 y 3 Sembrar el cultivo por punto y verificar si hay crecimiento del microorganismo, utilizar el agar de papa y dextrosa y consulta a los demás equipos para llenar el siguiente cuadro. Cepa a conservar Medio de cultivo Conservación a temperatura ambiente Conservación a 4 C Conservación con aceite mineral y a 4 C Rhizopus sp Aspergillus niger Penicillium sp PDA PDA PDA Al tubo (eppendorff) 1.- Etiquetar 5 tubos con 9 ml de solución salina 2.- Tomar un ml del tubo eppendorff y realizar las cinco diluciones 3.- Sembrar la dilución 10-4 y 10-5 por duplicado por la técnica de vaciado en placa 4.- Utilizar PDA acidificado para la siembra e incubar las placas a28 C 5.- Realizar el recuento (Nf) para calcular el % de viabilidad Al tubo con arena 1.- Etiquetar 5 tubos con 9 ml de solución salina 2.- Tomar un gramo de arena y realizar las cinco diluciones 3.- Sembrar la dilución 10-4 y 10-5 por duplicado por la técnica de vaciado en placa 4.- Utilizar PDA acidificado para la siembra e incubar las placas a28 C 5.- Realizar el recuento (Nf) para calcular el % de viabilidad 54

55 5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO Llenar la siguiente tabla: Antes de la conservación Método /cepa Escherichia coli B. subtilis M. luteus S. aureus S. cerevisiae P. aeruginosa L. delbrueckii Rhizopus sp Aspergillus niger Penicillium sp Temperatura ambiente + Solo indicar si hay abundante o no. Después de la conservación Método /cepa Escherichia coli B. subtilis M. luteus S. aureus S. cerevisiae P. aeruginosa L. delbrueckii Rhizopus sp Aspergillus niger Penicillium sp Temperatura ambiente Refrigeración Crecimiento + Refrigeración Crecimiento Refrigeración + Aceite Crecimiento + Refrigeración + Aceite Crecimiento Congelación UFC/ml Congelación UFC/ml Arena UFC/g Arena UFC/g Determinar el % de reducción bacteriana del microorganismo (RBM) 5.1 Según el microorganismos que conservaste Cuál es el mejor método para consérvalo? 5.1 Investiga otros métodos de conservación como la liofilización. 5.2 Cual el papel del crioprotector? 5.3 Menciona el periodo máximo de conservación de cada uno de los métodos utilizados en la práctica 5.4 investiga la morfología colonial en la bibliografía del microorganismo que conservaste y el medio que utilizaste 55

56 6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS Discutir las ventajas y desventajas de cada uno de los métodos de conservación 7. CONCLUSIONES Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al análisis y discusión de éstos, a la bibliografía consultada y a los objetivos de la práctica. 8. BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA PARA LA ELABORACIÓN DE ESTA PRÁCTICA 8.1 Brock, T.D.; Smith y M.T. Madigan. Biología de los Microorganismos. 10ª. Edición. Prentice-Hall. España. 8.2 Prescott, H, Microbiología, Ed. McGraw-Hill, Interamericana, New York, 2004, 1005 p. 8.3 Lynch, M.J.; S.S. Raphael: L. D. Mellor; D.D. Spare, M. J., Inwood. Métodos de Laboratorio. 2ª Edición. Interamericana. México. 140 p. 8.4 NOM-181-SSA1-1998, salud ambiental. Agua para uso y consumo humano. Requisitos sanitarios que deben cumplir las sustancias germicidas para tratamiento de agua, de tipo doméstico 56

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58 UNIDAD V: Crecimiento Microbiano 1. OBJETIVOS PRACTICA No.7 CRECIMIENTO MICROBIANO El alumno aplicará las técnicas más utilizadas para el recuento de microorganismos y explicará qué ocurre en cada una de las fases de crecimiento celular. 1.2 Objetivos Específicos El alumno llevará a cabo una proliferación de crecimiento celular de de Escherichia coli en cultivo sumergido y agitación (fermentación) a nivel matraz por 24 horas El alumno cuantificará el número de microorganismos viables a través del recuento por diluciones y vaciado en placa como unidades formadoras de colonias (UFC) El alumno estimará el crecimiento microbiano por la técnica de turbidimetría El alumno cuantificará el número de microorganismos por cuenta directa con la técnica de conteo en cámara de Neubauer El alumno comparará los resultados obtenidos con CGS y caldo Luria, para determinar el mejor medio de cultivo en función de la cantidad de masa celular producida. 2. INTRODUCCIÓN Al hablar de crecimiento microbiano nos referimos al número de células, las células que crecen, están aumentando de número y forman cúmulos de cientos de microorganismos, colonias de cientos de microorganismos o poblaciones de miles de millones. Al conocer las condiciones para el crecimiento microbiano, podemos predecir la rapidez con que crecerán estos en distintas situaciones y determinan la forma de controlar su crecimiento, estos requerimientos pueden ser físicos y químicos. Los aspectos físicos incluyen la temperatura, el ph y la presión osmótica y entre los requerimientos químicos están el agua, las fuentes de carbono y nitrógeno, las sustancias minerales, el oxigeno y los factores orgánicos de crecimiento. Las bacterias se reproducen generalmente por fisión binaria, una división celular da lugar a dos células, la división de estas células produce cuatro y así sucesivamente. El tiempo necesario para que una célula se divida y por consiguiente para que su población se duplique, es lo que se llama tiempo de generación o tiempo de duplicación, puesto que, para los organismos unicelulares; cada duplicación constituye una nueva generación, varía considerablemente entre los diferentes microorganismos. La mayoría de las bacterias tienen un tiempo de generación de una a tres horas. Hay una serie de métodos para medir el crecimiento bacteriano. Algunos métodos miden el número de células, otros la masa total de la población. Las medidas de población se refieren normalmente al número de células que hay en un mililitro de líquido o en gramo de material sólido. Los métodos de cuantificación están basados en mediciones directas o indirectas de muestras muy pequeñas, después se determina mediante cálculos el tamaño de la población total. Los métodos recomendados para medir la población son: Recuento en placa Siembra por vaciado en placa. Filtración Recuento directo al microscopio (cámara de Neubauer). Diluciones seriadas. Siembra por extensión con varilla Método del número más probable 58

59 Hay otros 3 métodos llamados indirectos. 1.- Turbidimetría. 2.- Actividad metabólica. 3.- Peso seco. Es posible determinar la densidad celular empleando métodos más sencillos. Nos basta con una cámara de conteo celular, por ejemplo la cámara de Neubauer, y un microscopio. Para determinar la viabilidad celular se emplean diferentes métodos. El más común es el de tinción con azul tripán. El azul tripán es un coloide que se introduce en el interior de las células que presentan roturas en la membrana. Es importante diferenciar entre el crecimiento de las células individuales y el crecimiento de poblaciones de células (proliferación). El crecimiento de una célula es el aumento en su tamaño y peso y generalmente es la antesala de la división celular. Por otra parte, la proliferación es el aumento del número de células a consecuencia del crecimiento y la división celulares. Una vez que se proveen de nutrientes necesarios al microorganismo, la célula empieza a crecer y/o a producir algunos metabolitos. Fase del crecimiento En un cultivo microbiano todas las partes están sujetas a las mismas condiciones de temperatura, ph, concentración de nutrientes, en la figura siguiente se indican diferentes fases que ocurren en un cultivo, en donde se refleja los cambios en la biomasa y en el medio ambiente. Parámetros de la curva de crecimiento Si se sigue el crecimiento de un cultivo discontinuo a través de la multiplicación de la masa, nos interesarían tres parámetros que son la producción, la tasa de crecimiento y el periodo de latencia. La producción es la diferencia entre la masa bacteriana inicial y la máxima: X = X max - X 0 La tasa de crecimiento exponencial es una medida de la velocidad del crecimiento celular (velocidad específica de crecimiento celular) se designa con la letra griega μ en la fase exponencial del crecimiento. Se calcula a partir de las densidades bacterianas X 0 y X t en los tiempos t 0 y t, en la fase de crecimiento exponencial según Hay una serie de métodos para medir el crecimiento bacteriano. Algunos métodos miden el número de células, otros la masa total de la población. Las medidas de población se refieren normalmente al número de células que hay en un mililitro de líquido o en un gramo de material sólido. Los métodos que vamos a utilizar en el laboratorio de técnicas microbiológicas es el de cuenta viable por la técnica de vaciado en placa, cuenta directa al microscopio utilizando una cámara de Neubauer y por turbidimetría que es un método indirecto que mide la densidad de una suspensión por su extinción, en algunas ocasiones se utiliza el nefelómetro. 59

60 3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS MATERIAL Un matraz con 100 ml de caldo Luria estéril (matraz semilla) Un Matraz de 500 ml con 100 ml de caldo Luria estéril y/o caldo glucosa sales Dos celdas y un portaceldas Pipetas de 2,5 y 10 ml estériles 3.2.-REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO NaCI ó peptona Caldo Luria EQUIPO Espectrofotómetro Autoclave Horno CEPAS: Suspensión de Escherichia coli 4.- DESARROLLO EXPERIMENTAL ENSAYO DE LOS MÉTODOS (PRIMERA SESIÓN) Un matraz de 1 L con 600 ml de agar cuenta estándar (para el vaciado en placa) 120 tubos de 16 x 150 mm con 9 ml de solución salina (para las diluciones) 40 Cajas de Petri estériles (para el vaciado en placa) Una pizeta con benzal Agar cuenta estándar Caldo glucosa sales al 5 % Incubadora a 37 C Contador de colonias Cámaras de Neubauer Suspensión de Saccharomyces cerevisiae 4.1 TURBIDIMÉTRIA. Para este primer ensayo no es necesario trabajar en condiciones de esterilidad De la suspensión de S. cerevisiae, seguir las indicaciones del profesor para leer la absorbencia en el espectrofotómetro. a) Colocar en el espectrofotómetro una portacelda y bloquear el paso de luz b) Encender el espectrofotómetro y dejarlo calentar por 5 minutos, seleccionar la longitud de onda (540 nm) y la región visible c) Colocar en una celda espectrofotométrica 3 ml de caldo Luria, este tubo será el blanco d) En la otra celda colocar aproximadamente 3 ml de la suspensión a leer e) Limpiar con papel sanitario la celda, tomarlo con los dedos por la boca del tubo y colocar el blanco en el portacelda. Acomodar la portacelda para dejar pasar la luz y ajustar a cero de absorbencia. f) Una vez ajustado a cero, bloquear el paso de luz e insertar la celda de la suspensión a leer, previamente limpiada con papel sanitario. g) Cuando la lectura se estabilice más o menos 3 segundos, tomar la lectura. h) Bloquear el paso de luz y retirar la celda, vaciar el contenido en un recipiente con benzal y enjuagar la celda dos o tres veces con benzal. i) Una vez leída la muestra, apagar el espectro y retirar la portacelda. Nota: Las celdas nunca se lavan con escobillón, no se colocan en una gradilla, para ello se entregaran en un vaso 4.3 CUENTA DIRECTA EN CÁMARA DE NEUBAUER a) Tomar la cámara y limpiarla con una torunda impregnada con alcohol, con mucho cuidado, ya que el cuadriculado al frotarlo bruscamente se puede borrar. 60

61 b) La torunda depositarlo en un recipiente que contenga benzal, de la misma manera limpiar el cubreobjetos (cubrehematocimetro) y colocarlo sobre la cámara. c) Con una pipeta coloca la muestra de S. cerevisieae, entre la cámara y el portaobjetos, para que por cohesión se llene la cámara, La cámara de Neubauer es una cámara de conteo. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm., con una separación entre dos líneas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada y marcada le corresponde a un mm 2. La depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1 mm, y el volumen es de 0.1 mm 3, es decir 0.1 µl. d) Colocar la cámara en la platina y enfocar con 10 y 40 X e) Contar para las levaduras en los cuadrantes denominados en la figura A,B.C y D, sumar los valores obtenidos, sacar un promedio; multiplicar por y las unidades son células/ml. f) Retira la cámara, límpiala y ahora coloca una muestra de E. coli, pero ahora utiliza el cuadrante de en medio y contar los cuadros sombreados, de igual forma contar el número de células, sumarlos y obtener el promedio, después multiplicar por 25 y luego por , obteniéndose No. de células/ml. 4.3 DILUCIONES PARA REDUCCIÓN DE CARGA MICROBIANA a) La muestra se toma en condiciones de esterilidad, tomar 1 ml del matraz cinética y colócalo en un tubo que contenga 9 ml de solución salina, para realizar la dilución Mezclar el tubo según las recomendaciones de la NOM 110 y tomar 1 ml, colocarlo en otro tubo con 9 ml de solución salina para obtener la dilución 10-2 y así sucesivamente. b) El número de diluciones que realices depende del crecimiento que encuentres por turbidimetría o en el conteo directo, si el conteo es del orden de 1x10 6, entonces realiza hasta las diluciones 10-6 y Conforme aumente el número de microorganismos aumenta el número de diluciones, recordemos que debemos tener un intervalo de conteo 4.4 CUENTA VIABLE a.- Recordar la técnica de vaciado en placa, según la NORMA Oficial Mexicana NOM-092-SSA1-1994, Bienes y servicios. Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa. 61

62 SESIÓN II Organización de las cinéticas: Se realizarán 4 cinéticas en todo el grupo con las siguientes consideraciones Cinética A Cinética B Cinética C Cinética D Equipos 1,2 y dos alumnos del equipo 5 Equipos 3 y 4 y un alumno del equipo 5 Equipos 6,7 y dos alumnos del equipo 10 Equipos 8 y 9 y un alumno del equipo ml de Caldo Luria 150 ml de CGS al 5% 150 ml de Caldo Luria 150 ml de CGS al 5% Volumen del inóculo Si la As es de ml 10 ml 10ml 4.5 PREPARACIÓN DE MATRAZ SEMILLA (DIA 1 y generalmente lo hace el profesor) a) Inocular en condiciones de esterilidad un matraz conteniendo 50 ml de caldo Luria estéril con 2.5 ml de una suspensión de Escherichia coli de 18 horas de cultivo. b) Incubar a 35 C por 18 h en agitación aproximadamente a 120 rpm. Éste será el matraz semilla. 4.6 PREPARACIÓN DEL MATRAZ CINETICA (DIA 2) Trabajo para el profesor a) El día de la cinética tomar en condiciones de esterilidad 4 ml y medir la turbidez y de acuerdo a este valor indicará a los alumnos cuanto inocular en su matraz cinética b) De lo que quede en la pipeta realizar una tinción de Gram para verificar la pureza. 4.7 INOCULACIÓN DE MATRAZ DE CINÉTICA Trabajo para los alumnos 1.- Enjuagar una celda espectrofotométrica con benzal y luego en condiciones de esterilidad enjuagarla con alcohol, ahora con una pipeta estéril tomar 4 ml de caldo Luria o CGS del matraz de cinética y colocarlo en la celda espectrofotomérica y colocarle parafilm (este es el blanco para ajustar el espectro y poder leer cada lectura). 2.- Homogeneizar la suspensión microbiana del matraz semilla y tomar el volumen indicado por el profesor que puede ser 5 o 10 ml de esta suspensión en condiciones de esterilidad e inocular el matraz con caldo Luria o CGS para la cinética y mezclar perfectamente, anotar este tiempo (t 0 ) 3.- Con una pipeta de 5 ml estéril tomar 5 ml inmediatamente y dar el matraz a un compañero para que lo lleve a incubar y agitar. El alumno que tiene la pipeta con la muestra realizará lo siguiente en este orden: a.- Colocar 1 ml en un tubo de dilución y darle el tubo a otro compañero para que realice las diluciones pertinentes, según el cuadro de diluciones, siguiendo las recomendaciones de la NOM 110, sembrará las dos últimas diluciones por la técnica de vaciado en placa siguiendo las recomendaciones de la NOM 092. Dejar solidificar e incubar. Una vez depositado el ml en el tubo de dilución se puede apagar el mechero b.- Tomar la otra celda espectrofotométrica y colocar aproximadamente 3.5 ml, colocar la celda en el vaso de precipitados que contiene la celda (blanco) y se la dará a un compañero para que realice la lectura en el espectrofotómetro. (Esta segunda celda no es necesaria sanitizarla) d.- De lo que queda en la pipeta colocar una gota en la cámara de Neubauer y dársela al 62

63 compañero que va a realizar el conteo en el microscopio. e.- Con lo que queda en la pipeta realizar un Gram para corroborar la pureza del matraz semilla y desechar la pipeta en el benzal. f.- Este procedimiento se hace según el cuadro de tiempos de toma de muestra g.- Incubar las placar a 35 / 24 h y realizar el conteo 5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO 5.1 Anota los resultados obtenidos. As del matraz semilla: Tiempo Tiempo real en min Absorbencia 540 nm Cuenta directa UFC / ml To T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 63

64 5.2 Cuenta viable por vaciado en placa: Anota el número de UFC/ ml. Tiempo Conteo Promedio Resultado To Dilución 10 Placa 1 = Placa 2 = Dilución 10 Placa 1 = Placa 2 = T1 Dilución 10 Placa 1 = Placa 2 = Dilución 10 Placa 1 = Placa 2 = T2 Dilución 10 Placa 1 = Placa 2 = Dilución 10 Placa 1 = Placa 2 = T3 Dilución 10 Placa 1 = Placa 2 = Dilución 10 Placa 1 = Placa 2 = T4 Dilución 10 Placa 1 = Placa 2 = Dilución 10 Placa 1 = Placa 2 = T5 Dilución 10 Placa 1 = Placa 2 = Dilución 10 Placa 1 = Placa 2 = T6 Dilución 10 Placa 1 = Placa 2 = Dilución 10 Placa 1 = Placa 2 = T7 Dilución 10 Placa 1 = Placa 2 = Dilución 10 Placa 1 = Placa 2 = T8 Dilución 10 Placa 1 = Placa 2 = Dilución 10 Placa 1 = Placa 2 = 64

65 5.3.3 Es posible diferenciar células muertas de las vivas? Construye una gráfica del número de UFC/ml vs Tiempo, señalando en la curva las diferentes zonas de crecimiento Construye una gráfica del número de UFC/ml vs Tiempo (horas) Construye una gráfica del log del número de UFC/ml vs Absorbencia Determina la velocidad específica de crecimiento máxima Calcula el tiempo de generación de la cepa estudiada Define el término velocidad específica de crecimiento Menciona los factores de que depende la fase de muerte Por qué es importante la cinética microbiana? 6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 6.1 Discute las ventajas y desventajas de los métodos empleados. 6.2 Analiza y discute sobre la base de lo anterior y a la investigación bibliográfica realizada, los resultados obtenidos en esta práctica. 6.3 Discute la conveniencia o no de construir una curva de calibración con los resultados de turbidimetría y de cuenta viable para un microorganismo dado, de ser conveniente explica para qué podrá servir. 7. CONCLUSIONES Elabora las conclusiones sobre la base de los resultados obtenidos, al análisis y discusión de estos, a la bibliografía consultada y a los objetivos de la práctica. 8. BIBLIOGRÁFIA Atlas, R. W Microbiology. Second edition. Mc. Millan Public, U. K. 807 pág Moat, A. G., J. W. Foster, M. P. Spector Microbial Phisiology. Fourth edition. Wiley-Liss, USA. 715 pág Brock, T.D.; Smith y M.T. Madigan Biología de los Microorganismos. Octava edición. Prentice Hall, España. 956 pág Stanbury, F. Peter, A. Whitaker, S. Hall Principles of Fermentation Technology. Second edition. Pergamon Press, Oxford. 376 págs Reina, Manuel Contaje de células: cámara de Neubauer. Departamento de Biología Celular. Universidad de Barcelona. Última actualización 20 de octubre de