Simposio Inmunohematología Molecular

Transcripción

1 Simposio Inmunohematología Molecular Genotipificación de antígenos plaquetarios Dra. Rocio Trueba Gómez Investigadora en Ciencias Hematología Perinatal

2 Células sanguíneas Aloinmunización HEA (2%) (Human Erithrocyte Antigens) 35 sistemas, series y colecciones HLA-I Otros CD s HPA (8%) (Human Platelet Antigens) 6 sistemas bialélicos, 33 antígenos HLA-I ABO, H, Lewis, I P selectina Otros CD s HNA (20%) (Human Neutrophil Antigens) 5 sistemas ABO HLA-I L selectina Otros CD s Eritrocitos: Plaquetas:

3 Identificación de antígenos plaquetarios. Fenotipificación: MAIPA (Anticuerpos monoclonales específicos contra antígenos plaquetarios inmovilizados) Metodología de referencia en la inmunología plaquetaria Identificación de anticuerpos plaquetarios específicos GPIIB-IIIa, GPIb-IX, GPIa-IIa, HLA de clase I. Caracterización de aloanticuerpos plaquetarios mediante pruebas cruzadas (suero de la madre y plaquetas del padre, suero del paciente y plaquetas de diferentes genotipos) Genotipificación: Extracción del DNA genómico PCR por diferentes metodologías (SSP, RFLP, etc)

4 Aloantígenos plaquetarios clínicamente relevantes Comunes: Antígenos del sistema ABO y HLA de clase I. Específicos: HPA (Antígenos plaquetarios humanos).

5 Antígenos plaquetarios HPA Son las porciones polimórficas de las glicoproteínas (GPs) de la membrana plaquetaria capaces de generar una respuesta inmune en individuos susceptibles al ser expuestos durante el embarazo o la trasfusión. Neonatal alloimmune thrombocytopenia: pathogenesis, diagnosis and management Julie A. Peterson,1 Janice G. McFarland,2 Brian R. Curtis2 and Richard H. Aster1,3

6 Antígenos plaquetarios específicos Hasta la fecha, se han definido serológicamente 33 antígenos plaquetarios. Los HPA son el resultado de polimorfismos genéticos. Se han caracterizado que en 23 de estos son generados por polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), el HPA14bw es generado por la deleción de una base. Doce HPA se agrupan en seis sistemas bialélicos (HPA-1--5 y -15), The Immuno PolymorphismDatabase, EMBLEBI;

7 Antígenos plaquetarios específicos Los polimorfismo de antígenos plaquetarios humanos (HPA) conduce a aloinmunización y trastornos plaquetarios autoinmunes incluyendo trombocitopenia fetal neonatal aloinmune (TNAI), púrpura postransfusional (PPT) y refractariedad a transfusión de plaquetas (RTP). La tipificación de los HPA y el conocer la frecuencia de los antígenos en una población es importante, en particular para poder proveer plaquetas HPA compatibles a pacientes con refractariedad a trasfusión de plaquetas.

8 Sistemas HPA bialélicos. Antígeno HPA 1a HPA 1b HPA 2a HPA 2b HPA 3a HPA 3b HPA 4a HPA 4b HPA 5a HPA 5b HPA 15a HPA 15b Glicoproteína / Cambio de aminoácido Gen codificante / Cambio de Nucleótido Enfermedad asociada. GPIIIa / L33P TGB3 / T196C TAFN, PPT GPIα / T145M GPIAB / C524T TAFN, PPT GPIIb / I8433S ITGA2B / T2621G TAFN, PPT GPIIa / R143Q ITGB3 / G526A TAFN, PPT GPIa /E505K ITGA2 / G1648A TAFN, PPT CD109 / Y203S CD 109 /A2108C TAFN, PPT

9 Antígenos HPA de baja frecuencia Antígeno GPIIb Glicoproteína / Cambio de aminoácido Gen codificante / Cambio de Nucleótido Enfermedad asociada. HPA-9bw GPIIB / V837M ITGA2B / A2603G TFNAI HPA-20bw GPIIB / C1949T ITGA2B / C1949T TFNAI HPA-22bw GPIIB / A585C ITGA2B / A585C TFNAI HPA-24bw GPIIB / G1508A ITGA2B / G1508A TFNAI HPA-27bw GPIIB / C2614A ITGA2B / A2614A TFNAI GPIIIa HPA-6bw GPIIa / R489Q ITGB3 / A1564G TFNAI HPA-7bw GPIIa / P407A ITGB3 / G1317C TFNAI HPA-8bw GPIIa / R633C ITGB3 / T2004C TFNAI HPA-10bw GPIIa / R62Q ITGB3 / A281G TFNAI HPA-11bw GPIIa / R633H ITGB3 / A1996G TFNAI Antígeno GPIIIa Glicoproteína / Cambio de aminoácido Gen codificante / Cambio de Nucleótido Enfermedad asociada. HPA-14bw GPIIa / K611del ITGB3 / AAG TFNAI HPA-16bw GPIIa / T140I ITGB3 / C517T TFNAI HPA-17bw GPIIa / T195M ITGB3 / C622T TFNAI HPA-19bw GPIIa / K137Q ITGB3 / A487C TFNAI HPA-21bw GPIIa / E628K ITGB3 / G1960A TFNAI HPA-23bw GPIIa / R622W ITGB3 / C1942T TFNAI HPA-26bw GPIIa / K580N ITGB3 / G1818T TFNAI GPIb HPA-12bw GPIbβ / g15e GPIBB / A141G TFNAI GPIa HPA-13bw GPIa / M799T ITGA2 / T2531C TFNAI HPA-18bw GPIa / Q716H ITGA2 / G2235T TFNAI HPA-25bw GPIa / T187M ITGA2 / C3347T TFNAI

10 Genotipificación de HPA Una amplia variedad de técnicas han sido descritas, desde metodologías rápidas, fáciles y de bajo costo hasta técnicas especializadas. Estos métodos han demostrado ser lo suficientemente confiables para reemplazar la tipificación serológica.

11 Metodologías para genotipificación de HPA Bajo Rendimiento: PCR secuencia específica (PCR-SSP) PCR con restricción de fragmentos (PCRRFLP) PCR con análisis de Curvas de Fusión Mediano a Alto Rendimiento Q-PCR (Fluorocromos no específicos, Sondas de Hibridación, Sondas de hidrólisis) Q-PCR Multiplex MLPA Secuenciación masiva. Secuenciación Sanger. Plataformas comerciales de microarreglos: BioArray HEA BeadChip System BloodChip Reference HIFI Blood 96 ID-Core XT SNaPshot Multipex System The GenomeLab SNPstream Genotyping System MALDI-TOF/MS

12 Antígenos plaquetarios Interés del estudio de los antígenos plaquetarios Importancia diagnóstica, pronóstica y terapéutica en los cuadros clínicos asociados a la aloinmunización. La trombocitopenia feto-neonatal aloinmune (TFNA) La púrpura trombocitopénica postransfusional (PTP) La trombocitopenia pasiva postransfusional (TPP) La refractariedad a la transfusión de plaquetas (RTP). B. R. Curtis & J. G. Mc Farland. Human platelet antigens Vox Sanguinis de la ISBT International Society of Blood Transfusion

13 Alloanticuerpos Trombocitopenia neonatal alloinmune Purpura postransfusional Refractariedad a transfusión plaquetaria Anticuerpo Frecuencia anti-hpa-1a 75% anti-hpa-5b 20% otros 5% Anticuerpo Frecuencia anti-hpa-1a 85% Anticuerpo Frecuencia anti-hpa-5b 50%? anti-hpa-1b?% anti-hpa-5a?%

14 Eventos adversos a la transfusión UK SHOT 62% de los reportes son por error humano Bolton-Maggs PH & Cohen H, BJH 2013;163:303-14

15 Trombocitopenia feto neonatal aloinmune (TFNAI) La trombocitopenia neonatal es detectada alrededor del 1%. (Hohlfeld P et al, 1994) La TFNAI se reporta en 1: en población caucásica. (Williamson LM, 1998, Kjeldsen-Kragh J, 2007) En el 75% son debidos a anticuerpos contra los HPA-1a (GPIIIa), en el 15% contra HPA-5b (GPIIa) en caucásicos. En asiáticos, el principal anticuerpo es contra HPA-4b (Ohto H et al, 2004). La hemorragia intracraneal asociada a la TFNAI se observa en 1:12,500-25,000 casos, alrededor del 10% de los niños mueren, el 20% pueden tener secuelas neurológicas graves. (Kjeldsen-Kragh J et al,2007).

16 Trombocitopenia neonatal aloinmune y Enfermedad hemolítica aloinmune TFNAI EHRN Células afectadas Plaquetas Eritrocitos Antigeno mas común HPA-1a RhD Embarazo afecctado Primero Segundo + Tiempo de la sensibilización Desde la semana 16 Al nacimiento Afectación en el RN Trombocitopenia, hemorragia Hemólisis, ictericia, kernicterus Afectación en el Feto Hemorragia intracraneal Hidrops fetal Principal factor de riesgo Hijo previamente afectado Madre RhD negativo Tratamiento Soporte Sorporte Prevención IVIG Anti-D Eficacia de la prevención? 99%

17 Caso clínico Karina 30 años, G3. A1 (1er trimestre) C2, GII y GIII con muerte neonatal temprana, ambos con síndrome purpúrico. A1 RhD Negativo, cde/cde, originaria de Veracruz. Cónyuge 32 años, O RhD Positivo, CDe/cDE, de Michoacan. Ambos sin antecedentes patológicos personales. Se excluyeron otras causas de trombocitopenia neonatal. RN 1 masculino RN 2 femenino

18 Resultados Estudios serológicos En la madre se identificó Anti-D 1:8. Anticuerpos antiplaquetarios contra GPIIb/IIIa (HPA-1, HPA-4), GPIa/IIa (HPA-5), GPIb/IX (HPA-2,HPA-12) negativos. Anticuerpos antiplaquetarios contra HLA-I IgG positivos. Peterson JA et al, 2013

19 Resultados Genotipado plaquetario ID HPA xmap, PROGENIKA Madre genotipo Fenotipo inferido Padre genotipo Fenotipo inferido HPA1a/1a HPA1a+b- HPA1a/1a HPA1a+b- HPA2a/2a HPA2a+b- HPA2a/2a HPA2a+b- HPA3a/3b HPA3a+b+ HPA3a/3b HPA3a+b+ HPA4a/4a HPA4a+b- HPA4a/4a HPA4a+b- HPA5a/5b HPA5a+b+ HPA5a/5a HPA5a+b- HPA6a/6a HPA6a+bw- HPA6a/6a HPA6a+bw- HPA7a/7a HPA7a+bw- HPA7a/7a HPA7a+bw- HPA8a/8a HPA8a+bw- HPA8a/8a HPA8a+bw- HPA9a/9a HPA9a+bw- HPA9a/9a HPA9a+bw- HPA10a/10a HPA10a+bw- HPA10a/10a HPA10a+bw- HPA11a/11a HPA11a+bw- HPA11a/11a HPA11a+bw- HPA15b/15b HPA15a-b+ HPA15a/15b HPA15a+b+

20 Conclusiones. La genotipificación plaquetaria permitió demostrar la incompatibilidad al antígeno plaquetario HPA-15a, causante de la trombocitopenia aloinmune neonatal severa. Este resultado aunado a la aloinmunización al RhD son criterios pronósticos para el futuro reproductivo de la pareja. No existe un ensayo comercial disponible para identificar la aloinmunización por HPA-15.

21 Conclusiones. Se desconoce la prevalencia de la trombocitopenia feto neonatal aloinmune y la especificidad de los anticuerpos en nuestro país. La genotipificación de los HPA ofrece una opción accesible y disponible para el diagnóstico de trombocitopenias inmunológicas.

22 Y luego?? Genotipificación de HPA: Donadores recurrentes. Parejas con pérdida gestacional recurrente.

23 Gracias.