Principales mecanismos de resistencia a antimicrobianos en P. aeruginosa y A. baumannii
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- Cristián Rubio Caballero
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1 Principales mecanismos de resistencia a antimicrobianos en P. aeruginosa y A. baumannii Felipe Fernández Cuenca Hospital Virgen Macarena y Universidad de Sevilla
2 Importancia clínica y epidemiológica Ampliamente distribuido en la naturaleza (suelo, agua, plantas, animales). Adaptación al medio hospitalario: Requerimientos nutricionales mínimos. Tolera un amplio rango de temperaturas. Elevada resistencia intrínseca. Adquisición de resistencia. Colonización e infección (patógeno oportunista). Brotes nosocomiales (clones epidémicos). Infecciones difíciles de controlar y de tratar.
3 Tasas de resistencia a antimicrobianos P. aeruginosa A. baumannii HUV Macarena (UCI) % resistencia 25% 22% 19% 16% 16% 20% 9% 3% 15% 10% 5% 0%
4 Mecanismos de resistencia a antimicrobianos 1) Intrínseca o natural (cromosómica). 2) Adquirida: 2.1) Endógena: Mutación en genes propios. Inactivación, modificación o cambio en el nivel de expresión. 2.2) Exógena: Transferencia horizontal de determinantes de resistencia a través de plásmidos, transposones o integrones.
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6 Pseudomonas aeruginosa Mecanismos de resistencia a antimicrobianos Βeta-lactámicos Aminoglucósidos Quinolonas
7 1. Mecanismos de Resistencia a β-lactámicos Resistencia natural Resistencia adquirida
8 1.1. Resistencia natural Fenotipo de resistencia natural Aminopenicilinas Amoxicilina/clavulánico Ampicilina/sulbactam CF-1 y CF-2 Cefotaxima, Ceftriaxona Mecanismos de resistencia intrínsecos Baja permeabilidad de la membrana externa (porinas). Expresión basal de bombas de expulsión (MexAB-OprM. Producción basal de una beta-lactamasa de tipo AmpC. Alteraciones en PBPs?.
9 1.2. Resistencia adquirida Mutación Genes reguladores de la producción de β- lactamasas Hiperproducción de β-lactamasas (AmpC) Inactivación del antibiótico. Genes reguladores de bombas: Sobreexpresión de bombas de expulsión. Múltiples antimicrobianos: betalactámicos, quinolonas, AG) y biocidas. Inactivación o disminución de la expresión de porinas Disminución de la permeabilidad ME. Diana (PBPs): disminución de afinidad por el antibiótico.
10 Transferencia horizontal de genes de resistencia Beta-lactamasas secundarias 1. Clase A (espectro ampliado y espectro extendido). 2. Clase B (metalo-beta-lactamasas). 3. Clase D (Oxacilinasas).
11 Mecanismos de resistencia a carbapenemas (único o multifactorial) 1) Disminución de permeabilidad de la ME 2) Sobreexpresión de bombas de expulsión 3) Hiperproducción de AmpC + disminución permeabilidad ME (porinas; OprD) 4) Adquisición de carbapenemasas
12 1) Membrana externa OprF: inespecífica. OprD: específica (gluconato, AA Ceftazidime Cefotaxime Cefepime E. coli E.coli básicos, péptidos, IMIPENEM) implicada en resistencia antimicrobiana. ZINC DECREASES OprD LEVE aeruginosa: RESISTANCE TO IM E. cloacae E.cloacae P. aeruginosa P.aeruginosa Rates of cephalosporins permeation through porin channels (Nikaido et al., 1990) OprD OprD veces menos permeable que EB MH SLUC Zn 2+ MH P. aeruginosa PAO1 P. aerugi
13 Loss of OprD porin in P. aeruginosa RNA expression of oprd IS within oprd PCR amplification of oprd Walters et al, FEMS ML 2004 La disminución de expresión o la pérdida de la porina OprD afecta más a IMP que MPM. Inactivación por ISs. Mutantes OprD: CMI a IMP de 8-32 mg/l y CMI de MPM de 2-4 mg/l. Nivel de resistencia variable dependiendo del nivel de producción de AmpC
14 EFFLUX SYSTEMS MAJOR FAMILIES 2) Bombas de expulsión 1. MFS: Major Facilitator Superfamily 2. RND: Resistance Nodulation-Division 3. SMR: Small Multidrug Resistance 4. ABC: ATP-Binding Cassette 5. MATE: Multidrug And Toxic Extrusion
15 EXPRESSION OF ACTIVE EFFLUX 1. BASAL EXPRESSION 2. OVEREXPRESSION Active efflux is present in both (clinically) susceptible and resistant organisms BASAL EXPRESSION OF EFFLUX SYSTEMS Constitutively Expressed: MexAB-OprM, AcrAB-TolC, Inducible systems: MexXY-OprM, Silent in wild type strains: MexCD-OprJ, MexEF-OprN, INTRINSIC RESISTANCE CONTRIBUTED BY CONSTITUTIVE AND INDUCIBLE SYSTEMS
16 Sobreexpresión de bombas de expulsión La hiperproducción de MexAB-oprM se produce por el aumento de la transcripcion del operón mexab-oprm causada por mutaciones en el represor mexr. Afecta a MPM pero no IMP. Ello se debe a la presencia de una cadena lateral hidrofóbica en la posición 2. Imipenem es hidrofílco y posee una fuerte carga. mexe-mexf-oprn oprd mext mexe mexf oprn (-) (+) MexEF-OprN Resistencia a IMP por expresión reducida de OprD (coregulación). A diferencia de las demás bombas ésta se regula positivamente por MxT.
17 Efflux + OprD OprM/OprD IN P. aeruginosa OprM OprD IMP MPM CRB
18 3) Hiperproducción de AmpC Actividad cefalosporinasa. Clase molecular C (clasificación de Ambler). No se inhibe por IBL clásicos usados en clínica (CLV, SUL, TAZ). CLV antagoniza. Cromosómica (ampc). Genes reguladores. Expresión de bajo nivel (basal). Hiperproducción (resistencia adquirida).
19 Inducible. 1) La resistencia puede inducirse por inductores: ( veces por un inductor fuerte; IMP, FOX). 2) Relevancia clínica: puede adquirirse durante ei tratamiento por la selección de mutantes con AmpC desreprimida.
20 4) Adquisición de genes de Beta-lactamasas secundarias (plasmídicas) Espectro reducido: OXAs, TEM, PSE, CARB. BLEE tipo TEM u OXA. Carbapenemasas tipo MBL (VIM o IMP). Clase Grupo funcional Propiedad Ejemplo Inhibición A 2b Amplio espectro TEM1, TEM2 CLV A 2c Carbenicilinasa PSE-n, CARB-n CLV D 2d Oxacilinasas OXA-n A 2be Espectro extendido PER-1, TEM-42 CLV B 3 Metaloenzimas IMP, VIM EDTA
21 Carbapenemasas (I) La mayoría son MBL (clase B): IMP, VIM, SPM-1, GIM-1 Requieren Zn2+ en su centro activo. Resistencia a todos los BLs, incluidas las CPs (IMP y MPM). No hidrolizan AZT. No se inhiben por CLV ni TAZ. Sólo se inhiben en presencia de quelantes de iones divalentes (EDTA). Integrones de clase 1. 5'conserved segment inti atti P atti cassette 1 attc1 attc1 5 CS Structure of complex class 1 integrons In6, In7, In35 and In60 Arduino and al., 2002, AAC, 46 (7), cassettes qaced1 sul1 orf513 3 segment cata2 Région 3 In6 cassette 2 atti attc2 attc2 attc1 dfra10 bla CTX-M-2 orf3 In7 In35 Integron structure bla CTX-M-9 orf orf1005 In60
22 Métodos fenotípicos para detectar la producción de Cpasas (I) Problemas detección fenotípica con EDTA, sobre todo si se hiperproduce AmpC. Medios cromogénicos Test de Hodge modificado CAZ EDTA Métodos colorimétricos IMP No hay datos sobre la utilidad del test de Hodge en BGNNF.
23 Métodos moleculares para detectar la producción de Cpasas (I) 4.5 hours
24 Métodos moleculares para detectar la producción de Cpasas (II) MALDI-TOF
25 Mecanismos de Resistencia a los Aminoglucósidos Disminución permeabilidad ME: Afecta a todos los AG. Pacientes FQ Producción de varias enzimas modificadoras de AG (más frecuente). Fosfotransferasas, adeniltransferasas, acetiltransferasas. Plásmidos Sobreexpresión de bombas tobramicina Modificación de la diana (menos frecuente): Metilasas: metilación del ARNr 16S. Transposones localizados en plásmidos (menos frecuente): MexXY-OprM:
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27 Mecanismos de Resistencia a las Quinolonas 1. Resistencia natural/intrínseca/cromosómica Resistencia natural a NAL. Bombas (roducción basal de MexAB-OprM) y ME (porinas). 2. Resistencia adquirida Mutacional. Adquisición de genes plasmídicos
28 1) Mutaciones cromosómicas Disminución afinidad de la diana: a) Mutaciones en gyra, gyrb (ADN girasa). A. nalidíxico Ofloxacino Ciprofloxacino b) Mutaciones en parc, pare (topoisomerasa IV). Disminución permeabilidad de la pared celular: a) Porinas. b) LPS. Sobreexpresión de bombas de expulsión activa: a) MexAB-OprM. b) MexCD-OprJ. c) MexEF-OprN. d) MexXY-OprM.
29 2) Plásmidos Resistencia plasmídica a quinolonas Protección de la diana: qnr Modificación del antimicrobiano: aac(6 )Ib-cr Trp102Arg Asp197Tyr Ciprofloxacino Norfloxacino Sistemas de expulsión: - QepA MFS - OqxAB RND Mecanismos que confieren bajo nivel de resistencia a quinolonas
30 Detección de resistencia a quinolonas en el laboratorio 1) Métodos fenotípicos Carboxilciadina m-clorofenilhidrazona (CCCP) Fenil-arginil-naftilamida Reserpina 2) Métodos moleculares
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32 Frecuencia de mutación espontánea aumentada veces Elevada prevalencia de cepas hipermutadoras en infecciones crónicas: 30-60% en pacientes con FQ. 57% en pacientes con bronquiectasias o EPOC
33 Hipermutación y multirresistencia en P. aeruginosa Hipermutación y multirresistencia en bronquiectasias y EPOC %resistant Antibiotic Overall (62) Hypermutable (33) Non-hypermutable (29) Ceftazidime Imipenem Meropenem 17.7% 14.5% 3.2% 35.5% 30.3%* 27.3%* 6.1% 51.5%* 3.5% 0% 0% 17.5% Ciprofloxacin Tobramycin 9.7% 15.2% 3.5% 2 antibiotics 22.6% 42.4%** 0% *p<0.01, **p< Maciá et al AAC 2005
34 Antibiotic tolerance (biocapas) 1. Slower or stationary growth phase. 2. Production of biofilm. 3. Quorum sensing. 4. Decreased diffusion of antibiotics through the matrix polysaccharide alginate. 5. Synthesis of glucans that specifically bind antibiotics. 6. Phenotypic variability. 7. Peresence of persister cells.
35 Nuevas líneas de investigación
36 Alteraciones en PBPs Baja afinidad de PBP-4 por IMP. Mutation of P. aeruginosa PBP4 determines an AmpRdependent overexpression of the β-lactamase AmpC.
37 Genes estructurales y reguladores globales Secuenciación masiva
38 Acinetobacter baumannii
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41 Resistencia antimicrobiana Elevada resistencia intrínseca. Facilidad para adquirir genes de resistencia microbiana. Resistencia intrínseca y adquirida suele ser multifactorial.
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47 Heterogeneidad estructural
48 Cromosómica A. baumannii
49 Subgrupo OXA-23
50 33 veces 8 veces
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52 MOVILIZACION
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54 8 vece: menos que OXA-24
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56 Tipo de IS
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58 CLASE B (METALO-BETA-LACTAMASAS)
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61 Combinaciones de CPasas
62 The Resistance Island Fournier et al., PLoS Genet Jan;2(1):e7. Epub 2006 Jan 13. AbaR1-24!
63 DISMINUCION PERMEABILIDAD MEMBRANA EXTERNA
64 Sato K, Nakae T Outer membrane permeability of Acinetobacter calcoaceticus and its implication in antibiotic resistance. J. Antimicrob. Chemother. 28: Reducido Nº de porinas y de pequeño tamaño 2012 Coeficiente de permeabilidad para CF
65 SDS PAGE of outer membrane protein extractions of isolates A, B and C. No significant changes in porin expression were detected. 43 kda 29 kda Resistencia IMP Zander E et al. J. Antimicrob. Chemother. 2013;68:
66 The A. baumannii OprD homologue is likely not involved in the carbapenem resistance mechanism
67 El canal de CarO tiene un sitio de unión a IMP, pero no MPM, por lo que esta porina podrría tener algún papel en la resistencia a IMP (disminución de expresión o inactivación génica)
68 La ausencia de CarO se debe a la incativación del gen por SI: (ISAba1). Lu Pl, He C, 2011 ISAba825. Ravasi P, 2011 ISAba10. Lee Y, 2011
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70 Sobreexpresión de bombas de expulsión activa
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74 Proteínas fijadoras de Penicilina
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76 Gehrlein M, et. al. Chemotherapy, Comparación perfiles PBPs cepa sensible y cepa isogénica resistente a IMP. Siete PBPs: 94, 84, 65, 61, 48, 40 and 24 kd. Aumento de producción de la PBP de 24 kd en la cepa resistente a IMP.
77 73.2-kDa PBP named PBP2
78 Resistencia fenotípica heterogénea a carbapenemas
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80 Nuevas líneas de investigación
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83 Resistoma
84 Dinámica de clones epidémicos (epidemiología)
85 Virulencia/ patogenia
86 Apoptosis mediada por OmpA
Aminopenicilinas. Cefalosporinas 1G. Cefalosporinas 2G. Cloranfenicol. Eritromicina. Trimetoprim. XIII Reunion de la seimc, sevilla 2009
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