Diagnóstico de leucemia mediante bcr/abl

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1 A bcr-abl leukemia diagnosis Iván Hernández Ramírez* Jaime Alberto Gavilanes Caicedo** Recibido: 25 de octubre del 2010 Aprobado: 30 noviembre del 2010 Resumen Introducción: es posible identificar los individuos portadores de genes involucrados en la manifestación de la leucemia mieloide crónica (LMC) mediante el análisis del punto de quiebre cromosómico secuencia de nucleótidos pertenecientes al ADN, ubicada en uno de los brazos cromosómicos cuya presencia facilita la rotura, translocación e inserción del segmento, como en la fusión (b3-a2) de los exones b3 correspondiente al gen bcr (major breakpoint cluster) y el exón a2 correspondiente al gen abl (Abelson); estos conforman una banda de 417pb, indicando una muestra positiva (LMC). Metodología: aplicando la prueba molecular RT-PCR relacionada con el modelo marcador molecular pesado (MWM) bcr/abl p210 en pacientes diagnosticados con LMC, se puede describir el transcripto en cada uno de ellos, estableciendo la relación transcripto-enfermedad. Resultados: el 62,5% de los pacientes positivos para la secuencia presentó LMC y hubo mayor prevalencia en mujeres. Conclusión: la prueba para detección de los trascriptos en t(9;22), según el modelo molecular aplicado, mejora el diagnóstico de leucemia mieloide crónica. Palabras clave: cáncer ocupacional, cromosoma Ph., genes abl/bcr, leucemia mieloide crónica, locus. Abstract Introduction: upon analyzed a DNA-nucleotide sequence chromosomal breakpoint located in a chromosomal arms whose presence facilitates the breakage, translocation and insertion of the segment as well as the merger case (b3-a2) of b3 exons of the gene BCR (major breakpoint cluster) and a2 exon of the gene abl (Abelson), which form a band of 417pb indicating a positive sample, it is possible to identify gen carriers involved in the manifestation of Chronic Myeloid Leukemia (CML). Methodology: applying an RT-PCR molecular test related to the model molecular weight marker (MWM) bcr/abl p210, in patients diagnosed with CML, so transcript can be described on them establishing a transcript-disease relationship. Results: 62,5% of patients positive for CML and the sequence showed a higher prevalence of CML in women. Conclusion: the test for the detection of transcripts in t(9;22) according to the molecular model applied has improved the diagnosis of chronic myeloid leukemia. Keywords: abl/bcr genes, chronic myeloid leukemia, locus, occupational cancer, Ph chromosome. Cómo citar este artículo: Hernández Ramírez I, Gavilanes Caicedo JA. Diagnóstico de leucemia mediante bcr/abl. Revista Memorias. 2011; 9(15): * ** Docente investigador del Programa de Medicina de la Universidad Cooperativa de Colombia, sede Pasto. Biólogo Genético de la Universidad del Valle. Especialista en Epidemiología del Centro de Estudios en Salud. Correo electrónico: ivanhernandezramirez@yahoo.es Docente investigador del Programa de Medicina de la Universidad Cooperativa de Colombia, sede Pasto. Médico de la Universidad Central del Ecuador (Quito). Especialista en Medicina Interna de la Universidad del Cauca. Correo electrónico: jaime.gavilanes@campusucc.edu.co 9

2 Introducción La leucemia mieloide crónica (lmc) es un síndrome mieloproliferativo crónico de naturaleza clonal, originado en la célula madre hematopoyética, que resulta en un excesivo número de células mieloides en todos los estadios de maduración. Fue la primera enfermedad maligna en que se demostró una anomalía genética adquirida, y es en la actualidad el modelo molecular de leucemia mejor estudiado (1). En la lmc se expresa la translocación cromosómica t(9; 22) (q34; q11) que da lugar a la formación del cromosoma Philadelfia (Ph) (2), (figuras 1 y 2). A causa de esta translocación se producen dos nuevos genes híbridos (3): el bcr-abl en el cromosoma 22q- o cromosoma Ph y el gen recíproco abl-bcr en el cromosoma derivado 9q+, el cual, aunque transcripcionalmente activo, no parece desempeñar ninguna actividad funcional en la enfermedad (4). En la actualidad, la identificación de la enfermedad mínima residual mediante métodos moleculares es de vital importancia para la evaluación precisa del estado evolutivo de la patología (5). Figura 1. Cariotipo de mujer con translocación (9;22) presencia de cromosoma Ph Figura 2. C-Metafase, abl/puntos rojos cromosoma 9, bcr/puntos azules cromosoma 22 La primera enseñanza derivada del empleo de las técnicas de análisis molecular en el estudio de la lmc ha sido la constatación de que la translocación que da lugar al cromosoma Ph es recíproca, es decir que consiste en un intercambio de material genético entre los cromosomas 9 y 22. Se ha podido establecer que el punto de rotura del 22 se localiza, en más del 99% de los casos, en una región específica de sus brazos largos, la denominada major breakpoint cluster region (M-bcr) o región mayor de agrupamiento de los puntos de rotura, situada en un segmento de adn de 5,8 kilobases (Kb) (6). A su vez, se ha comprobado que el cromosoma 9 transfiere al 22 un pequeño fragmento de sus brazos largos. Dicho material genético, llamado protooncogén abl por su similitud con el oncogén de la leucemia murina experimental de Abelson, parece constituir el factor clave para la aparición de la lmc, ya que su yuxtaposición a la región M-bcr da lugar a la formación del oncogén bcr-abl (7). Éste origina la síntesis de un arn mensajero quimérico bcr/ abl, que codifica la síntesis de una proteína con 10

3 Iván Hernández Ramírez Jaime Alberto Gavilanes Caicedo actividad tirosinquinasa aumentada (p210, de 210 kilodaltons), la cual controla el crecimiento y diferenciación celular, y parece ser la responsable de que las células hematopoyéticas adquieran un comportamiento neoplásico (8). Esta hipótesis viene reforzada por estudios experimentales en ratones, en los cuales la incorporación del gen de la proteína p210 a los cultivos hematopoyéticos y la posterior infusión de las colonias resultantes induce la aparición de una enfermedad similar a la lmc (9). Personas de todas las edades pueden padecer la lmc, sin embargo se hace más frecuente a medida que la edad aumenta (6). En Europa y en Estados Unidos su incidencia es entre 1 y 2 casos por cada personas por año. El promedio de edad de pacientes con lmc es de 53 años (varía de 45 a 55 años); del 12% al 30% de los hallazgos se presenta en personas con 60 años o más. Aproximadamente el 10% de los pacientes son niños y adolescentes menores de 20 años (10), y según la agencia internacional para el registro del cáncer (airc) es más frecuente en hombres que en mujeres, con una relación de 2:1. airc registra, para Colombia, aproximadamente de 400 a 800 pacientes con diagnóstico de lmc por año (incidencia), y la existencia de aproximadamente pacientes con esta enfermedad (prevalencia). El registro poblacional de cáncer de Antioquia reportó, para el 2005, casos de cáncer en el departamento, de los cuales el 4,7% (769) correspondieron a lmc. En Pasto, Nariño, aunque existe el Centro de Estudios en Salud de la Universidad de Nariño (Cesun), que registra los casos de cáncer, la información es muy difícil de obtener, razón por la cual se emplean los datos de otro organismo de registro como el del departamento de Antioquia. El Gobierno Nacional, dentro del Plan Nacional para el Control del Cáncer (PNCCa) a desarrollar entre el 2010 y el 2019, planea implementar el Sistema de Vigilancia Epidemiológica para el Control del Cáncer Ocupacional (sivecao); estudios como éste, en los que se estandariza una técnica y se evalúan marcadores para garantizar un buen diagnóstico de los diferentes tipos de cáncer ocupacional, son de gran apoyo para las metas establecidas por el PNCCa. Metodología La muestra de sangre periférica (7,5 ml), extraída del paciente diagnosticado por primera vez con Leucemia Mieloide Crónica, se transporta hasta el laboratorio de genética molecular humana de la Universidad del Valle, donde se realizó la extracción del rna y la caracterización de la translocación. Se protocolizó en la institución hospitalaria el uso de la prueba como apoyo al diagnóstico de lmc. Aislamiento de células mononucleadas Se adicionó a la muestra de sangre 7 ml de Histopaque (Sigma) en un tubo Falcon de 25 ml. El preparado se centrifugó a 400 x g durante 30 minutos a temperatura ambiente, obteniendo el anillo espumoso o buffy coat que se transfiere mediante pipeta Pasteur estéril a un tubo de polipropileno de 15 ml. Se agregó medio rpmi hasta completar un volumen de 14 ml, centrifugando a 200 x g por 10 minutos a temperatura ambiente para luego desechar sobrenadante, dejando sólo 1 ml en el tubo. Se completa nuevamente el volumen a 10 ml resuspendiendo el pellet mediante aspiración con pipeta Pasteur; se centrifuga de nuevo por 10 minutos a 200 x g, dejando sólo 1 ml del centrifugado. Luego se restituye el volumen de 10 ml con solución pbs y se centrifuga a 200 x g durante 10 minutos; después se desecha sobrenadante, resuspende y se vierte 11

4 en un microtubo de 1,5 ml, centrifugado a 7,3 x g durante un minuto. Descartado el sobrenadante se procede con la extracción de rna o se guarda hasta su utilización a -70º C. Extracción de RNA El pellet obtenido se mezcla con reactivo Trizol en una proporción de 0,25 ul de muestra con 0,75 ml del Trizol, como lo recomienda la investigación de Chomczynski (11). Obtención del cdna Se sintetizó una primera cadena de cdna a alta temperatura, lo que incrementa la especificidad aumentando la producción de cdna de longitud total, generando un cdna de tamaño mayor a 12,3 Kb, mediante el empleo de SuperScript TM II Reverse Transcriptase (versión diseñada con una reducida actividad de RNAsa H e incrementada estabilidad térmica); esta enzima se purifica desde E. coli y contiene el gen modificado pol, del virus Molony Murine Leukemia. En general, se obtuvieron concentraciones de 1 ng-5 ul de rna total o ng de rma mensajero, lo cual permitió ajustar las reacciones a volúmenes de 20 ul. Caracterización de puntos de quiebre Lo anteriormente mencionado se apoya mediante una pcr simple, con un volumen final de reacción de 50 ul. A cada tubo se adicionaron 2-3 ul de cdna, más los cebadores en concentración final de 400 nm, buffer pcr a 10X, MgCl 2 a 25mM y una unidad de taq polimerasa, para continuar con detección de la enfermedad mínima residual (mrd) y el control de pcr para confirmación de falsos positivos. Las temperaturas y tiempos de ciclo pcr fueron: melting inicial 95º C por 30 segundos, 35 ciclos de pcr 94º C por 30 segundos (melting), 65º C por 60 segundos (annealing), 72º C por 60 segundos (extensión). Para los pacientes diagnosticados con lmc se usaron los siguientes cebadores: 5 -GAAGTGTTTCAGAAGCTTCTCC-3 y 5 -GTTTGGGCTTCACACCATTCC-3 (12). Se realiza la detección de la enfermedad mínima residual (mrd) mediante una pcr anidada con un nuevo par de cebadores: 5 -CAGATGCTGACCAACTCGTGT-3 y 5`-TTCCCCATTGTGATTATAGCCTA3 (12). Para la confirmación o exclusión de falsos positivos mediante un pcr simple, se utiliza un cebador para mrd y un primer shifted: E5 (5 -CAGATGCTGACCAACTCGTGT-3 ) o E3 (5 -TTCCCCATTGTGATTATAGCCTA-3 ), cebadores específicos para la translocación t(9;22) (q34;q11) que fusionan bcl-abl produciendo una banda de 417 observable en el gel de agarosa (12). Fundamentación teórica En la formación del cromosoma Philadelphia, como consecuencia de la translocación, es frecuente encontrar deleciones, que suelen ser más frecuentes en la región 3 de M-bcr; en algunos casos la presencia de éstas hace imposible detectar los reordenamientos dentro de M-bcr, usando únicamente una sonda. Esto es lo que ha ocurrido en algunos casos en los que sólo se ha reordenado con una sonda y por eso no ha sido posible localizar el punto de rotura en M-bcr, pero sí detectar el reordenamiento molecular (4). Este hecho pone de manifiesto la necesidad de llevar a cabo los estudios con más de una sonda para evitar los falsos negativos. Un hecho similar ocurre con las enzimas de restricción al no ser posible detectar todas las roturas empleando una sola enzima sino que es necesario utilizar al menos dos combinadas como son los casos de Bam HI+Bgl II y Hind III+Bgl II con las cuales se ha detectado el 100% 12

5 Iván Hernández Ramírez Jaime Alberto Gavilanes Caicedo de los reordenamientos dentro de M-bcr con la sonda 3 bcr. No obstante, a pesar de usar varias enzimas y sondas, en ocasiones no es posible detectar la translocación a nivel molecular porque se produce fuera de la región M-bcr (12). Este hecho se ha observado en contadísimas ocasiones como es el caso del trabajo presentado por Saglio y colaboradores (13) en el que describen dos pacientes con la rotura situada en la porción 3 del gen bcr. Negrini et ál. (14) describen un nuevo caso con la rotura en el extremo 5 del gen bcr idéntico al encontrado por Saglio y sus colaboradores en dos pacientes. Los cinco casos corresponden al norte de Italia, habiéndose sugerido alguna correlación geográfica. Se puede ver que el llevar a cabo técnicas moleculares es de gran importancia para dar pasos agigantados cuando se está tratando dicha enfermedad. Es posible la existencia de los casos de lmc Ph negativo con bcr/abl positivo cuyo comportamiento en el ámbito clínico y hematológico es idéntico a aquellos con cromosoma Philadelphia, porque la translocación existe pero se limita la posibilidad de detectar Ph + a nivel citogenético (15). Algo similar ocurre en los casos en que se sospecha de la existencia del cromosoma Philadelphia, pero su presencia no se puede confirmar o descartar con el estudio citogenético debido a la existencia de translocaciones complejas que incluyen al cromosoma 22 y pueden dar lugar al fenómeno conocido como Philadelphia enmascarado (15). También puede producirse una translocación que ocasione un cromosoma 22q- Ph like ; en estos casos en los que la citogenética no proporciona los resultados esperados es necesario llevar a cabo un estudio molecular completo para descartar la presencia de dicho fenómeno (16). Con el empleo del estudio molecular es posible descartar la sospecha de lmc en aquellos pacientes en los que no se puede llevar a cabo o no es concluyente el estudio citogenético, como es el caso de algunos trabajos ya realizados (17). En ocasiones el cromosoma Philadelphia no se detecta citogenéticamente porque se encuentra en un porcentaje bajo y no se observa en las células estudiadas en división; la utilización de técnicas moleculares resuelve en gran medida este problema (12). El adecuado y pertinente control médico puede ayudar a examinar y mejorar la expectativa y calidad de vida de personas que padecen enfermedades como la Leucemia Mieloide Crónica (lmc). En estos casos, la biología molecular es la herramienta de diagnóstico más utilizada para la detección de esta translocación. La rt-pcr es un método óptimo debido a su alta sensibilidad, especificidad y rapidez; su sensibilidad es de más del 99,9%, pudiendo detectar una célula positiva bcr/abl en o más células normales negativas (12). Resultados Relación de causalidad Cromosoma Ph* bcr/abl* LMC C92.0 Figura 3. Muestra la relación de causalidad, indicando que no necesariamente quien porta el gen bcr/abl manifiesta la lmc 13

6 Resumen de datos Tabla 1. Información recopilada en pacientes adultos diagnosticados con lmc por edad y género Mes Sexo Edad 02 Femenino 29 Femenino Masculino Femenino Femenino 43 Femenino Masculino 40 Masculino 53 También se encuentra la sensibilidad: identificar como positivos a los que tienen el transcripto (figura 4). vp / vp + fn = 0,4. Es decir: identifica como positivo el 40% de los que tienen el transcripto. N = 8 pacientes diagnosticados con lmc c92,0, 2010 Tabla 2. Distribución de la muestra frente a dos variables de género y la presencia o no de bcr/abl + (de contingencia o de 2 x 2) bcr/abl Sí No Total Hombre Mujer Total MWM Ind (+) Paciente Figura 4. Gel de agarosa al 1,5% amplificando un paciente con lmc. Se observa claramente la banda esperada de 417 pb comparada con la muestra conocida portadora de la translocación bcl-abl (Ind +) La tabla 2 permite reconocer cuatro grupos, considerando que según la información referida el hombre presenta más lmc que la mujer en una relación de 2:1, por tanto, ser hombre se considera factor de exposición; por otro lado, se observa también si presenta o no los marcadores estudiados en su totalidad, los cuales son: Expuestos-positivos (2)(V+), expuestos negativos (1)(F+); no expuestos positivos (3)(F-) y no expuestos negativos (2)(V-). Con esta información se puede hacer el ejercicio de calcular la especificidad: identificar correctamente a quienes no tienen el transcripto vn / vn + fp = 0,66. Es decir, identifica el 66% de los que no tienen el transcripto. La prevalencia de exposición entre transcriptos es: vp / vp + fn = 0,4, y la prevalencia entre variantes es: fp / fp + vn = 0,33, lo que indica que en este estudio la lmc se da más en mujeres que en hombres, contrario al criterio expuesto en la literatura. Si se calcula el riesgo relativo rr = Incidencia expuestos / Incidencia no expuestos, el valor obtenido es de 1,1. Para interpretarlo es necesario observar los parámetros de rr: rr=1 Sin asociación rr>1 Asociación positiva (riesgo) rr<1 Asociación negativa (efecto protector) 14

7 Iván Hernández Ramírez Jaime Alberto Gavilanes Caicedo El valor obtenido es muy cercano a 1, lo cual implica que no hay asociación entre las variables estudiadas; entonces, en el estudio el género no es un factor determinante en la presencia del transcripto: la probabilidad de enfermar siendo hombre es igual a la de la mujer. Por último, la estadística descriptiva muestra que la edad promedio para hombres es de 52 años (sd 9,41), para mujeres de 32,3 años (sd 8,18), con una variabilidad semejante. La mortalidad se presentó en 1 de cada 3 hombres (0,33) y en 3 de cada 5 mujeres (0,66). Análisis de sesgos Los pacientes no tenían estudios citogenéticos (cariotipo) para observar el cromosoma Ph +. El tamaño de la muestra es reducido. Deficiente información proveniente del paciente, lo cual no permite contextualizar y ampliar la descripción cualitativa de la muestra. Se requiere de una secuenciación molecular para identificar plenamente los transcriptos variantes. Conclusiones En el estudio: La lmc se presentó más en mujeres (5/3) La mortalidad fue mayor en mujeres El modelo se centra en bcr/abl p210 mediante la identificación de la banda de 417 pb El modelo permite corroborar el diagnóstico lmc c92,0 El género no es un factor de riesgo El transcripto no depende del género Recomendaciones Para mejorar la calidad de estudios posteriores: Usar la rt-pcr para bcr/abl con marcadores según se propone como herramienta diagnóstica en lmc c92,0. Estudios de secuenciación en las variantes. Cariotipo para Ph1. Referencias 1. Dunedin G. The story of chronic myeloid leukaemia. Br J Haematol. 2000; 1(10): Rowley JD. A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature. 1973; 243: Nowell P, Hungerford D. (1960). A minute chromosome in chronic granulocytic leukemia. Science. 1960; 132: Medina J, Kantarjian H, Talpaz M, O Brien S, García-Manero G, Giles F et ál. Chromosomal abnormalities in Philadelphia chromosomenegative metaphases appearing during imatinib mesylate therapy in patients with Philadelphia chromosome-positive chronic myelogenous leukemia in chronic phase. Cancer Nov; 98(9): Pavón Morán V, Hernández Ramírez P, Martínez Antuña G, Agramonte Llanes O, Jaime Fagundo JC, Bravo Regueiro J. Leucemia mieloide crónica. Actualización en citogenética y biología molecular. Instituto de Hematología e Inmunología; Hallek M, Cheson BD, Catovsky D, Caligaris- Cappio F, Dighiero G, Döhner H et ál. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute Working Group 1996 guidelin. Blood. 2008; 111(12), Rawstron AC, Bennett FL, O Connor SJ, Marwan K, James AL, Fenton DP et ál. Monoclonal B-Cell Lymphocytosis and Chronic Lymphocytic Leukemia. N Engl J Med. 2008; 359(6), Giles FJ, O Dwyer M, Swords R. Class effects of tyrosine kinase inhibitors in the treatment of chronic myeloid leukemia. Leukemia. 2009; 23(10):

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