EVALUACION Y SELECCION DE ESPECIES VEGETALES PRODUCTORAS DE COMPUESTOS NATURALES CON ACTIVIDAD INSECTICIDA. Equivalente de jornada completa:2,40

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1 Proyecto Nº SC EVALUACION Y SELECCION DE ESPECIES VEGETALES PRODUCTORAS DE COMPUESTOS NATURALES CON ACTIVIDAD INSECTICIDA Equipo Investigador: Mª Jesús Pascual Villalobos (Dra. I.A.) Enrique Correal Castellanos (I.A.) Eulogio Molina Navarro (I.A.) Juan Martínez Laborde (Dr. I.A.) Elvira López Gómez (L.Q.) Francisco Aguirre Jiménez (I.A.) Equivalente de jornada completa:2,40 Centro de Investigación: Centro de Investigación y Desarrollo Agroalimentario (CIDA). Murcia. Duración: Coste: Enero Diciembre 1997 Miles de pesetas: Fianciación INIA 100% 1

2 PLANTEAMIENTO Y OBJETIVOS Los insecticidas de origen vegetal han contribuido históricamente al control de plagas y al desarrollo de nuevos productos, siendo buenos ejemplos, la nicotina, las piretrinas y la rotenona. No obstante, el auge de la agricultura moderna se ha debido en gran medida a la utilización de plaguicidas sintéticos de amplio espectro para reducir las pérdidas que plagas y enfermedades causan en los cultivos. A finales de siglo XX estamos asistiendo a un replanteamiento de los actuales sistemas de producción agrícola y la tendencia actual va dirigida hacia sistemas integrados y ecológicos que utilicen métodos de control de plagas que sean respetuosos con el medio ambiente. Los insecticidas de origen natural pueden representar una ventaja si son más selectivos y menos contaminantes, dando lugar finalmente a productos agrícolas de mayor calidad para los consumidores. Los avances en las técnicas analíticas y de cribado han facilitado que tanto empresas como centros de investigación estudien la actividad de extractos vegetales con objeto de encontrar nuevas moléculas. La flora es una fuente inagotable de compuestos químicos y las aplicaciones de esta biodiversidad pueden contribuir al reconocimiento de la importancia de su conservación. El objetivo general del proyecto era investigar especies vegetales para detectar compuestos naturales del metabolismo secundario con actividad insecticida con objeto de obtener: a) nuevos cultivos no alimentarios, b) plaguicidas más selectivos y menos contaminantes y c) especies para el control integrado de plagas. De forma más específica se pretendía estudiar la actividad de extractos vegetales obtenidos bien a partir de plantas nativas de la flora del Sureste Español, por recolección directa en estado silvestre o de especies vegetales foráneas por multiplicación en campo. El material vegetal se recogió cuando las plantas se encontraban en floración, se separaron los distintas partes (hojas, tallos, flores etc.) y se liofilizaron. La extracción se realizó utilizando disolventes orgánicos de menor a mayor polaridad, los extractos crudos se evaluaron en laboratorio. En algunos casos se realizó un fraccionamiento biodirigido de los extractos por columna. En otros, se obtuvieron aceites esenciales por destilación al vapor. La actividad insecticida se estudió utilizando plagas de almacén (Tribolium castaneum, Acanthoscelides obtectus y Ephestia kuehniella) y plagas de campo como la oruga del tomate (Spodoptera littoralis) o la mosca blanca (Bemisia tabaci). Los bioensayos realizados de forma rutinaria fueron los que se pusieron a punto con T.castaneum para detectar actividad inhibidora del crecimiento, toxicidad por contacto, hormonal, inhibición de oviposición y repelente. Con S.littoralis el bioensayo (ampliamente contrastado y desarrollado por otros) utilizado fue el de discos de fibra de vidrio para comprobar los efectos antialimentarios en larvas. En moscas blancas se diseñaron experimentos para detectar mortalidad y repelencia de las distintas aplicaciones. RESULTADOS - Los extractos del total de 106 especies silvestres recolectadas fueron estudiados con los bioensayos puestos a punto con T.castaneum. Esto implicó la realización de 2304 tests en 2

3 laboratorio, seleccionando 117 extractos activos en al menos un experimento. Los preparados de especies de los géneros Ajuga, Anabasis, Ballota, Asphodelus, Beillardia, Lepidium, Senecio etc. produjeron inhibición del crecimiento en larvas y/o mortalidad al ser incorporados en la dieta. Las aplicaciones tópicas de extractos de Urginea, Ailanthus, Atractylis, Cichorium, Conyza, Ecballium, Lavandula, Ononis, Reichardia etc. produjeron alta mortalidad. Finalmente, los extractos de algunas especies de Chrysanthemum, Calendula, Nicotiana, Artemisia etc. fueron repelentes. - Los aceites esenciales de las inflorescencias de Chrysanthemum coronarium y de las semillas de Carum carvii fueron repelentes a corto plazo para mosca blanca (Bemisia tabaci) y disminuyeron la longevidad y fertilidad de plagas de almacén (E.kuehniella y A.obtectus). - La ingestión de semilla de fenogreco (Trigonella foenum-graecum) produjo una disminución lineal de la fertilidad en T.castaneum en función de la dosis. El modo de acción resultó ser anticonceptivo y con efectividad tanto para machos como para hembras. - Las especies vegetales foráneas estudiadas (38 Caryophillaceae y 25 Verbenaceae/Labiatae) implicaron la preparación de 113 extractos y su evaluación utilizando el bioensayo con discos de fibra de vidrio para detectar actividad antialimentaria en Spodoptera littoralis. Los extractos más activos correspondieron a cuatro verbenáceas (de los géneros Caryopteris, Clerodendrum y Callicarpa), una labiada (Salvia hispanica) y a once cariofiláceas (de los géneros Citharexylum, Silene, Dianthus, Saponaria, Honkenya, Stellaria y Scleranthus). - Se procedió a un fraccionamiento en columna de los extractos crudos de Clerodendrum bungei, biodirigido con el ensayo de actividad antialimentaria con S.littoralis, esto implicó la evaluación de un total de 47 fracciones. Se separaron aquellas fracciones más activas pero en ellas no se pudieron identificar nuevos compuestos además de los ya conocidos y publicados diterpenos del tipo clerodano con actividad inhibidora de alimentación en insectos. INFORMACION CIENTIFICA Y TECNICA PROPORCIONADA POR EL PROYECTO. POSIBLES APLICACIONES La actividad inhibidora del crecimiento en larvas de T.castaneum al incorporar extractos vegetales a la dieta a dosis de 0,05% se pudo observar para Ballota hirsuta (Labiatae), Lepidium graminifolium (Cruciferae), Ajuga iva (Labiatae), Anabasis hispanica (Chenopodiaceae), Senecio lopezii (Compositae), Beillardia trixago (Scrophulariaceae), Asphodelus fistulosus (Liliaceae), Nicotiana rustica (Solanaceae), Solanum dulcamara (Solanaceae), Whitania somnifera (Solanaceae), Periploca angustifolia (Asclepidacee) etc. El grado de actividad dependía no sólo de la especie sino de la parte vegetal con la que se preparaba el extracto (hojas, flores, tallos etc.), del momento de recolección y del disolvente con el que se extraía el material liofilizado. En algunos casos, además del efecto de inhibición del crecimiento, también se producía finalmente una mortalidad alta (80-100%) aunque en otros, las larvas prolongaban considerablemente su ciclo y presentaban un menor tamaño pero daban lugar, finalmente, a adultos supervivientes. La actividad anti-insectos debe valorarse no sólo por la mortalidad sino por cualquier otro efecto en la alimentación, crecimiento o reproducción del insecto. Los preparados de varias especies indujeron toxicidad al ser aplicados tópicamente a larvas de T.castaneum a dosis de 3 µg/insecto, por ejemplo, los extractos de Hyosciamus albus (Solanaceae), Solanum nigrum (Solanaceae), Urginea maritima (Liliaceae), Ailanthus altissima (Simaroubaceae), Atractylis cancellata (Compositae), Cichorium intybus (Compositae), Conyza 3

4 sumatrensis (Compositae), Ecballium elaterium (Cucurbitaceae), Lavandula stoechas (Labiatae), Ononis natrix (Leguminosae), Reichardia tingitana (Compositae), etc. En algunos casos, además de una alta mortalidad, se pudieron identificar los efectos propios de regulación del crecimiento (hormonal) dando lugar a adultoides y otras formas intermedias inviables en las larvas tratadas. Al haber utilizado para estos bioensayos extractos crudos que contienen muchos compuestos, no se puede asociar dicha actividad a ningún producto en concreto. Cuando los extractos se aplicaron a la dieta a dosis de 0,05% dieron lugar a repelencia (medida por un índice) en larvas al comparar con un control. Calendula officinalis (Compositae), Artemisia campestris (Compositae), Pistacia lentiscus (Anacardiaceae), Genista umbellata (Leguminosae), Cachrys sicula (Umbelliferae), Stipa tenacissima (Graminaceae), Helychrysum decumbens (Compositae), Nicotiana glauca (Solanaceae) y Carrichtera annua (Cruciferae) entre otras produjeron repelencia en T.casteneum. No obstante, es difícil generalizar estos resultados para otros insectos u otro tipo de experimentos. Los extractos de las verbenáceas Caryopteris divaricata y Clerodendrum bungei son antialimentarios en la oruga Spodoptera littoralis, llegando a morir las larvas por inhanición en lugar de comer los discos tratados. Los extractos crudos de otras labiadas (Callicarpa bodinieri y Salvia hispanica) producen también estos efectos pero no con tanta intensidad. Los resultados que se obtienen con extractos pueden diferir de aquellos que se produzcan al utilizar compuestos puros. Valores positivos del índice corresponden además a especies cariofiláceas como Silene vulgaris, Silene coeli-rosa, Dianthus armeria, Dianthus caryophyllus, Honkenya peploides, Stellaria holostea, Scleranthus annuus, Citharexylum berlandieri, Saponaria officinalis etc. pero en general el tipo de bioensayo utilizado con la oruga S.littoralis es especialmente adecuado para detectar diterpenos del tipo clerodano mientras que su sensibilidad para otro tipo de compuestos no está tan clara. Para la cromatografía en columna de Clerodendrum bungei, 200 gramos de hojas liofilizadas fueron extraídos secuencialmente con hexano (72h), acetona (48h) y metanol al 50% (48h). Los extractos obtenidos fueron de 7, 9 y 37 gramos respectivamente. Cada uno de estos extractos fue fraccionado utilizando una columna de 50 cm de larga y 2,5 cm de diámetro empacada con gel de sílice (0,2-0,5 mm). Cada extracto fue fraccionado utilizando disolventes de menor a mayor polaridad: hexano, acetato de etilo y metanol. La actividad biológica de las fracciones (1 mg/ml) se probó con el mismo bioensayo para ir identificando aquellas que resultaban activas. Como se ha comentado en los resultados llegado un punto se consideró que no se iban a aislar nuevos compuestos y por tanto no se continuó con este experimento. El aceite esencial de las inflorescencias de Chrysanthemum coronarium tiene actividad fumigante, se han calculado las dosis letales (DL50) para distintas plagas. A dosis subletales en el gorgojo Acanthoscelides obtectus se produce inhibición de la ovoposición, mientras que en T.castaneum se produce repelencia, Ephestia kuehniella resultó ser la plaga de almacén más sensible de las evaluadas. Las hojas acondicionadas (con aceite esencial) de pimiento repelieron a corto plazo a poblaciones de mosca blanca (Bemisia tabaci), en el interior de placas petri, y causaron elevada mortalidad. Si bién, estos resultados son difícilmente extrapolables a condiciones de campo. Se planteó un experimento para estudiar el efecto de la ingestión de semilla (madura o inmadura) de fenogreco Trigonella foenum-graecum mezclada a distintas dosis en la dieta de T.castaneum. La fecundidad de las parejas formadas disminuyó linealmente hasta inhibirse por completo. La eficacia fue mayor cuando se utilizaba semilla madura pero se consiguieron 4

5 similares resultados cuando era ingerida por el macho o por la hembra. Es posible que estos resultados puedan atribuirse a ciertos productos presentes en las semillas (como la diosgenina) que han sido estudiados en farmacia. Finalmente, se sembró en campo una parcela de alcarabeo (Carum carvii) que es una umbefífera que produce en sus semillas un aceite esencial rico en carvona (un agente antibrotación de patatas recientemente patentado en Holanda). El aceite de esta especie está permitido en agricultura ecológica como tratamiento fitosanitario. Su comportamiento agrónomico fue bueno y podría ser cultivado en España. FORMACION DE PERSONAL Elaboración de la tesis doctoral de Jérôme Pemonge, titulada Activités insecticides de materiel et extraits végétaux de Trigonella foenum-graecum L. Sur deux ravageurs de dentées stockées: Acanthoscelides obtectus et Tribolium castaneum. PUBLICACIONES Artículos científicos Pasual-Villalobos, M.J Evaluación de la actividad insecticida de extractos vegetales de Chrysnthemum coronarium. Bol. San. Veg. Plagas, Pergonge, J., Pascual-Villalobos, M.J., Regnault-Roger, C Effects of material and extracts of Trigonella foenum-graecum L. against the stored product pests Tribolium castaneum (Herbst) (Coleoptera: Tenebrionidae) and Acanthoscelides obtectus (Say) (Coleoptera: Bruchidae). Journal of Stored Products Research, Artículos de divulgación Pascual-Villalobos, M.J Cultivo de Carum carvii para producción de carvona. Agricultura, Pasual-Villalobos, M.J., Robledo, A., Alburquerque, N., Pérez, P., Gallego, D Prospección de especies vegetales de la flora de Murcia para evaluar actividad plaguicida. En: Insecticidas de origen natural y protección integrada y ecológica en agricultura. Serie Jornadas, Libros Pasual-Villalobos, M.J Plaguicidas naturales de origen vegetal: estado actual de la investigación (ISBN: ). Monografías INIA, pp. Ed.: INIA. Pascual-Villalobos, M.J Insecticidas de origen natural y protección integrada y ecológica en agricultura (ISBN: ). Jornadas, pp. Ed.: Consejería de Medio Ambiente, Agricultura y Agua. Trabajos presentados a congresos, reuniones o simposios Gallego, D., Pasual-Villalobos, M.J. Seguimiento de la población emergente de Tomicus 5

6 piniperda en trozas de pino carrasco. II Congreso de la Naturaleza de la Región de Murcia. Murcia (España). Septiembre, Pascual-Villalobos, M.J. Repelencia, inhibición del crecimiento y toxicidad de extractos vegetales en larvas de Tribolium castaneum. III Jornadas Científicas de la Sociedad Española de Entomología Aplicada. Lleida (España). Noviembre, Ed.: Universitat de Lleida. Pérez, M.P., Pasual-Villalobos, M.J. Efectos del aceite esencial de inflorescencias de manzanilla loca (Chrysaanthemum coronarium) en mosca blanca y plagas de almacén. III Jornadas Científicas de la Sociedad Española de Entomología Aplicada. Lleida (España). Noviembre, Ed.: Universitat de Lleida. 6