PAPEL DE LOS HETERÓMEROS CXCR4/CD26 EN LA FUNCIONALIDAD DE LOS LINFOCITOS T Y EN LA ENTRADA E INFECTIVIDAD DEL VIH

Transcripción

1 PAPEL DE LOS HETERÓMEROS CXCR4/CD26 EN LA FUNCIONALIDAD DE LOS LINFOCITOS T Y EN LA ENTRADA E INFECTIVIDAD DEL VIH Investigador principal: Dr. Rafael Franco Fernández Centro: Facultat de Química. Universitat de Barcelona Duración: 3 años MEMORIA FINAL 1. Resumen Objetivo 1. Determinar de forma precisa el papel de los heterómeros CXCR4/CD26 en la funcionalidad de los linfocitos T. Se investigará al detalle de qué modo la activación de los receptores CXR4, en presencia de ADA o en la de inhibidores de CD26/DPP IV, afecta a la activación y la migración de linfocitos, así como a la desensibilización y el tráfico de CXCR4 y de CD26/DPP IV. Se correlacionarán los resultados obtenidos y el contenido de CD26/DPP IV de los distintos clones de células T. Objectivo 2. Estudiar el papel coestimulador del complejo ADA/CD26 en la proliferación linfocitaria y en la producción de citocinas en cocultivos de células dendríticas y linfocitos T en individuos sanos y en individuos infectados con VIH con diferente grado de viremia y diferente contenido

2 de linfocitos T. Se investigará cómo la proteína gp120 afecta a la proliferación linfocitaria inducida por ADA. Se correlacionarán los resultados obtenidos con la viremia y el contenido en CD4 y CD26/DPP IV de los distintos clones de células T. Breve síntesis del diseño, procedimiento y métodos Los receptores de quimiocinas son explotados por el VIH-1 para entrar dentro de las células y para la transmisión de la enfermedad. Recientemente hemos aportado evidencias convergentes y múltiples de la interacción entre el receptor de quimiocinas CXCR4 y CD26. CD26, una peptidasa de membrana, produce dipéptidos a partir de la parte N- terminal de cadenas polipeptídicas. CD26 codistribuye con CXCR4, y ambos coinmunoprecipitan a partir de las membranas de líneas de células T y codistribuyen y cointernalizan en linfocitos de sangre periférica. Por otra parte, nosotros hemos demostrado que SDF-1_ y gp120 inducen la aparición de pseudopodia en la que CD26 y CXCR4 colocalizan y en la que ADA, enzima que interacciona con CD26 y participa en la activación de células T, no está presente. La asociación física de CXCR4 y CD26, directa o formando parte de una estructura supramolecular en la que también está presente ADA, sugiere un papel esencial en el funcionamiento del sistema inmunológico y en la patofisiología de la infección por el VIH. Esta hipótesis se probará en modelos celulares humanos: linfocitos T de sangre periférica y cocultivos de células dendríticas y linfocitos T. Las técnicas que se emplearán son las propias de bioquímica molecular y celular e inmunología, como electroforesis y Western Blot, inmunocitoquímica, FACS, técnicas de determinación de segundos mensajeros, FRET, FLIM, técnicas de determinación de citocinas y técnicas de caracterización de apoptosis, entre otras.

3 Breve síntesis del plan de trabajo Actividad 1. Determinar de forma precisa el papel de los heterómeros CXCR4/CD26 en la funcionalidad de los linfocitos T. Se investigará detalladamente de qué forma la activación de los receptores CXCR4, en presencia de ADA o en la de inhibidores de CD26/DPP IV, afecta a la activación y migración de linfocitos, así como a la desensibilización y tráfico de CXCR4 y de CD26/DPP IV. Se correlacionarán los resultados obtenidos y el contenido en CD26/DPP IV de los diferentes clones de células T. Tarea 1.1. Estudios de heteromerización, coexpresión y desensibilización. Tarea 1.2. Estudios de señalización celular. Tarea 1.3. Estudios de migración. Actividad 2. Estudiar el papel coestimulador del complejo ADA/CD26 en la proliferación linfocitaria y en la producción de citocinas en cocultivos de células dendríticas y linfocitos T en individuos sanos y en individuos infectados con VIH con diferente grado de viremia y diferente contenido de linfocitos T. Se investigará cómo la proteína gp120 afecta a la proliferación inducida por ADA. Se correlacionarán los resultados obtenidos y el contenido en CD4 y CD26/DPP IV de los distintos clones de células T. Tarea 2.1. Efecto de la interacción ADA/CD26 en la proliferación de linfocitos T. Tarea 2.2. Efecto de la interacción ADA/CD26 en la proliferación de linfocitos T en individuos infectados por VIH. Tarea 2.3. Estudios de señalización celular en linfocitos de individuos sanos o en pacientes de SIDA, activados con anti-cd3 en presencia o ausencia de ADA. Tarea 2.4. Análisis de la producción de citocinas en cocultivos de células dendríticas y linfocitos T en individuos sanos y en individuos infectados con VIH con distinto grado de viremia y diferente contenido con linfocitos T.

4 2. Resultados Se ha podido demostrar, a través de la técnica de FLIM (Fluorescence lifetime imaging microscopy, una variante de FRET), que CD26 y CXCR4 interaccionan molecularmente. La interacción entre CD26 y CXCR4 no induce ningún cross-talk de estas dos proteínas en cuanto a señalización intracelular (movilización de calcio y fosforilación de ERK 1/2) y que ambas señalizaciones intracelulares inducidas por activación de CXCR4 no se modifican por la unión de adenosina desaminasa (ADA) a CD26. A pesar de ello, se ha podido demostrar que CD26, ADA y los receptores de adenosina, ejercen un nuevo papel coestimulador en la sinapsis inmunológica. Se han efectuado experimentos de cocultivo de células dendríticas de donantes sanos con linfocitos del mismo donante. Estos cocultivos permiten estudiar la inmunosinapsis y se ha determinado el papel de ADA y el de CD26 en la proliferación de los linfocitos y en la producción de citocinas en la inmunosinapsis (Pacheco et al [2005] CD26, adenosine deaminase and adenosine receptors mediate novel costimulatory signals in the immunological synapse. Proc. Nat. Acad. Sci. 102, ). Los linfocitos T precisan dos señales cuando interaccionan con las células presentadoras de antígeno para una correcta activación y posterior respuesta. Una primera señal es el propio reconocimiento antigénico, y la otra señal viene dada por el coestímulo que ejerce la interacción de ciertos receptores de la célula presentadora con el linfocito T. Esta segunda señal es crítica, puesto que, si no se produce, los linfocitos T permanecen anérgicos. En este contexto, nuestros resultados han sido relevantes para entender algunos procesos involucrados en la interacción entre células dendríticas y linfocitos T (Pacheco et al. [2005] Role of CD26-adenosine deaminase interaction in the T cell-mediated immunity. Inmunología 24, ).

5 Se ha puesto de manifiesto que ADA estimula también la proliferación inducida al activar el CD3 de linfocitos T aislados de pacientes de SIDA (cohorte de 30 pacientes), correlacionando directamente con el contenido en CD4 e inversamente con la carga vírica de los pacientes. El ADA incrementa la producción de INF-_ de IL-6 y de TNF-_ en pacientes de SIDA. Se ha comprobado en donantes sanos que tanto la proliferación como la producción de citocinas inducidas por ADA disminuye en presencia de la proteína viral gp120, ya que la proteína gp120 desplaza el ADA de su centro de interacción con CD26. Dicha disrupción puede constituir un nuevo mecanismo para explicar en parte las alteraciones inmunológicas observadas en pacientes de SIDA (Martínez-Navío et al. Comunicación aceptada para presentar al CROI, th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, y trabajo en fase de escritura). Al igual que con individuos sanos, se han realizado experimentos de cocultivo de células dendríticas de individuos infectados con VIH (cohorte de 30 pacientes) con linfocitos del propio donante para estudiar la inmunosinapsis. Se ha puesto de manifiesto que ADA posee un papel coestimulador de la proliferación linfocitaria mucho mayor en pacientes de SIDA que en donantes sanos, siempre y cuando el paciente esté en tratamiento y su carga vírica sea baja. Al realizar los cocultivos con linfocitos T CD45RA + purificados, se observa que ADA induce el paso a memoria (CD45RO +, CD25 + ) y que este proceso está mediado principalmente por el aumento en la liberación de IL-6 provocado por ADA. Al mismo tiempo, ADA favorece la supervivencia de los linfocitos T, ya que desempeña un papel antiapoptótico. Todos estos resultados convierten a ADA en una molécula candidata a ser considerada como parte de una posible vacuna terapéutica basada en la presentación de antígenos víricos por parte de células dendríticas (trabajo de Martínez- Navío et. al en fase de finalización y escritura). Durante los estudios de activación linfocitaria descubrimos que los linfocitos T expresan receptores metabotrópicos de glutamato 1 y 5 y que dichos receptores poseen un papel muy relevante en la señalización y en

6 la proliferación linfocitaria (Pacheco et al. [2004] Group I metabotropic glutamate receptors mediate a dual role of glutamate in T cell activation. J. Biol. Chem ). Durante el proceso de inmunosinapsis, son las células dendríticas las que liberan glutamato capaz de activar los receptores de los linfocitos T y modular la producción de citocinas y la diferenciación a Th1 (Pacheco et al. [2006] Glutamate Released by Dendritic Cells as a Novel Modulator of T Cell Activation. J. Immunol., 2006, 177: ). Todos estos resultados han permitido formular una nueva visión de conjunto, sobre cómo un pequeño neurotransmisor como el glutamato puede actuar como mediador de la inmunosinapsis (Pacheco et al. [2007] Role of glutamate on T-cell mediated immunity. J. Neuroimmunol; en prensa). El descubrimiento de nuevas moléculas involucradas en la inmunosinapsis abre nuevas vías de estudio de los procesos de activación linfocitaria en enfermos de SIDA y en especial en el desarrollo de vacunas. 3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados finales obtenidos La relevancia de los resultados deriva de un avance significativo en el conocimiento de la activación de los linfocitos T, tanto en condiciones fisiológicas como en una situación de inmunodeficiencia como la que se presenta después de la infección producida por el VIH. El modelo que hemos empleado en el proyecto ha sido el más fisiológico, dado que hemos utilizado células dendríticas de donantes humanos (donantes sanos y pacientes de SIDA) que presentaban antígenos en células T del propio donante. Cabe asimismo destacar que las condiciones empleadas han sido GLP, pensando en la posibilidad de que los resultados puedan dar lugar a nuevas estrategias terapéuticas para combatir el SIDA. Las nuevas moléculas importantes para la activación de la proliferación linfocitaria,

7 como ADA, CD26 y los receptores metabotrópicos de glutamato y su papel en la producción de citocinas son de gran importancia no sólo desde el punto de vista académico, sino desde un punto de vista clínico y de cara al desarrollo de vacunas antisida. 4. Publicaciones Rodrigo Pacheco, Francisco Ciruela, Vicent Casadó, Josefa Mallol, Teresa Gallart, Carmen Lluís, and Rafael Franco (2004) Group I metabotropic glutamate receptors mediate a dual role of glutamate in T cell activation. J. Biol. Chem Pacheco R., Martínez-Navio J. M., Lejeune M., Climent N., Oliva H., Gallart T., Mallol J., Lluís C. and Franco R. (2005) CD26, adenosine deaminase and adenosine receptors mediate novel costimulatory signals in the immunological synapse. Proc. Nat. Acad. Sci. 102, Rodrigo Pacheco, Carmen Lluís and Rafael Franco (2005) Role of CD26-adenosine deaminase interaction in the T cell-mediated immunity. Inmunología 24, Rodrigo Pacheco, Harold Oliva, Jose M. Martínez-Navıo, Nuria Climent, Francisco Ciruela, Jose M. Gatell, Teresa Gallart, Josefa Mallol, Carmen Lluís, and Rafael Franco (2006) Glutamate Released by Dendritic Cells as a Novel Modulator of T Cell Activation.

8 J. Immunol., 2006, 177: Rodrigo Pacheco; Teresa Gallart; Carmen Lluís; Rafael Franco (2007) Role of glutamate on T-cell mediated immunity. J. Neuroimmunol (en prensa).