APARATO DE GOLGI. Área Biología

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1 APARATO DE GOLGI Área Biología Resultados de aprendizaje Conocer el origen, principales funciones y mecanismos de transporte vesicular que ocurren a nivel de las diferentes cisternas del aparato de Golgi. Contenidos 1. Introducción 2. Principales funciones del aparato de Golgi 3. Diferentes tipos de transporte en el aparato de Golgi 4. Transporte desde RE hacia Golgi 5. Vesículas COPII median transporte RE hacia Golgi 6. Vesículas COPI median transporte interior del Golgi 7. Progresión cisternal del aparato de Golgi Debo saber La célula: estructura, principales orgánelos y funciones Conocimientos básicos acerca del transporte vesicular (se recomienda revisar guia de transporte vesicular para complementar su estudio) Primera Edición

2 Introducción El aparato de Golgi fue descrito por Camilo Golgi en 1989 y su estructura membranosa fue observada por primera vez al microscopio electrónico por Dalto y Felix (1954). En las células animales es un orgánulo que se localiza próximo al centrosoma, el cual suele estar en las cercanías del núcleo. Como el centrosoma es el principal centro organizador de microtúbulos, la posición central del aparato de Golgi en las células animales depende de la organización del sistema de microtúbulos. El aparato de Golgi está formado por una serie de cisternas aplanadas que se disponen regularmente formando pilas. En una célula puede haber varios de estos apilamientos y algunas cisternas localizadas en pilas próximas están conectadas lateralmente. A todo el conjunto de pilas y sus conexiones se le denomina complejo de Golgi. El número (varia en un rango de 3 a 8) y el tamaño de las cisternas en cada pila es variable y depende del tipo celular, así como del estado fisiológico de la célula. Entre las cisternas, dentro de cada pila, existen numerosas proteínas fibrosas en las que se encuentran embebidas las cisternas. Este entramado, denominado matriz, podría ayudar en el mantenimiento de la estructura del orgánulo. Sin embargo, se ha demostrado que la integridad del aparato de Golgi depende principalmente de la organización del sistema de microtúbulos, por ejemplo: durante la mitosis desaparece, y también del tráfico vesicular desde el retículo endoplasmático, si éste se detiene el Golgi también desaparece. En las células vegetales, que no tienen centrosoma, hay numerosas estructuras similares a aparatos de Golgi, poco desarrollados y dispersos por el citoplasma. En las células vegetales las cisternas del aparato de Golgi son más pequeñas que en las células animales y no están unidas formando apilamientos, aunque el número de cisternas dispersas puede variar entre decenas y más de cien. Estas cisternas son móviles gracias a los filamentos de actina. En algunas levaduras, células eucariotas, ni siquiera existen cisternas parecidas a las que se observan en células animales o vegetales. Es un orgánulo polarizado y cada pila contiene dos dominios, un lado cis y un lado trans. Entre ambos se encuentran las cisternas intermedias. En el lado cis existe un proceso continuo de formación de cisternas con material procedente de la fusión de compartimientos túbulo vesiculares denominados ERGIC (endoplasmatic reticulum Golgi intermediate compartment), que se forman con material proveniente del retículo endoplasmático. El lado trans también posee una organización túbulo-vesicular denominada TGN (entramado trans del aparato de Golgi o trans Golgi network), donde las cisternas con las moléculas procesadas se deshacen en vesículas que se dirigen a otros compartimientos celulares. Por tanto se da un trasiego constante de moléculas desde el lado cis al trans, pero también hay un flujo de reciclado en sentido contrario mediado por vesículas recubiertas con proteínas COPI que parten de las zonas laterales de las cisternas y se dirigen hacia otras cisternas más próximas al lado cis. Es un orgánulo en constante renovación y el flujo de moléculas afecta a su organización y a su tamaño. Este orgánulo está especialmente desarrollado en células con fuerte secreción. La dirección del flujo de sustancias determina una polarización de la distribución de las enzimas en las cisternas que están próximas al lado cis o al trans. Por ejemplo, las cisternas que están próximas al lado cis o al trans. Por ejemplo, las cisternas del lado cis contienen una mayor concentración de la enzima transferasa de la N-acetilgalactosamina, las Primera Edición

3 cisternas intermedias contienen la transferasa I de la N-acetilglucosamina, las cisternas del lado trans a la galactosiltransferasa y el TGN a sialiltransferasa. El aparato de Golgi realiza funciones esenciales en la célula El aparato de Golgi funciona como el principal centro repartidor de vesículas, que son distribuidas en la misma célula, o en las células vecinas (comunicación paracrina), a continuación se resumen las funciones de este organelo: 1. Es uno de los principales centros de glicosilación en la célula. Se añaden y modifican glúcidos que formarán parte de las glicoproteínas, proteoglicanos, glucolípidos y polisacáridos como la hemicelulosa de las plantas. Muchos de los glúcidos de las glucoproteínas que se modifican en el aparato de Golgi han sido añadidos previamente en el retículo endoplasmático. La glucosidación en las proteínas puede ser de dos tipos: a) Los sacáridos ricos en manosa añadidos en el retículo endoplasmático (glucosidación tipo N) son posteriormente modificados en el aparato de Golgi mediante la adición de nuevos azúcares. b) En el aparato de Golgi se añade oligosacáridos con unión tipo O a los grupos hidroxilos de aminoácidos como la serina, la treonina y la hidroxilisina. Este tipo de glucosidación ocurre en los proteoglucanos. También se añaden los grupos sulfatos a los glucosaminoglucanos. Entre los azúcares específicos que se añaden en el aparato de Golgi está el ácido siálico. Además de unir moléculas de azúcares a las proteínas también se forman moléculas de ácido hialurónico, un polisacárido, que quedará libre en la matriz extracelular. En el aparato de Golgi también se producen otras modificaciones además de la glucosidación y sulfatación, como son fosforilación, palmitoilación, metilacón y otras. Todas las funciones relacionadas con los glúcidos las llevan a cabo las enzimas glucosiltransferasas (añaden glúcidos) y las glucosidasas (eliminan glúcidos). Existen unos 200 tipos de estas enzimas en el aparato de Golgi. Las diferentes cisternas del aparato de Golgi tienen papeles específicos dentro del procesamiento de los glúcidos, que es una reacción secuencial. Hay evidencias de que existe un gradiente de enzimas relacionadas con la glucosidación desde el lado cis al trans, estando más concentradas cerca del lado cis al trans, estando más concentradas cerca del lado cis aquellas enzimas implicadas en los primeros pasos del proceso de glucosidación. La síntesis de polímeros de sacáridos es muy diferente a la de las proteínas o a la de los ácidos nucleicos. Mientras que los últimos se sintetizan a partir de un molde y con la participación un solo tipo de enzima, los sacáridos necesitan una enzima para cada paso que deben realizar en un momento preciso dentro de una cadena de reacciones. Dado que es una vía extremadamente complicada y costosa es de suponer que las glucoproteínas y los glucolípidos son de extremada importancia. En la figura 1 se resume en detalle el paso a paso la glucosilaciones a nivel del aparato de Golgi, las enzimas que catalizan cada paso están localizadas en los compartimientos indicados. Después de la eliminación de los tres residuos de manosa en el cis-golgi (paso 1), la proteína se mueve mediante progresión cisternal al medial-golgi. Aquí, se añaden tres residuos de GlcNac (pasos 2 y 4), se eliminan otros dos residuos de manosa (paso 3) y se añade una única fucosa (paso 5). El procesamiento se completa en el trans-golgi con la adición de tres residuos de galactosa (paso 6) y por último la unión de un residuo de N acetilneuramínico a cada uno de los Primera Edición

4 residuos de galactosa (paso 7). Enzimas transferasas especificas añaden azúcares a los oligosacáridos, uno a la vez, a partir de precursores de nucleótidos-azúcar transportados desde el citosol. Esta vía representa los eventos del procesamiento de una glucoproteína típica en el Golgi de mamífero. Las variaciones en la estructura de los oligosacáridos N-ligados pueden resultar de las diferencias en los pasos de procesamiento en el Golgi. 2. En el aparato de Golgi se terminan de sintetizar las esfingomielinas y los glucoesfingolípidos. La ceramida sintetizada en el retículo endoplasmático es la molécula sobre la que trabajan las enzimas del aparato de Golgi para formar dichos tipos de lípidos de membrana. A estos lípidos se les ha prestado recientemente mucha atención puesto que se les atribuye el papel de crear micro dominios de membrana gracias a su asociación con el colesterol, las denominadas balsas de lípidos, las cuales pueden crear compartimientos en las membranas y por tanto se convierten en zonas con unas características fisiológicas diferentes. 3. Es un centro de reparto de moléculas que provienen del retículo endoplasmático o que se sintetizan en el propio aparato de Golgi. Desde el lado trans saldrán vesículas con moléculas seleccionadas hacia la membrana plasmática en dos rutas: la exocitosis constitutiva y la exocitosis regulada, hacia los endosomas de reciclaje o hacia la ruta de los endosomas tardíos/ cuerpos multivesiculares/ lisosomas. Figura 1. Procesamiento de las cadenas de olisacáridos N-ligados sobre glucoproteínas dentro de las cisternas cis, medial y trans-golgi de células vertebrados. Primera Edición

5 Una vez procesadas, las diferentes moléculas son seleccionadas y empaquetadas en vesículas diferentes para dirigirse a sus respectivos destinos. En TGN es la plataforma desde la cual salen las vesículas para los distintos compartimientos. Las vías principales son hacia la membrana mediante exocitosis y a los endosomas tardíos desde donde se llega a los lisosomas. También desde el TGN se envían vesículas de reciclado hacia cisternas del propio aparato de Golgi y existen algunas observaciones que sugieren una proyección directa hacia el retículo endoplasmático puesto que se han observado cisternas del retículo asociadas estrechamente con el TGN. Pero el TGN es también un comportamiento que recibe vesículas de los endosomas y parece participar en los procesos de reciclado de moléculas entre la membrana y compartimientos internos como los endosomas. Por tanto este dominio participa en las vías de exocitosis y endocitosis (ver resumen figura 2). Figura 2. Modelos de transporte de moléculas (color naranja) a través del aparato de Golgi. En el modelo de maduración de cisternas (arriba) las cisternas se crean en el lado cis y se desplazan, mientras van madurando, hacia el lado trans donde se transforman en vesículas. En el modelo de cisternas permanentes (abajo) las moléculas viajan de una cisterna a la cisterna contigua, en dirección hacia el lado trans, englobadas en vesículas (vesículas de color naranja). Las vesículas celestes representan el proceso de reciclaje hacia el lado cis, que es incluido por los dos modelos. Existen distintos modelos para explicar el transporte de sustancias a través del aparato de Golgi desde el lado cis al lado trans 1. El modelo de la maduración de cisternas. Se postula que los cuerpos túbulo vesiculares (ERGIC) provenientes del retículo endoplasmático se fusionan formando una cisterna en el lado cis. Esta cisterna se mueve progresivamente y madura hasta llegar al lado trans donde se descompone en vesículas para su reparto a otros compartimientos celulares. En la actualidad se tiende a aceptar este modelo porque hay observaciones que son explicadas por este modelo, sin embargo no por otros modelos. Por ejemplo, las moléculas de procolágeno miden unos 300 nm de longitud y no caben fisícamente en vesículas, pero sí pueden viajar dentro de las cisternas. Además, las vesículas COPI que están entre las cisternas del aparato de Golgi contienen mayoritariamente proteínas que deben reciclarse al retículo endoplasmático y no moléculas que están procesándose, luego sólo actúan como una vía de reciclado. El modelo de maduración de cisternas se ha demostrado en levaduras. 2. El modelo de los compartimientos estables. En este modelo los cuerpos túbulo vesiculares (ERGIC) provenientes del retículo endoplasmático se unen al lado cis y desde esas cisternas salen Primera Edición

6 vesículas que transportan material a la siguiente cisterna, y así sucesivamente hasta llegar al lado trans donde son empaquetadas en vesículas para su reparto. 3. Modelo de la conexión de túbulos. Se ha visto con el microscopio electrónico que en ocasiones existen conexiones tubulares entre cisternas no adyacentes. Estas conexiones parecen pasajeras y dependientes del tipo de material a secretar (figura 3). Figura 3. El aparato de Golgi se divide en diferentes dominios. El lado cis es donde el compartimiento ERGIC y las vesículas se fusionan para formar las primeras cisternas. El compartimento ERGIC no se puede considerar como un compartimiento perteneciente al aparato de Golgi, sino que es intermedio entre el retículo endoplasmático y el propio aparato de Golgi. Las cisternas que se encuentran en la zona intermedia de la pila se denominan intermedias. En el lado trans es donde las cisternas se deshacen en vesículas y estructuras tubulares que contienen moléculas ya procesadas. El TGN es este complejo de vesículas y estructuras tubulares que se forman en el lado trans. Desde las partes laterales de las cisternas se forman vesículas que viajan y se fusionan con cisternas más próximas al lado cis, son vesículas de reciclado. Tránsito vesicular en las etapas iniciales de la vía secretoria Centraremos nuestra atención en el tránsito vesicular a través de las etapas el RE y el aparato de Golgi de la vía secretoria. Cabe recordar que en el transporte anterógrado desde el RE al Golgi, el primer paso en la vía secretoria está mediado por las vesículas COPII, mientras que en el transporte retrógrado inverso desde el cis-golgi al RE intervienen vesículas COPI. En la figura 4 se resumen en detalle el tránsito proteico mediado por vesículas entre el RE y el cis-golgi. Pasos 1 a 3: el transporte (anterógrado) es mediado por las vesículas COPII, que se forman por la polimerización de complejos proteicos con cubierta COPII (verde) sobre la membrana del RE. Las v-snare (amarillo) y otras proteínas carga (violeta) en la membrana del RE se incorporan a la vesícula mediante interacción con proteínas de la cubierta. Las proteínas carga solubles (rojas) se reclutan mediante la unión a receptores apropiados en la membrana de las vesículas en el proceso de gemación. La disociación de la cubierta recicla los complejos de cubierta libres y expone las proteínas v-snare sobre la superficie vesicular. Después que las vesículas sin las cubiertas quedan ligadas a las membranas cis-golgi en un proceso mediado por Rab, el apareamiento entre las v- SNARE expuestas y las t-snare relacionadas en la membrana de Golgi permite la fusión vesicular, liberando el contenido dentro del compartimiento cis-golgi. Pasos 4-6: El transporte inverso (retrógrado), mediado por vesículas cubiertas con proteínas COPI (gris), recicla la bicapa de la Primera Edición

7 membrana y ciertas proteínas, como la v-snare y las proteínas del RE mal distribuidas, desde el cis- Golgi hacia el RE. Todas las proteínas SNARE se muestran en rojo aunque cada v-snare y t-snare con proteínas distintas. Este transporte vesicular retrógrado sirve para que el RE recupere proteínas v-snare y la misma membrana para proveer el material necesario para ciclos adicionales de gemación vesicular del RE. El transporte retrógrado mediado por COPI también recupera proteínas residentes del RE desde el cis-golgi para corregir errores de clasificación. Las proteínas que se entregaron correctamente al Golgi avanzan a través de sucesivos compartimientos del Golgi mediante progresión cisternal. Figura 4. Tránsito proteico mediado por vesiculas entre el reticulo endoplasmático y el cis- Golgi. Primera Edición

8 Las vesículas COPII median el transporte desde el RE hacia el Golgi Las vesículas COPII fueron reconocidas por primera vez cuando se incubaron extractos libres de células de membranas del RE rugoso de levaduras con citosol, ATP y un análogo no hidrolizable de GTP. Las vesículas que se formaban a partir de las membranas del RE tenían una cubierta distinta, similar a la de las vesículas COPI pero compuestas de proteínas diferentes, designadas proteínas COPII. Las células de las levaduras con mutaciones en los genes que codifican las proteínas COPII son mutantes sec de clase B y acumulan proteínas en el RE rugoso. El análisis de estos mutantes ha permitido descubrir diversas proteínas necesarias para la formación de vesículas COPII La formación de vesículas COPII se desencadena cuando sec 12, un factor de intercambio de nucleótido de guanina, cataliza el intercambio de GDP por GTP por sobre sar1. Este intercambio induce la unión de sar1 a la membrana del RE seguida por la unión de un complejo de proteínas Sec 23 y Sec24. El complejo ternario resultante formado entre Sar1-GTP, Sec23 y Sec24 se muestra en la figura 2. Luego que se forma este complejo sobre la membrana del RE, un segundo complejo que comprende las proteínas Sec13 y Sec31 se une para completar la estructura de la cubierta. Una proteína fibrosa grande, denominada Sec16, que está unida a la superficie citosólica del RE, interactúa con los complejos Sec13/31 y Sec23/24, y organiza a las otras proteínas de la cubierta incrementando la eficiencia de polimerización de ésta (figura 5). Figura 5. Estructura tridimensional del complejo ternario que comprende las proteínas de cubierta, Sec23 y Sec24 y Sar1-GTP de vesículas COPII. Primera Edición

9 Ciertas proteínas integrales de membrana del RE son reclutadas específicamente a las vesículas COPII para el transporte hacia el Golgi. Los segmentos citosólicos de muchas de estas proteínas contienen una señal de clasificación diacídica (Asp-X-Glu). Esta señal de clasificación se une a la subunidad Sec24 de la cubierta de COPII y es esencial para la salida selectiva de ciertas proteínas de membrana desde el RE. Los estudios bioquímicos y genéticos están próximos a identificar señales adicionales que ayudan a dirigir las proteínas carga de membrana hacia el interior de las vesículas COPII. Otros estudios en curso buscan determinar como las proteínas carga solubles son incorporadas selectivamente dentro de las vesículas COPII. Aunque se descubrió que las vesículas COPII purificadas de las células de levaduras contienen una proteína de membrana que une el factor de apareamiento alfa soluble, aún no se conocen los receptores para otras proteínas carga solubles como la inversa. Las vesículas COPI median el transporte retrógrado dentro del Golgi y desde el Golgi hacia el RE Las vesículas COPI fueron descubiertas cuando se incubaron fracciones del Golgi aisladas en una solución que contenía ATP, citosol y un análogo no hidrolizable de GTP. Los análisis posteriores de estas vesículas mostraron que la cubierta se forma a partir de grandes complejos citosólicos denominados coatómeros, compuestos de siete subunidades polipeptídicas. Las células de las levaduras que contienen mutaciones sensibles a la temperatura en las proteínas COPI acumulan proteínas en el RE rugoso a la temperatura no permisiva y por ende se categorizan como mutantes sec de clase B. Aunque el descubrimiento de estos mutantes inicialmente sugirió que las vesículas COPI median el transporte del RE al Golgi, experimentos posteriores mostraron que su función principal es el transporte retrógrado, tanto entre las cisternas del Golgi como desde el cis-golgi hacia el RE rugoso (ver nuevamente figura 4). Debido a que los mutantes COPI no pueden reciclar las proteínas de membrana clave de regreso hacia el RE rugoso, al RE se le agotan gradualmente las proteínas como las v-snare necesarias para el funcionamiento de las vesículas COPII. Finalmente la formación de vesículas a partir del RE se reduce hasta paralizarse; las proteínas secretorias continúan sintetizándose pero se acumulan en el RE, la característica definitoria de los mutantes sec de clase b. El RE contiene varias proteínas solubles dedicadas al plegamiento y la modificación de proteínas secretorias recién sintetizadas. Estas incluyen la chaperona BiP y la enzima proteína disulfuro isomerasa, necesarias para que el RE lleve a cabo sus funciones. Aunque esas proteínas luminales residentes en el RE no son específicamente seleccionadas por las vesículas COPII, su meta abundancia hace que sean continuamente cargadas de manera pasiva dentro de vesículas destinadas a la red cis-golgi. El transporte de estas proteínas solubles de regreso al RE, mediado por vesículas COPI, evita su agotamiento. El transporte anterógrado a través del Golgi se produce mediante progresión cisternal En un momento se pensó que las pequeñas vesículas de transporte transportaban proteínas de secreción desde la red cis hasta la red medial del Golgi y desde la red medial hasta la red trans del Golgi. En efecto, la microscopia electrónica revela muchas pequeñas vesículas asociadas con el complejo Golgi al otro (ver figura 6). Sin embargo, estas vesículas muy probablemente median el transporte retrógrado, recuperando enzimas del RE o del Golgi desde un compartimiento posterior Primera Edición

10 y transportándolas a un compartimiento anterior en la vía secretoria. De esta forma las enzimas que modifican las proteínas secretorias vuelven a ser localizadas en el compartimiento correcto. La primera evidencia de que el transporte de proteínas carga hacia delante desde el cis- hacia el trans-golgi tiene lugar mediante un mecanismo no vesicular, denominado progresión cisternal, provino del análisis microscópico cuidadoso de la síntesis de la pared celular de las algas. Las glucoproteínas de la pared celular son ensambladas en el cis-golgi en grandes complejos visibles con el microscopio electrónico llamados escamas. Al igual que otras proteínas secretorias, las escamas recién constituidas se mueven desde el cis- hacia el trans-golgi, pero pueden ser 20 veces más grandes que las vesículas de transporte comunes que brotan de las cisternas del Golgi. De manera similar, en la síntesis del colágeno por los fibroblastos, a menudo se forman grandes agregados del precursor procolágeno en la luz del cis-golgi. Los agregados de procolágeno son demasiado grandes para ser incorporados a pequeñas vesículas de transporte, y los investigadores nunca perdieron encontrar tales agregados en esas vesículas. Estas observaciones sugirieron que el movimiento hacia delante de estas y quizá de todas las proteínas secretorias de un compartimiento del Golgi a otro no sucede a través de pequeñas vesículas. En un análisis del modelo de progresión cisternal, se bloqueó el plegamiento del colágeno con un inhibidor de la hidroxilación de prolina, y poco después se secretaron de la célula los agregados de todo el colágeno preelaborado ya plegado. Cuando se eliminó el inhibidor, los péptidos de procolágeno recién sintetizados se plegaron y formaron agregados en el cis-golgi que pudieron verse luego moviéndose como una onda desde las cisternas cis- a través de las intermedias hacia el trans-golgi, seguida por su secreción e incorporación a la matriz extracelular. En estos experimentos los agregados de procolágeno nunca fueron visibles en las pequeñas vesículas de transporte. Numerosas preguntas controversiales relacionadas con el flujo de la membrana dentro de los sáculos de Golgi, permanecen sin resolver. Sin embargo, el movimiento observado de los grandes ensamblajes macromoleculares a través del apilamiento de sáculos del Golgi y la evidencia previamente descrita de que las vesículas COPI median el transporte retrógrado han llevado a la mayoría de los investigadores a privilegiar el modelo de progresión cisternal. Figura 6. La microfotografia electrónica del complejo de Golgi en una célula exocrina del páncreas revela las vesiculas de transporte tanto anterógrado como retrógrado: Se pueden ver la formación de una ve sicula secretora grande a partir de la red trans-golgi. Los elementos del RE rugoso se encuentran sobre la izquierda. Adyacente al RE rugoso se observan elementos transicionales desde los cuales parecen brotar protuberancias lisas. Estos brotes forman las vesículas pequeñas que transportan proteínas secretorias desde el RE rugoso hasta el complejo de Golgi. Entre las cisternas del Golgi se encuentran diseminadas vesículas pequeñas que ahora se sabe participan en el transporte retrógrado, no en el anterógrado. Primera Edición

11 Referencias: 1. Solomon, Eldra P., Linda R. Berg y Diana W. Martin. Biología, Novena edición, México. 2. Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K. y Watson J. Biología molecular de la célula, Tercera edición, España. 3. Curtis H. y Barnes S.Biología, Sexta Edición (2003). Primera Edición