V. EFECTO DE BIOCONSERVACIÓN DE CARNE MOLIDA DE CERDO, TIPO HAMBURGUESA CON Lactobacillus acidophilus cepa ATCC 4356 y Staphylococcus carnosus NRRLO2

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1 V. EFECTO DE BIOCONSERVACIÓN DE CARNE MOLIDA DE CERDO, TIPO HAMBURGUESA CON Lactobacillus acidophilus cepa ATCC 4356 y Staphylococcus carnosus NRRLO2 Henry Jurado Gámez 1, Constanza Montalvo Rodríguez 2, Cristina Ramírez Toro 3 y Germán Bolívar 4 1,2,3 Escuela de Ingeniería de Alimentos. Universidad del Valle. 4 Departamento de Biología. Universidad del Valle henryjugam@hotmail.com 1, consmonta@gmail.com 2, crisrami123@gmail.com 3, gbolivar11@yahoo.com 4 RESUMEN Se evaluó el efecto de bioconservación de hamburguesa de cerdo (HC) con L. acidophilus ATCC 4356 y S. carnosus NRRLO2. El análisis microbiológico mostró que el conteo de coliformes totales y fecales alcanzó valores de <3 UFC/g durante un período de 30 días, a temperatura ambiente por la acción inhibitoria de las bacterias lácticas (BAL), debido a su producción de ácido láctico y otros compuestos inhibidores secretados por los microorganismos. Se observó que ambas cepas fueron resistentes a ph ácido y que no hay efecto antagónico entre ellas. Los resultados obtenidos muestran el uso potencial de este método de conservación como alternativa a la cadena de frío. Palabras claves: bioconservación, carne molida de cerdo, bacterias lácticas, coliformes totales, inhibición de bacterias patógenas. ABSTRACT The bioconservation effect of pork hamburger with L. acidophilus and S. carnosus was tested. Microbiological analysis shown that total and fecal coliforms were <3 UFC/g during a period of time of 30 days at room temperature, by inhibitory action of acid lactic bacteria because of its acid lactic production and another inhibitory compounds secreted by the microorganisms. It was found that both bacteria were resistant to acid ph and there isn t antagonistic effect between them. The results had shown the potential use of this conservation method as refrigeration alternative. Key words: bioconservation, pork hamburger, lactic acid bacteria, total coliforms, pathogenic bacteria inhibition. I- INTRODUCCIÓN La carne de cerdo por sus características biológicas y composición química, es un excelente medio para la proliferación de gran variedad de microorganismos que provocan su descomposición (Haynes, 1993). Este problema es severo cuando la falta de refrigeración o las condiciones

2 inadecuadas de almacenamiento y transporte provocan la exposición frecuente del alimento a temperaturas superiores a los 5 ºC y humedades altas (Minor Pérez y Guerrero Legarrete, 2003). La congelación es el método de conservación por excelencia, ya que inhibe el desarrollo de microorganismos deteriorativos y patógenos al retardar las reacciones bioquímicas y enzimáticas que se producen en los alimentos a través del descenso de la temperatura del alimento y principalmente por la remoción del agua en forma de hielo (Zaritzky, 2002). Para incrementar la vida útil de carnes, en los últimos años han surgido diversas alternativas a los métodos tradicionales de conservación. Se han empleado cepas de bacterias lácticas (BAL) seleccionadas para conservar carne debido a la producción de agentes antimicrobianos, como ácidos orgánicos o a compuestos como peróxido de hidrógeno, diacetilo, acetaldehído y bacteriocinas entre otros (Caplice y Fitzgerald, 1999; Minor-Pérez H., et al. 2002; Magnusson, 2003), los cuales inhiben el crecimiento de la flora patógena y evitan efectos negativos sobre las propiedades funcionales como el color, la textura y el sabor. En el sector alimentario ha habido un rápido incremento de la demanda de productos 100% naturales, desde el punto de vista del consumidor y de las autoridades. El uso de preservantes químicos en alimentos es cada vez menos recomendado debido a los posibles efectos secundarios producidos a largo plazo. Por ello surge la necesidad de utilizar nuevas alternativas que permitan la elaboración de alimentos protegidos naturalmente, que den solución a problemas de este tipo aportando un mayor beneficio a los productos y al consumidor. Los alimentos funcionales han ganado importancia en el mercado y las BAL juegan un papel importante en esta tendencia. Los probióticos y prebióticos pueden considerarse como las fuerzas conductoras del mercado de los alimentos funcionales. El crecimiento potencial de estos mercados es enorme, especialmente cuando se consideran las aplicaciones al alimento como terapéuticas o alimentos funcionales (De Vuyst, 2000). Cultivos de BAL han sido aplicados directamente con éxito en diferentes alimentos especialmente en productos cárnicos, las bacteriocinas combinadas con lactobacilos han demostrado efecto antilisteria, que puede ser aprovechado en cárnicos según Minor et al. (2002) y Erkkilä (2001), quienes describen la conservación de la carne fresca de cerdo mediante fermentación láctica. El uso de estas BAL constituye una herramienta importante, ya que ayuda a reducir costos de producción y procesamiento como los debidos a la refrigeración y congelación de la carne y sus diferentes derivados, mientras se mejora su calidad organoléptica y microbiológica al tiempo que reduce el uso de conservantes y aditivos artificiales (Erkkilä, 2001). Geisen et al. (1991) confirman que el crecimiento de bacterias patógenas puede ser reducido cuando se aplican cultivos de BAL en la superficie de los productos cárnicos no fermentados como salchichas, carnes cortadas y molidas. El

3 objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de bioconservación de HC con BAL seleccionadas y reconocidas como aptas para el consumo humano como una alternativa al uso de la cadena de frío. II. MATERIALES Y MÉTODOS Se utilizó carne de cerdo molida condimentada en forma natural sin aditivos ni conservantes y BAL Lactobacillus acidophilus cepa ATCC 4356 y Staphylococcus carnosus cepa NRRL O 2 reconocidas como microorganismos generalmente seguros (GRAS), facilitadas por el laboratorio de Biología Marina de la Universidad del Valle. 2.1 Condiciones experimentales Caracterización de las BAL. Esta caracterización fue efectuada con el propósito de verificar si las cepas probadas en el estudio, cumplen con las características deseadas en el proceso de producción de inóculos y preservación del producto, siguiendo lo recomendado por Ramírez et al 2006 y Yimin et al, Se realizaron pruebas de resistencia a diferentes valores (6.0, 4.0, 3.5 y 2.0) de las cepas de BAL para comprobar su crecimiento al descender el ph en el medio de cultivo. Para ello se inocularon en 10 ml de MRS caldo ajustados a cada valor 1 ml de cada suspensión de microorganismo, se tomaron muestras al momento de inoculación y cada hora hasta 3 h después de inoculados. Luego se prepararon diluciones hasta según la metodología de Ramírez (2005) y se sembraron en caja de Petri desde la dilución 10-6 hasta la en Agar-MRS. Pruebas de antagonismo. Se realizó una prueba de antagonismo entre los dos microorganismos con el fin de evaluar la posibilidad de utilizarlos en mezcla y pruebas de inhibición de bacterias patógenas contra las cepas de BAL estudiadas, para comprobar que la bioconservación se produce por inhibición de microorganismos patógenos. Se realizaron cuatro repeticiones de cada prueba de acuerdo a los métodos descritos por Ramírez (2005) en cada caso. Elaboración del inóculo. Se preparó un preinóculo de cada cepa en caldo MRS (De Man Rogosa and Sharp, 1960) a partir de cepas crioconservadas. A partir del preinóculo se preparó 100 ml de inóculo según la formulación sugerida por Ramírez (2005). Tanto para el preinóculo como para el inóculo se permitió un crecimiento de 24 h con agitación constante de 125 rpm, al cabo de las cuales se verificó la pureza del cultivo mediante coloración de Gram. Para obtener HC bioconservadas con BAL se adicionó 10% v/p de inóculo de cada bacteria con viabilidad de 10 9 UFC/mL permitiéndose la impregnación de las BAL a la carne durante 24 h a 30 o C, al cabo de las cuales se retiró el excedente de líquido, posteriormente se moldeó en muestras de 120 g y se empacaron al vacío. Se realizaron cuatro réplicas del experimento y paralelamente fueron moldeadas y empacadas muestras sin inóculo como control. Las hamburguesas empacadas al vacío se almacenaron a temperatura de refrigeración y ambiente evaluándose sus características microbiológicas y fisicoquímicas a la primera y cuarta semana de

4 almacenamiento. La tabla 1, resume los tratamientos empleados. Tabla 1. Tratamientos evaluados para la bioconservación de hamburguesa de cerdo. Temperatura de Almacenamiento Cepa Control Sin inóculo Staphylococcus carnosus cepa NRRLO2 Lactobacillus acidophilus cepa ATCC 4356 Ambiente (25 ºC) M 1 M 2 M 3 Refrigeración (5 ºC) M 4 M 5 M 6 Evaluación microbiológica. Se determinó el Número Más Probable (NMP) de coliformes totales y fecales, el recuento de mesófilos aerobios totales y recuento de BAL para verificar el grado de contaminación de la carne molida y la disminución de ésta luego del tratamiento con BAL y su evolución durante el almacenamiento a las temperaturas en estudio según la metodología descrita por Ramírez (2005). III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Elaboración y caracterización del inóculo. Se verificó que los inóculos de S. carnosus y L. acidophilus tenían una viabilidad de y UFC/mL y alcanzaron ph de 3.6 y 3.7 respectivamente al ser inoculados en la carne molida de cerdo. Estos valores de viabilidad son reportados por Raibaud y Raynaud (1989) como adecuados para el empleo de estos microorganismos en la obtención de preparaciones probióticas, al realizar estudios para la selección de cepas de Lactobacillus como potenciales probióticos. Estudios realizados por Brizuela (2003) y Bolívar (2008) indican que el análisis de estabilidad del probiótico a base de bacterias lácticas arrojaron buenos resultados para el producto, tanto a temperatura ambiente como en refrigeración hasta los 30 días de almacenamiento, manteniendo la concentración en el orden de UFC/mL. Análisis microbiológico. La tabla 2 muestra los promedios de las cuatro repeticiones efectuadas para el análisis del NMP. Se observa que el tratamiento con ambas BAL fue efectivo para la inhibición de microorganismos patógenos, mostrando marcadas diferencias con la muestra control. Esto puede corroborarse con los resultados de los estudios in vitro de antagonismo (Tabla 3), en las que se aprecia inhibición del crecimiento de bacterias patógenas. El recuento de mesófilos totales reportó valores superiores a 10 7 ufc/ml en todas las muestras, correspondiendo con los análisis efectuados para el conteo de BAL en MRS, lo que sugiere que los mesófilos presentes corresponden a las BAL presentes en el inóculo aplicado a las HC. Esto se comprobó a través de coloración de Gram. Lo anterior coincide

5 también con los resultados obtenidos por Ashenafi, (1991) y Hudault et al., (1997) quienes encontraron que las bacterias lácticas presentaron inhibición frente a E. coli, Salmonella y Listeria. Esta inhibición según algunos autores se atribuye a la producción de ácidos orgánicos, entre ellos el láctico; peróxido de hidrógeno, y bacteriocinas (Juven et. al, 1992) y Bolívar (2008). Se presume que el ácido láctico es el principal responsable de la reducción del ph en HC y de la acción inhibitoria. Sobel (1999) plantea que las cepas de Lactobacillus, poseen mayor potencialidad y son los más utilizados hasta el momento, ya sea de forma individual o en combinación con otros microorganismos para la obtención de preparaciones con propiedades probióticas, útiles para la conservación de carnes. L. acidophilus ha sido utilizado en la elaboración de productos cárnicos tipo salami, con poblaciones de 10 8 UFC/ g (Minor-Pérez, et al. 2002). Los mismos autores reportaron estudios de la aplicación de Staphylococcus carnosus y Lactobacillus alimentarius en la conservación de la carne fresca de cerdo vía fermentación láctica. Los resultados mostraron que las BAL reducen a <3 el NMP de coliformes en el tiempo cuando son almacenadas a temperatura ambiente, indicando la posibilidad de sustituir el uso de la cadena de frío por éste método de conservación (Betancourt y Quintero, 2002). Tabla 2*. Número Más Probable reportado para los análisis de las muestras de coliformes totales y fecales (NMP/g) a la semana 1 y 4 de aplicación de los probióticos. Tiempo Cepa Coliformes totales T. Ambiente T. Refrigeración Coliformes fecales Coliformes totales Coliformes fecales 1 semana Lb. acidophilus S. carnosus Control semanas Lb. acidophilus < S. carnosus < Control *Reporte del promedio de cuatro repeticiones.

6 Tabla 3. Antagonismo de BAL vs Bacterias Patógenas y entre ellas mismas. Bacteria Diámetro Halo de Inhibición (mm) NRRL O2 ATCC Escherichia coli 4 4 Klebsiella pneumoneae 4 5 Staphylococcus aureus 6 6 Serratia marcescens 6 5 Proteus vulgaris 7 7 Salmonella thyphimurium 4 5 Shigella spp. 5 5 Pseudomonas aureuginosa 7 6 Vibrio cholerae 4 4 Yersinia enterocolítica 7 8 NRRLO2-0 ATCC *Los valores reportados corresponden al diámetro del halo de inhibición en mm observado en la prueba de antagonismo. Se reportó el promedio aritmético de cuatro repeticiones. Resistencia de las BAL a ph ácidos. Las tablas 4 y 5 muestran los resultados de la prueba de resistencia a diferentes valores. Los resultados indican que el medio de cultivo se acidifica luego de la inoculación del microorganismo y continúa su acidificación en el tiempo y su viabilidad se mantiene entre 10 6 y UFC/mL hasta ph 2,0 para en el caso de Lb. acidophilus y ph 3,5 para S. carnosus. De acuerdo con Ramírez (2005) algunas BAL son capaces de sobrevivir hasta ph 2,0 y según De Roissart (1994) las BAL tienen crecimiento óptimo a ph 6,5 a 7,0. Los resultados encontrados indican que los microorganismos utilizados pueden crecer en medios ácidos, siendo una característica favorable ya que el proceso no requeriría control, resultando económico a nivel industrial. Pruebas de antagonismo. La prueba de antagonismo entre las dos BAL mostró que L. acidophilus no inhibe el crecimiento de S. carnosus. (Tabla 3). Esto concuerda con lo reportado por Betancourt y Quintero (2002), quienes encontraron que Lb. alimentarius y Lb. animalis no compiten entre sí y por tanto los utilizaron en mezcla para bioconservar cárnicos marinos obteniendo excelentes resultados. Este resultado habilita la posibilidad de usar inóculos con mezcla de ambas cepas para así proporcionar un mayor radio de acción de los probióticos en cuanto a inhibición de patógenos y propiedades organolépticas del producto.

7 Tabla 4. Resistencia al ph de S. carnosus NRRL 02 ph 6.0 ph 4.0 ph 3.5 ph 2.0 Tiempo (h) x x x x x x x x x Tabla 5. Resistencia al ph de Lb. acidophilus ATCC 4356 ph 6.0 ph 4.0 ph 3.5 ph 2.0 Tiempo (h) x x x x x x x x x x x x FIGURA I. ENSAYO DE ANTAGONISMO DE BAL vs. BACTERIAS PATÓGENAS

8 IV. CONCLUSIONES Se comprobó que las cepas de BAL estudiadas ejercen efecto de bioconservación en HC al disminuir el conteo inicial de coliformes tras 4 semanas de almacenamiento, mostrando mayor efectividad a temperatura ambiente ofreciendo la posibilidad de sustituir la cadena de frío por este método de conservación. Este resultado se corroboró con las pruebas de antagonismo realizadas entre BAL y bacterias patógenas. El ensayo de antagonismo entre las dos cepas de BAL estudiadas indica que se pueden usar ambos microorganismos en mezcla para lograr un mejor efecto de bioconservación. Como recomendación final, se sugiere realizar pruebas de aceptación y análisis sensorial con el fin de evaluar las propiedades organolépticas del producto. Así mismo, se propone evaluar el efecto de inhibición de las BAL contra otras bacterias patógenas como Listeria monocytogenes y Clostridium perfringens, altamente contaminantes de alimentos. Por último, se recomienda realizar ensayos de inhibición y bioconservación con sobrenadantes de BAL neutralizados para verificar si la inhibición se debe a la acción de los ácidos orgánicos y otros componentes o a la acción de biocinas producidas por las BAL. V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS American Public Health Association. (1998). Compenduim of methods for the Microbiological Examination of foods. Second edition p. Ashenafi, M. (1991). Growth of Listeria monocytogenes in fermenting tempeh made of various beans and its inhibition by Lactobacillus plantarum. Food Microbiology, 8, Betancourt, S.P., Quintero, J.I. (2002). Diseño preliminar del proceso de producción de bacterias ácido lácticas productoras de ácido láctico y biocinas para la conservación y preservación de cárnicos marinos. Universidad del Valle. Facultad de Ingeniería. Escuela de Ing. Química. Santiago de Cali. Bolívar, N.C. (2008). Evaluación de sobrevivencia y respuesta inmunitaria de camarones juveniles Litopenaeus vannamei alimentados con bacterias lácticas probióticas y desafiados con Pseudomonas aeruginosa. U.del Valle. Facultad de Ciencias Naturales y Exactas. Programa Académico de Biología. Santiago de Cali. Brizuella, M. (2003). Selección de cepas de bacterias ácido lácticas para la obtención de un preparado con propiedades probióticas y su evaluación en cerdos. Tesis Doctoral. Instituto Cubano de los Derivados de la Caña de Azúcar ICIDCA. Caplice, E., Fitzgerald, G. F. (1999). Food fermentations: role of microorganisms in food production and preservation. J. Food Microbiology, 50, De Man, J.C., Rogosa, M. and Sharpe, M.E. (1960). A medium for the Cultivation of Lactobacilli. J.Appl. Bact. 23, p.

9 De Roissart, H., Luquet, F. M. (1994). Bacteries lactiques Aspects Fundamen taux et Technologiques. Ed. Lorica, France. 2 De Vuyst, L. (2000). Technology Aspects Related to the Application of Functional Starter Cultures. Food Technology. Biotechnology, 38 (2): p. Geisen, R., Lucke, F K., Krockel, I. (1991). Fleischwiptsch, 71, Erkkilä, S. (2001). Bioprotective and Probiotic Meat Starter Cultures for the Fermentation of Dry Sausages. Academic Dissertation. University of Helsinki. Haynes, P.R. (1993). Microbiología e higiene de los alimentos. Zaragoza, España, Acribia. Hudault, S., Lievin, V., Bernet-Camard, M.F., Servin, A.L. (1997). Antagonistic activity exerted in vitro and in vivo by Lactobacillus casei (strain GG) against Salmonella typhimurium C5 infection. Appl Environ. Microbiology, 63, Juven, B.J., Schved, F., Lindner, P. (1992). Antagonistic compounds produced by a chicken intestinal strain of Lactobacillus acidophilus. J. Food Protection, 55, Magnusson, J. (2003). Antifungal activity of lactic acid bacteria. Doctor s Dissertation. Uppsala, Sweden. Minor, H. y Guerrero, I. (2003). Efecto de la Fermentación Láctica con Staphylococcus carnosus y Lactobacillus alimentarius sobre la Fracción Miofibrilar de Proteínas de Carne de Cerdo. Revista Mexicana de Ingeniería Química. 2, Minor, H., Ponce, E., Macías, S. y Guerrero I. (2002). Conservación de la Carne Fresca de Cerdo por Fermentación Láctica. Efecto Sobre el Color, la Textura y la Formación de los Ácidos Grasos Libres. Rev. Mexicana de Ingeniería Química, 1, Raibaud, P., Raynaud, J.P. (1989). Géme SIMAVIP. Eds: AFMVP. 9. Ramírez T.C. (2005). Uso de bacterias lácticas probióticas na alimentação de camarões Litopenaeus vannamei como inibidoras de microrganismos patogênicos e estimulantes do sistema inume. Tese de doutorado da Universidade Federal do Paraná, Curitiba Brasil, 152. Ramírez, C. (2006). Metodología para el seguimiento de un proceso de fermentación. Universidad del Valle, Cali. Sobel, J.D. (1999). Biotherapeutic agents as therapy for vaginitis. Biotherapeutic agents and infectious diseases. G. W. Elmer, L. McFarland, and C. Surawicz (eds.). Humana Press Inc., Totowa, N.J Yimin, C., Puangpen S., Premsuda S. And Yoshimi, B. (1999). Classification and characterization of lactic acid bacteria isolated from the intestines of common carp and freswater prawns. J. Gen Appl. Microbiology, 45,

10 Zaritzky, N. E. (2002). Preservación III. Congelación de Alimentos. Temas en Tecnología de Alimentos. Volumen 1. CYTED. Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo. Instituto Politécnico Nacional. Alfaomega Grupo Editor. México AGRADECIMIENTOS Los autores manifiestan sus agradecimientos a la empresa Cerdos del Valle S.A. (Cervalle S.A.) por el soporte económico ofrecido a esta investigación y a la Escuela de Ingeniería de Alimentos de la Universidad del Valle.