Unidad 6. INTRODUCCIÓN A LA COMUNICACIÓN CELULAR

Transcripción

1 Introducción Unidad 6. INTRODUCCIÓN A LA COMUNICACIÓN CELULAR Para conservar la homeostasis, es decir, un ambiente interno equilibrado, las células continuamente deben recibir y responder a señales provenientes de su ambiente externo de diversas maneras (1). Parte de esta información es enviada por otras células. Las células eucariotas por ejemplo, responden a moléculas señalizadoras secretadas por otras células, permitiendo la comunicación célula a célula mientras que las bacterias pueden responder a concentraciones elevadas de mediadores químicos producidos por otras bacterias (muchas veces también, por células eucarióticas), así como también a concentraciones altas de nutrientes (como glucosa o aminoácidos) y hasta estímulos físicos como la luz. Mientras que las células procariotas y las de organismos eucariotas unicelulares son, en gran medida, autónomas, el comportamiento de cada célula en los organismos pluricelulares se debe regular cuidadosamente para satisfacer los requerimientos del organismo como un todo, lo cual se consigue a través de un amplio repertorio de moléculas señalizadoras que son secretadas, o se expresan, en la superficie celular y luego se unen a receptores expresados en otras células, integrando y coordinando las funciones de las distintas células que constituyen organismos tan complejos como el ser humano. La unión de la mayoría de estas moléculas señalizadoras a sus receptores induce una cascada de reacciones intracelulares que acaban por alcanzar el núcleo celular y que dan lugar a alteraciones programadas de la expresión génica, con lo que se regulan los diferentes aspectos del comportamiento celular (metabolismo, motilidad, supervivencia y diferenciación) (2). Los biólogos celulares están expandiendo grandemente su entendimiento de la comunicación entre las células. Ellos han descubierto que las fallas en la señalización pueden causar o contribuir a una variedad de enfermedades, incluyendo el cáncer y la diabetes. Por ejemplo, muchos tipos de cáncer surgen por una alteración en las vías de señalización celular que controlan la proliferación y supervivencia de las células sanas. Una compresión más clara de los mecanismos de comunicación celular sugiere nuevas estrategias para prevenir o tratar estas enfermedades (1).

2 Componentes de la señalización celular Generalmente, todo proceso de comunicación tiene tres componentes principales: un emisor, un mensaje y un receptor. El emisor, es alguien que envía el mensaje, en nuestro caso sería la célula emisora y el mensaje mismo recibe varios nombres, se conoce como molécula de señalización, ligando o primer mensajero. Una vez emitido el mensaje, debe haber alguien que lo reciba, en nuestro caso, es una célula que llamaremos la célula receptora o célula diana. Se caracteriza porque expresa moléculas que se unirán al ligando mejor conocidas como receptores que transmitirán el mensaje al interior de esta célula generando una respuesta. Ilustración 1. Célula emisora y célula receptora

3 Etapas de la comunicación celular La señalización celular implica una serie de etapas: Ilustración 2. Etapas de la señalización celular. Desde la perspectiva de la célula que recibe el mensaje, la señalización celular puede dividirse en cuatro etapas: el envío de la señal, la recepción de las señales, la transducción de las señales y la respuesta celular. Cuando la recepción tiene lugar en la membrana plasmática, como se muestra aquí, la etapa de transducción generalmente es una vía de varios pasos, en la que cada molécula en la vía ocasiona un cambio en la siguiente molécula. La última molécula en la vía desencadena la respuesta.

4 Envío de la señal Es la manera en la que se envía la molécula de señalización y puede ocurrir de varias formas: Contacto directo: Dos células se acercan de tal forma que el ligando y el receptor entran en estrecho contacto en la superficie celular, este intercambio de señales puede estimular a una o ambas células. Autocrina: En este caso la célula emisora se convierte ella misma en célula diana de las mismas moléculas de señalización que ella produce. Paracrina: La célula emisora produce moléculas de señalización que se difunden al líquido intersticial (líquido que rodea a las células en un tejido) y actúa sobre células vecinas. Por ejemplo, aunque algunas neuronas se comunican mediantes señales eléctricas, la mayoría de ellas se comunican entre sí liberando compuestos químicos llamados neurotransmisores. Estas moléculas difunden a través de la ranura sináptica, la estrecha unión entre dos neuronas adyacentes (2). Se han identificado más de 60 neurotransmisores diferentes, algunos de estos son: acetilcolina, noradrenalina, dopamina, serotonina y varios aminoácidos y péptidos. Endocrina: En este caso, las células de las glándulas endocrinas, producen moléculas de señalización llamadas hormonas. Estas glándulas no tienen conductos por lo que sus hormonas se secretan al líquido intersticial circundante y de allí se difunden al interior de los capilares y son transportadas disueltas en la sangre hasta alcanzar la célula diana. El óxido nítrico (NO) que es un gas puede actuar tanto de forma paracrina como autocrina afectando solo las células cercanas a su punto de síntesis.

5 Ilustración 3. Tipos de envío de la señal. Varias células se comunican en diferentes formas. Recepción Sucede cuando la molécula de señalización se une a su receptor en la célula diana y puesto que la recepción es tan específica como la unión del sustrato a su enzima, solo la molécula de señalización que encaje con su receptor especifico puede influir sobre la maquinaria metabólica de la célula. Cientos de tipos diferentes de moléculas de señalización rodean a las células de un organismo, cómo hace la célula para reconocer que mensajes son para ella?

6 La respuesta es que cada tipo de célula está programada genéticamente para recibir y responder a tipos específicos de señales. La respuesta a determinadas señales depende de los receptores específicos que está programada para sintetizar. Los receptores son importantes para determinar la especificidad de la comunicación celular, tipos diferentes de células pueden tener tipos diferentes de receptores. Además la misma célula puede expresar receptores diferentes en distintas etapas de su ciclo vital y en respuesta a condiciones distintas. Otra consideración es que la misma señal puede tener significados diferentes para diversas células diana (1). En el proceso de recepción intervienen dos componentes principales de la señalización celular, la molécula de señalización y el receptor, veamos algunas características generales de estos que les permiten cumplir con su función. La molécula de señalización o ligando es la molécula que se une a un receptor especifico. Existen dos tipos de ligandos: los hidrofílicos y los hidrófobos. Los ligandos hidrofílicos son los más abundantes y se unen a receptores de naturaleza proteica sobre la superficie de la célula diana. Los ligandos hidrófobos, son moléculas pequeñas que atraviesan la membrana plasmática y entran a la célula. Los receptores pueden ser divididos en dos grandes grupos, los receptores de superficie y los receptores intracelulares. Ilustración 4. Receptores de superficie e intracelulares. a) Las moléculas de señalización hidrófilas se unen a receptores en la membrana plasmática; b) Las moléculas de señalización hidrófobas cruzan la membrana plasmática y se unen con receptores en el interior de la célula.

7 Los receptores de superficie Son proteínas o glicoproteínas que se encuentran insertadas en la membrana plasmática y que se unen a moléculas de señalización en esta superficie celular. Generalmente tienen tres dominios estructurales (en bioquímica, el termino dominio hace referencia a una región estructural y funcional de una proteína) (2). El domino externo, es el lugar de acoplamiento para el ligando. El dominio transmembrana, se extiende a través de la membrana plasmática. El dominio citoplasmático, generalmente es una secuencia de aminoácidos que a veces se llama la cola del receptor y que se extiende dentro del citoplasma y es la encargada de transmitir la señal al interior de la célula (2). La señalización celular tiene lugar a través de la interacción directa entre una célula y la célula vecina o mediante la acción de moléculas señalizadoras secretadas (2). Los receptores de superficie se dividen a su vez en tres tipos principales: receptores asociados a canales iónicos, receptores acoplados a proteínas G, y los receptores con actividad enzimática.

8 Ilustración 5. Estructura de un receptor de superficie. Receptores asociados a canales iónicos: Se encuentran en la membrana plasmática de muchas células y se han estudiado en profundidad en neuronas y en células musculares. Estos receptores convierten las señales químicas en señales eléctricas. En muchos casos el receptor puede el mismo funcionar como canal. El ligando puede ser un neurotransmisor o un ión del interior de las células (1).

9 Ilustración 6. Receptores asociados a canales iónicos. a) Se muestra un receptor asociado a un canal iónico regulado por ligando que permanece cerrado hasta que un ligando se une a él; b) Cuando el ligando se une al receptor y la entrada se abre, iones específicos pueden fluir a través del canal y cambiar rápidamente la concentración de ese ión en particular dentro de la célula. Este cambio puede afectar directamente la actividad de la célula en cierta forma; c) Cuando el ligando se disocia de éste receptor, la entrada se cierra y los iones no entran más a la célula.

10 Receptores acoplados a proteínas G: Son proteínas transmembrana que se pliegan hacia adelante y hacia atrás siete veces dentro de la membrana plasmática. El receptor consta de siete hélices alfa transmembrana conectadas por bucles que se extienden hacia el citosol o hacia el exterior de la célula. La parte externa del receptor tiene un lugar de unión para el ligando y la parte del receptor que se extiende hacia el citosol tiene un sitio de unión para una proteína G especifica. La G significa trifosfato de guanosina (GTP), que es el compuesto al que la proteína G se une cuando se activa. Cuando un ligando se une a un receptor acoplado a proteína G, el receptor cambia de forma. Este cambio permite que la proteína G se asocie a la porción intracelular del receptor. Entre estos receptores se incluyen muchos neurotransmisores, neuropéptidos y hormonas peptídicas. Aproximadamente el 60% de los medicamentos prescritos en la actualidad activan este tipo de receptores (1). Ilustración 7. Receptores acoplados a proteínas G. a) Ligeramente unida al lado citoplasmático de la membrana, la proteína G funciona como un interruptor molecular que está encendido o apagado, según cual de los dos nucleótidos guaninaesté adherido, GDP o GTP, de allí el término proteína G (el GTP, oguanosina trifosfato, es similar al ATP). Cuando el GDP está unidoa la proteína G, como se muestra arriba, ésta se encuentra inactiva.el receptor y la proteína G trabajan junto a otra proteína, generalmente, una enzima. b) Cuando la molécula señal apropiada se une al lado extracelular del receptor, el receptor se activa y cambia de forma. Su lado citoplasmático se une a una proteína G inactiva y ocasiona que un GTP desplace al GDP. Esto activa a la proteína G. c) La proteína G activada se disocia del receptor y se difunde a lo largo de la membrana, luego se une a una enzima y altera su actividad. Cuando la enzima está activada puede desencadenar el siguiente paso en una vía que conduce a una respuesta celular. d) Los cambios en la enzima y en la proteína G son solo temporales debido a que la proteína G también funciona como una enzima GTPasa y pronto hidroliza su GTP unido a GDP. Ahora nuevamente inactiva, la proteína G deja a la enzima, que regresa a su estado original. La proteína G ahora está disponible para ser reutilizada. La función GTPasa de la proteína G permite que la vía se apague rápidamente cuando la molécula señal deja de estar presente.

11 Receptores con actividad enzimática: Funcionan directamente como enzimas o se asocian a ellas. Estos receptores son proteínas transmembrana con un sitio de unión para un ligando del exterior de la célula y un componente enzimático dentro de la célula. Algunos receptores con actividad enzimática, no tienen componente enzimático pero si un sitio de unión para una enzima. Dentro de este tipo de receptores se encuentran: los receptores tirosina quinasa, que son la familia más grande de receptores con actividad enzimática, y cuyas colas citoplasmáticas tienen actividad quinasa es decir, fosforilan proteínas sustrato de la vía de señalización en los residuos de tirosina (1). Ilustración 8. Receptores con actividad enzimática.

12 Dentro de esta familia se incluyen los receptores para la mayoría de los factores de crecimiento polipeptídicos, de modo que la fosforilación de las tirosinas de las proteínas en las rutas de señalización, es un mecanismo involucrado en el control del crecimiento y diferenciación de las células animales (2). También existen receptores asociados a enzimas serina/treonina quinasas que en lugar de fosforilar residuos de tirosina en las proteínas lo hacen en residuos de serina o treonina. La activación de estos receptores controla la proliferación y diferenciación de varios tipos celulares. Aunque la mayoría de los receptores asociados a enzimas estimulan la fosforilación, algunos receptores se encuentran asociados a otras actividades enzimáticas. Dentro de éstos se incluyen: las tirosina fosfatasas que quitan grupos fosfato de los residuos de tirosina, actuando de manera opuesta a las tirosina quinasas y los receptores con actividad guanilato ciclasa que tienen un dominio extracelular de unión al ligando, una única hélice alfa transmembrana, y un dominio citosólico con actividad enzimática. La unión al ligando estimula la actividad catalítica, convirtiendo el GTP en cgmp (GTP cíclico), el cual actúa como segundo mensajero (2). Los receptores intracelulares Están localizados dentro de la célula, los ligandos que se unen a estos son moléculas de señalización hidrófobas de tamaño pequeño que se difunden a través de la membrana de la célula diana. La mayoría de los receptores intracelulares son factores de transcripción, es decir, son moléculas que regulan la expresión de genes específicos. Las vitaminas A, D y el óxido nítrico (NO) se unen a receptores intracelulares, después el complejo se mueve al núcleo. Las hormonas derivadas de esteroides como las hormonas tiroideas entran al núcleo y se unen a receptores que ya están unidos al ADN (1).

13 Ilustración 9. Receptores intracelulares. Transducción de la señal Es el proceso mediante el cual, la señal extracelular se convierte en una señal intracelular, de esta forma, los mecanismos de señalización intracelulares conectan la superficie celular con el núcleo, dando lugar a variaciones en la expresión génica como respuesta a los estímulos extracelulares (2). En una ruta típica de señalización el ligando sirve como el primer mensajero que activa al receptor, por ejemplo cuando un ligando se une a un receptor de superficie celular este último se activa cambiando la forma de su cola que se extiende hacia el interior del citoplasma. A continuación, la señal puede transmitirse a través de una secuencia de proteínas intracelulares. En general, diferentes receptores activan diferentes rutas de transducción de señales, aunque también es posible que existan rutas de transducción de señales comunes para diferentes receptores (1). Con frecuencia, puede suceder

14 que el ligando sirva como el primer mensajero y la señal se transmitida por medio de una proteína G a un segundo mensajero (2). Los segundos mensajeros No todos los componentes de las vías de transducción de señales son proteínas. Muchas involucran pequeñas moléculas no proteicas solubles en agua o iones denominados segundos mensajeros (la molécula de señalización extracelular que se une al receptor de la membrana es un primer mensajero de la vía).los segundos mensajeros son agentes de señalización intracelular, en general son iones o pequeñas moléculas que transmiten señales al interior de la célula (2). Estos se producen en grandes cantidades cuando los receptores se activan. Los segundos mensajeros son pequeños, por lo que generalmente se pueden difundir a través de la célula (o de la membrana) transmitiendo la señal. No son enzimas pero algunos regulan enzimas específicas, como las proteínas quinasas, otros se unen a canales iónicos abriéndolos o cerrándolos (1). Algunos segundos mensajeros transmiten señales a otras moléculas que pasan la señal a través de rutas compuestas por proteínas y por otras moléculas. La última molécula de la secuencia estimula la respuesta final. Estas cadenas de moléculas que transmiten una señal dentro de la célula se denominan cascada de señalización (2). A continuación estudiaremos los segundos mensajeros, AMP cíclico (camp), diacilglicerol (DAG), fosfatidil inositol-3, 4, 5- trifosfato (IP 3 ) y los iones calcio (Ca 2+ ) que se producen como consecuencia de la activación de receptores acoplados proteínas G. Los iones Ca 2+ también pueden producirse por la activación de los receptores con actividad enzimática como los receptores tirosina quinasa. También, estudiaremos el GMP cíclico (cgmp), que se produce como consecuencia de la señalización mediada por el óxido nítrico. El AMP cíclico (camp): Se produce a partir del ATP cuando la enzima adenilato ciclasa (AC, por Adenylate Cyclase ) se activa. El camp, activa la proteína quinasa A (PKA, por Protein Kinase A ), que en las células del musculo esquelético activa enzimas que degradan el glucógeno liberando glucosa proporcionando energía a las células musculares (1).

15 Ilustración 10. Señalización mediada por camp. El primer mensajero activa a un receptor asociado a una proteína G, la que activa a una proteína G específica. A su vez, la proteína G activa la adenilato ciclasa, que cataliza la conversión de ATP en camp. El camp activa a otra proteína, generalmente, una proteína quinasa. GMP cíclico (cgmp): También es un segundo mensajero importante en las células animales. Se sintetiza a partir del GTP por la guanilato ciclasa soluble (sgmp, por Soluble Guanylate Cyclase ) y se degrada a GMP por una enzima fosfodiesterasa (PDE, por PhosPhoDiesterase ). La activación sgmp por el óxido nítrico (NO, por Nitric Oxide ) aumenta el nivel de cgmp, el cual interviene como mediador de respuestas biológicas, como la vasodilatación. Ejerce su función principalmente a través de proteínas quinasas dependientes de cgmp como la proteína quinasa G (PKG, por Protein Kinase G ) (3).

16 Ilustración 11. Señalización mediada por cgmp. NO, óxido nítrico; sgc, guanilato ciclasa soluble; GTP, guanosina trifosfato; cgmp, guanosina monofosfato cíclico; PDE, fosfodiesterasa; PKG; proteína quinasa G. El diacilglicerol (DGA): DGA, se sintetiza en la membrana del retículo endoplásmico liso (REL), a partir de glicerol y dos ácidos grasos. Aunque, también se produce por la hidrólisis del fosfolípido ubicado en la membrana plasmática llamado fosfatidil inositol 4, 5 bifosfato (PIP 2 ) cuando la enzima fosfolipasa C (PLC, por PhosphoLipase C ), se activa. Una vez sintetizado permanece en la membrana plasmática y junto con los iones calcio (Ca 2+ ) activa enzimas como la proteína quinasa C (PKC, por Protein Kinase C ). Miembros de esta familia de quinasas fosforilan diversas proteínas. Dependiendo del tipo de célula y PKC específica, la respuesta de la célula puede incluir: su crecimiento, un cambio en el ph o la regulación de ciertos canales iónicos (1). Trifosfato de inositol (PIP 3 ): Es un miembro de una familia de mensajeros inositol fosfato. Se produce por la hidrólisis de PIP 2 cuando la enzima PLC, se activa. Es una molécula soluble y se difunde a través de la célula donde se une a su receptor ubicado une en el (REL), particularmente a canales de Ca 2+ haciendo que estos se abran y liberen iones de Ca 2+

17 al citosol con lo cual la concentración de Ca 2+ citosólico incrementa, provocando un cascada de actividad y cambios intracelulares (1). Iones calcio (Ca 2+ ): Los iones Ca 2+ son liberados al citoplasma durante la transducción de señales cuando los canales de Ca 2+ de retículo endoplásmico (RE), se activan. Aunque pueden actuar solos, normalmente ejercen sus efectos uniéndose a determinadas proteínas, por ejemplo la calmodulina que se encuentra en todas las células eucarióticas, se activa cuando se le unen cuatro iones Ca 2+, cambia de forma y puede activar determinadas enzimas como proteínas quinasas dependientes de calmodulina. Debido a que el PIP 3 actúa antes que el Ca 2+, en estas vías el Ca 2+, puede considerarse como un tercer mensajero. Sin embargo, los científicos utilizan el término segundo mensajero para todos los componentes no proteicos de las vías de transducción de señales (2). Aunque las células siempre contienen iones Ca 2+, este ión puede funcionar como segundo mensajero debido a que su concentración en el citosol normalmente es mucho menor que su concentración fuera de la célula. Los iones Ca 2+, se transportan activamente fuera de la célula y se importan activamente hasta el interior del RE (y, en ciertas condiciones, a la mitocondria y a los cloroplastos) mediante bombas proteicas. Como resultado la concentración de Ca 2+, en el RE es generalmente mucho mayor que la del citosol. Debido a que el nivel de Ca 2+, citosólico es bajo, un pequeño cambio en los números absolutos de iones representa un cambio de porcentaje relativamente grande en la concentración de Ca 2+ (2).

18 Ilustración 12. Señalización mediada por PIP2 y DAG. PIP 2, fosfatidil inositol 4, 5 bifosfato; DAG, diacilglicerol; IP 3, fosfatidil inositol-3, 4, 5- trifosfato; ER, retículo endoplásmico. La transducción de señales es un proceso rápido y preciso que requiere no solo que las enzimas participen activamente en las rutas de señalización, sino también que estén organizadas de modo que estén disponibles para activarse y transmitir la señal. Existen unas proteínas especiales conocidas como proteínas de andamiaje que tienen como función organizar grupos de moléculas de señalización intracelular en complejos de señalización. Las proteínas de andamiaje colocan a las enzimas próximas a sus sustratos e impiden que estas sean utilizadas al mismo tiempo por otras rutas. De este modo estas proteínas de andamiaje aseguran que las señales se transmitan de forma correcta, rápida y más eficaz (1).

19 Ilustración 13. Proteínas de andamiaje. La proteína de andamiaje que se muestra aquí se une simultáneamente a un receptor de membrana de forma específica y a tres proteínas quinasas diferentes. Esta configuración física facilita la transducción de señales por estas moléculas haciéndola más eficiente. Amplificación de la señal Las moléculas de señalización se presentan normalmente a concentraciones muy bajas, a pesar de que sus efectos sobre las células son a menudo profundos. Las vías de señalización con una multiplicidad de pasos amplifican la señal, lo cual contribuye no solamente a que la respuesta sea mayor sino más específica. El proceso de amplificación de la señal sucede cuando la unión de un ligando a su receptor activa en cada paso de la vía un número mayor de moléculas que en el paso precedente, de tal forma que algunas moléculas activadas darán lugar a cambios de millones de moléculas al final de la ruta de señalización. Esto es debido a que en cada paso de la vía, las moléculas permanecen de forma activa suficiente tiempo para activar muchas otras moléculas antes de volverse inactivas nuevamente. Como resultado se potencia la señal inicial, de modo que solo unas pocas moléculas de señalización pueden inducir respuestas importantes en la célula (1).

20 Ilustración 14. Amplificación de la señal. Respuestas a las señales La respuesta de una célula concreta a una señal depende de su conjunto particular de proteínas receptoras de señales, proteínas transmisoras (de andamiaje) y proteínas necesarias para llevar a cabo la respuesta. Por ello dos células diferentes pueden dar lugar a respuestas distintas a la misma señal (1). Aunque una señal puede llevar a una sola respuesta particular, es posible que diverja (se ramifique), para dar lugar a dos o más respuestas diferentes. También es posible que dos señales que activan a receptores diferentes sobre la misma célula converjan

21 (interaccionen) para provocar una misma respuesta. La ramificación de vías y la convergencia de vías ( conversación cruzada ), son importantes para regular y coordinar una respuesta celular a la información proveniente de diferentes fuentes en el cuerpo. Además la utilización de algunas de las proteínas en más de una vía permite a la célula reducir el número de proteínas diferentes que debe elaborar (2). Una vía de transducción de señales conduce a la regulación de una o más actividades celulares. La respuesta puede tener lugar en el citoplasma o en el núcleo. La mayoría de las respuestas se incluyen en tres categorías: abertura o cierre de canales iónicos, alteración de la actividad enzimática, lo que conduce a cambios metabólicos y otros efectos; y actividad genética específica que puede activarse o desactivarse. Aunque muchas vías de señalización tienen como consecuencia la síntesis regulada de enzimas u otras proteínas, por lo general, activando o desactivando genes específicos en el núcleo, algunas vías de señalización solo generan la regulación de determinadas enzimas. Estas respuestas pueden dan lugar a cambios en la forma de la célula, en la división y en la diferenciación celular (1). Terminación de la señal Para que una célula permanezca alerta y sea capaz de responder a las señales entrantes, cada cambio molecular en sus vías de señalización debe durar muy poco tiempo. Una vez que la señal ha cumplido su función, esta debe terminar su acción. La terminación de la señal devuelve al receptor y a cada uno de los componentes de la ruta de transducción de señales a sus estados inactivos. De modo que las moléculas del sistema de señalización estén preparadas para responder a nuevas señales. Como resultado, la célula está rápidamente preparada para responder a una nueva señal (1). Si el componente de una vía de señalización queda bloqueado en un estado, (activo o inactivo) pueden presentarse consecuencias nefastas para el organismo (2). Esta acción permite que la amplificación de la respuesta refleje la potencia de la señal.

22 Ilustración 15. Respuesta a las señales. La respuesta a la señal puede ser de tipo citoplasmática, nuclear o ambas. Este diagrama es una representación simplificada de una vía de señalización típica que conduce a la regulación de la actividad de los genes en el núcleo celular. La molécula señal inicial, un regulador local llamado factor de crecimiento, desencadena la cascada de fosforilación (las moléculas de ATP que sirven como fuente de fosfato no se muestran). Una vez fosforilada, la última quinasa en la secuencia entra en el núcleo y allí activa a una proteína reguladora de genes, un factor de transcripción. Esta proteína estimula un gen específico de forma que se sintetiza un ARNm, que luego dirige la síntesis de una proteína particular en el citoplasma. En el caso de las señales transmitidas a través de receptores acoplados a proteína G, se ha observado que después de que la proteína G se activa, una de sus subunidades con actividad GTPasa cataliza la hidrólisis de GTP a GDP. Esta acción inactiva la proteína G y termina la señal (1). Las vías de señalización activadas por receptores acoplados a proteínas G, que provocan la producción de camp, pueden inactivarse temprano en la ruta de señalización, cuando la enzima PDE inactiva el camp convirtiéndolo en AMP con lo cual la vía se termina, así que cualquier aumento en su concentración es temporal. De modo que la concentración de camp es controlada por la enzima AC que lo produce a partir de ATP y por la enzima PDE que lo inactiva (1). La vía de señalización mediada

23 por el óxido nítrico, también puede inactivarse por la enzima PDE pues convierte el cgmp a GMP como lo hace con el camp. Cuando un ligando se une a los receptores tirosina quinasa este provoca la dimerización del receptor y hace que las colas citoplasmática se fosforilen y el receptor se active, este tipo de receptores es inactivado por enzimas fosfatasas que retiran los grupos fosfatos terminando la señal. También existen receptores tirosina fosfatasas que cuando son activados por su ligando, inactivan los receptores tirosina quinasa desfosforilándolos, actuando como reguladores negativos en las vías de señalización celular porque terminan la señal (1, 2). De forma similar una enzima quinasa activa una proteína mediante fosforilación, mientras que una fosfatasa la inactiva eliminando el grupo fosfato (1). Para restablecer las condiciones iníciales en las vías de señalización que provocan la liberación de Ca 2+ a partir de canales del retículo RE, estos iones son devueltos desde el citosol donde fueron liberados hacia el interior del RE mediante bombas de calcio. También existen ligandos antagónicos que compiten con los ligandos normales por la unión al receptor y que cuando se unen a los receptores no generan una señal que provoque la cascada de señalización en lugar de esto inactivan al receptor. Cuando la señal no se detiene La falla en la terminación de la señal puede llevar a consecuencias desastrosas. El cólera es una de las enfermedades diarreicas más graves que afecta a los humanos y es responsable por una morbilidad y mortalidad significativa especialmente entre niños de países en vía de desarrollo. Está caracterizado por numerosas y voluminosas deposiciones acuosas, con frecuencia acompañadas de vómito, que tienen como consecuencia shock hipovolémico y acidosis. Otros miembros de la especie pueden ocasionalmente causar brotes aislados de diarrea benigna mientras que otras la gran mayoría son de vida libre y no están asociadas con enfermedad. El agente causativo del cólera, Vibrio cholerae, es una bacteria Gram-negativa altamente móvil con un único flagelo polar que habita los ríos, estuarios u otros ambientes acuáticos. El cólera es prevalente en áreas donde el agua está contaminada con heces humanas porque es una enfermedad portada por el agua y las bacterias son generalmente transmitidas por medio de agua o alimentos contaminados. Después de la ingestión, los organismos colonizan el intestino delgado donde ellos elaboran la potente toxina colérica (CT, por Cholera Toxin ), que es, directamente responsable de la profusa diarrea característica de la enfermedad. Las bacterias son lanzadas en

24 grandes cantidades en las típicas deposiciones de agua de arroz dentro del ambiente, donde se pueden asociar con otros miembros del ecosistema hasta que son ingeridas de nuevo, completando así el ciclo de vida de este organismo. Cuando la bacteria del cólera libera la toxina CT, está activa la proteína G s (subunidad de la proteína G trimérica) en la membrana plasmática de las células epiteliales del revestimiento del intestino delgado. La toxina CT cambia químicamente la proteína G S de tal modo que ya no se puede apagar por si misma. Como resultado la proteína G S continua estimulando la enzima AC para que produzca camp a partir de ATP. La toxina CT, pertenece a una familia de toxinas AB, las cuales están compuestas de una subunidad toxigénica A y una subunidad adhesiva B. La toxina CT está compuesta de la subunidad enzimáticamente activa CTA y la subunidad CTB pentamérica, la cual se une al receptor monosialogangliosido-1 (GM1, por MonosialoGangliosido-1 ), sobre la membrana apical de las células epiteliales del intestino delgado. CTA está compuesta por dos cadenas CTA 1 y CTA 2, las cuales están unidas por un puente de disulfuro. CTA 1 es una ADP ribosil transferasa, responsable de la toxicidad celular en tanto que CTA 2 conecta la subunidad A con la subunidad B. Después de la unión de CT al ligando gangliosido GM1, la toxina CT entra a la célula por endocitosis. La toxina puede ser captada por endocitosis dependiente de clatrinas como también independiente de clatrinas y caveolas en diferentes tipos de células. La toxina CT es primero transportada a los endosomas tempranos, y luego viajan por medio de la vía de transporte retrógrado desde la red trans-golgi a través del aparato de Golgi, donde encuentra el receptor de retención de proteínas del RE KDEL (KDELR1, por KDEL [Lys-Asp-Glu-Leu] Endoplasmic Reticulum protein retention Receptor-1 ), también conocido en levaduras como ERD2, el cual es normalmente responsable de la recuperación de las proteínas luminales del RE que han escapado de su compartimiento residente. La cadena CTA 2 tiene una secuencia KDEL en su extremo C terminal, el cual es responsable del transporte retrogrado de la toxina al RE. Una vez en el lumen del RE, la cadena CTA1 activa la vía asociada a la degradación del RE (ERAD, por ER Associated Degradation ), provocando la respuesta para proteínas mal replegadas. El puente de disulfuro entre CTA 1 y CTA 2 es reducido por la chaperona proteína disulfuro isomerasa (PDI, por Protein Disulfide Isomerase ) que luego se une a CTA 1, despliega esta cadena monomérica y la libera dentro del lumen del RE. El complejo PDI-CTA 1 es transportado a la membrana plasmática en donde la enzima oxido reductina 1 del RE (ERO1L, por Endoplasmic Reticulum Oxidoreductin- 1 ) provoca la liberación de CTA 1 oxidando a PDI.

25 CTA 1 es transportada al citosol quizás a través del translocón Sec61, donde los sustratos ERAD son generalmente ubiquitinados y degradados por el proteosoma. La subunidad B permanece en el RE. Sin embargo CTA 1 escapa a la degradación por un mecanismo que aún no se conoce y se repliega nuevamente. No es probable que el replegamiento suceda espontáneamente y estudios recientes sugieren el factor 6 de ADP ribosilación (ARF6, por ADP Ribosylation Factor 6 ) actúa como una chaperona molecular para promover el cambio a la conformación nativa. La unión a ARF6 hace que CTA1 exponga su sitio activo y posibilita su actividad catalítica. Una vez apropiadamente replegada, CTA 1 unido a ARF6 es una ADP ribosiltransferasa activa que actúa sobre la subunidad G s usando NAD como cofactor ocasionando que G s pierda su actividad catalítica de (hidrolizar GTP a GDP + Pi), de forma tal que permanece activa más de lo normal. G s constitutivamente activa la enzima AC provocando un gran incremento en la concentración de camp de más de 100 veces de lo normal. El camp actuando como segundo mensajero activa a la enzima PKA, lo cual inhibe la absorción de sodio a través de los intercambiadores de sodio-hidrogeno (Na + /H + ) (NHE, por Sodium-Hydrogen Exchangers ) 2 y 3. PKA también activa por fosforilación el canal de cloro (Cl - ), regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR, por Cystic Fibrosis Conductance Regulator ) provocando un cambio conformacional en este canal iónico, de tal modo que se abra y permite que los iones Cl - fluyan bajo su gradiente químico. Las concentraciones extracelulares de Cl - incrementan debido a esta extrusión aniónica inducida, lo que provoca un desequilibrio quimiosmótico. Hay una consecuente salida de iones Na +, iones potasio (K + ), iones bicarbonato (HCO 3 - ) y otros electrolitos debido a los gradientes eléctricos causados por la pérdida de Cl - de los enterocitos y finalmente un incremento en la secreción de agua (H 2 O) desde los enterocitos al lumen del intestino delgado para compensar el cambio en la concentración extracelular de electrolitos. En conjunto esto da como resultado una masiva perdida de fluidos desde el intestino alcanzando hasta ml/h llevando a una grave deshidratación. El H 2 O y los electrolitos perdidos por las células mucosas son reemplazados a partir de la sangre para compensar los gradientes osmóticos y electrolitos. De modo que, las células dañadas por la toxina se convierten en bombas de agua y electrolitos causando diarrea, la perdida de electrolitos, la deshidratación y las deposiciones de agua de arroz que caracterizan al cólera (4).

26 Esta enfermedad es tratada reemplazado el agua y los electrolitos perdidos por medio de una intensa hidratación. Un rápido re emplazamiento intravenoso de los fluidos e iones perdidos. Después de lo cual le sigue la administración continua de soluciones isotónicas hasta que la diarrea cese. Ilustración 16. Cuando la señal no se detiene. CT, Toxina colérica; GM1, receptor monosialogangliosido-1; ERD2 (homólogo de KDELR1 (receptor de retención de proteínas del ER KDEL);ERAD, vía asociada a la degradación del ER; A1 (CTA1, cadena 1 de la subunidad A de la toxina colérica);, proteína G s (subunidad de la proteína G trimérica); ARF6, factor 6 de ADP ribosilación; AC, adenilato ciclasa; PKA, proteína quinasa A; CFTR, regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística; NHE 2/3, intercambiadores de sodio-hidrogeno 1 y 3.

27 La vía de transducción de señales de la insulina El páncreas es esencialmente una glándula exocrina, responsable de la secreción de una batería de enzimas digestivas. Pero dentro del páncreas yacen grupos de células endocrinas conocidos como islotes, o más formalmente, islotes de Langerhans. Dentro de estos islotes, las células designadas como alfa secretan la hormona llamada glucagón, y las células designadas como beta secretan insulina. El glucagón es un polipéptido que consta de una única cadena de 29 aminoácidos. Su principal papel es estimular células diana en el hígado y el músculo para que desdoblen las reservas de glucógeno hasta glucosa. La insulina con sus 51 aminoácidos tiene el efecto opuesto en la glucosa sanguínea -disminuye la glucosa sanguínea-. Las dos hormonas aisladas se complementan para conservar el delicado balance de la glucosa sanguínea. La función mejor conocida de la insulina es ayudar a mover glucosa a través de la membrana plasmática, pero también promueve la captación de glucosa, ácidos grasos y aminoácidos por el hígado, tejido adiposo y muscular, promoviendo la síntesis y el almacenamiento de estos nutrientes en la forma de glucógeno, lípidos y proteínas respectivamente. Por ejemplo, junto a la hormona del crecimiento, la insulina promueve la captación de aminoácidos y su incorporación hasta proteínas, en tanto que a la vez inhibe la conversión de aminoácidos a glucosa. La falla en la captación y el almacenamiento de estos nutrientes da como resultado diabetes. La diabetes tipo-1 se caracteriza por la incapacidad para sintetizar insulina, mientras que en la diabetes tipo-2 el cuerpo se hace resistente a los efectos de la insulina, presumiblemente debido a defectos en la vía de señalización de la insulina. El mecanismo de secreción de insulina es un ejemplo una vía de transducción de señales. La glucosa en el cuerpo incrementa después del consumo de alimento. Esto es principalmente debido a la ingesta de carbohidratos. La insulina es secretada en las células beta de los islotes de Langerhans. Antes de la secreción, la insulina es sintetizada. Una vez la insulina es sintetizada, las células beta están listas para liberarla in dos fases diferentes. En la primera fase, la liberación de insulina se dispara rápidamente cuando los niveles de glucosa sanguínea incrementan. La segunda fase, es una liberación lenta desde vesículas secretorias recién formadas que son estimuladas para secretar insulina independientemente del nivel de glucosa sanguíneo. Dependiendo del tipo de tejido, la glucosa entra a la célula a través de difusión pasiva o difusión facilitada. En el tejido muscular y adiposo, la glucosa entra a través de los

28 receptores de transporte de glucosa 4 (GLUT-4, por Glucose Transporter-4 ) por medio de difusión facilitada. En el cerebro, el riñón y la retina, la glucosa entra pasivamente. En las células beta del páncreas, la glucosa entra a través del receptor GLUT-2. El principal disparador de la secreción de insulina, la glucosa, es transportada dentro de las células beta por GLUT-2. Dentro de las células beta, la glucosa es convertida a glucosa 6 fosfato (G6P) a través de la enzima glucoquinasa y la G6P, es subsecuentemente metabolizada en la mitocondria hasta formar ATP. Esto incrementa la razón ATP: ADP, lo cual inhibe la permeabilidad de la membrana plasmática a los iones K +, cerrando los canales de K + regulados por ATP. Esto es seguido por una acumulación de K + dentro de las células beta, lo cual conduce a una despolarización de la membrana plasmática y a la abertura de los canales de Ca 2+. El subsecuente influjo de Ca 2+ con lleva a un incremento en la concentración del Ca 2+ citoplasmático libre. El Ca 2+ citosólico, actúa en varias formas para incrementar la velocidad de exocitosis de la insulina a partir de las vesículas secretorios almacenadores de insulina. El influjo de Ca 2+ estimula la fusión de las vesículas secretorias con la membrana plasmática y la secreción de insulina al fluido extracelular de las células beta, haciendo de esta forma que la insulina entre al torrente sanguíneo. El Ca 2+, también es requerido para la activación PKC y PKA, las cuales fosforilan proteínas específicas que son requeridas para la iniciación del proceso exocítico. El Ca 2+ es un cofactor para la activación del receptor acoplado a la enzima PLC. La activación de PLC conduce a la hidrólisis del fosfolípido de membrana PIP 2 hasta DAG e IP 3. El DAG activa a PKC, e IP 3 provoca la liberación de Ca 2+ a partir de los sitios de almacenamiento (es decir, desde el RE). Otra vía de señalización es la activación de AC, lo cual da como resultado un incremento intracelular en los niveles de camp, lo cual a la vez activa a PKA y a el intercambiador de proteínas directamente activada por camp (Epac, por Exchange proteins directly activated by camp ). PKA y PKC activan quinasas que son importantes en la exocitosis; esto se ilustra como flechas interrumpidas (Ilustración 36). Otra vía es inducida por el substrato 1 del receptor de insulina (IRS1, por Insulin Receptor Substrate 1 ), lo cual da como resultado la activación de la enzima fosfatidil inositol quinasa 3 (PI3K), provocando la formación de PIP3, lo cual activa los canales de K+. Los diferentes receptores acoplados a proteínas G (GPCRs, por G Protein-Coupled Receptors ) influencian las vías de señalización en las células beta, dependiendo de la proteína G que es activada (G q, G i o G s ). De modo que, G q activa PLC, mientras que G i inhibe y G s estimula la formación de camp.

29 Ilustración 17. Secreción de insulina por las células beta de los islotes de Langerhans. IRS, familia de receptores substratos de insulina; IGFI-1, factor de crecimiento semejante a insulin-1; GLUT-2, receptores de transporte de glucosa 2; PLC, fosfolipasa C; PIP 2, fosfatidil inositol 4, 5 bifosfato; DAG, diacilglicerol; IP 3, fosfatidil inositol-3, 4, 5- trifosfato; PKC, proteína quinasa C; AC, adenilato ciclasa; PKA, proteína quinasa A; camp, adenosina monofosfato cíclico; Epac; intercambiador de proteínas directamente activada por camp; IRS1, substrato 1 del receptor de insulina; PI3K, fosfatidil inositol quinasa 3; GPCRs, receptores acoplados a proteínas G; G q, proteína G acoplada a GPCR que activa a PLC; G i, proteína G acoplada a GPCR que inhibe AC; G s, proteína G acoplada a GPCR que estimula AC. Después de que la insulina entra al torrente sanguíneo, es captada por las células. Sin embargo, la insulina no entra a la célula. Para activar sus efectos, tiene que unirse a su receptor. El receptor de insulina está compuesto de dos subunidades alfa extracelulares y dos subunidades beta transmembrana mantenidas juntas por puentes de disulfuro. La unión de la insulina a la subunidad alfa induce un cambio

30 conformacional que da como resultado la auto fosforilación de un número de residuos de tirosina presentes en la subunidad beta. Estos residuos son reconocidos por los dominios de unión a fosfotirosina (PTB, por PhosphoTyrosine-Pinding domains ) de proteínas adaptadoras como los miembros de la familia de receptores substratos de insulina (IRS, por Insulin Receptor Substrate family ) La activación del receptor conduce a la fosforilación de residuos de tirosina claves sobre las proteínas IRS, algunos de los cuales son reconocidos por p85, la subunidad reguladora de la fosfatidil inositol quinasa 3 (PI-3K). Como consecuencia la subunidad catalítica de PI-3K, p110, fosforila al lípido de membrana PIP2 llevando a la formación de PIP3. La fosfatasa y homólogo de tensina delecionada sobre el cromosoma 10 (PTEN por, Phosphatase and TENsin homolog on chromosome 10 ) puede convertir PIP3 de nuevo a PIP2. El PIP3 activa a la proteína quinasa 1 dependiente de PIP3 (PDK1, por 3-Phosphoinositide Dependent protein Kinase-1 ). Un efector clave en la ruta de señalización es la proteína quinasa B (PKB por, Protein Kinase B, conocida también como AKT), que es reclutada a la membrana plasmática. La activación de AKT requiere que sea fosforilada por otras proteínas quinasas como PDK1 y otra quinasa que aún no se conoce. PDK1 también active por fosforilación a PKC lambda/iota (Por Protein Kinase C-λ/ζ ). La vía de señalización PI-3K es responsable de la distribución de glucosa para muchas funciones celulares importantes. Esta vía provoca directamente la translocación de las vesículas que contienen el receptor GLUT-4 a la membrana plasmática por medio de la activación de las quinasa AKT y PKC-λ/ζ, lo que permite la difusión pasiva de glucosa al citoplasma celular. Otra manera de regular la translocación de vesículas conteniendo GLUT-4 a la membrana plasmática es por medio de la proteína substrato de AKT de 160 kilo Daltons (AS160 por, Akt substrate of 160 kda ), esta proteína tiene seis sitios posibles de fosforilación, además tiene un dominio de proteína activadora de la GTPasa (GAP por, GTPase-Activating Protein ), lo que le posibilita unirse a una proteína Rab que aún no se ha identificado. Entonces el complejo AS160-Rab permanece unido cuando está desfosforilada. Cuando AS160 es fosforilada completamente por AKt y una quinasa que podría ser la proteína quinasa activada por adenosina monofosfato 5, (AMPK por, 5 Adenosine Monophosphate-activated Protein Kinase ), AS160 activa un factor intercambiador de nucleótidos de guanina (GEF, por Guanine Nucleotide- Exchange Factor ) que en presencia de GTP, cambia Rab-GDP a Rab-GTP, que coordina diversos procesos del trafico vesicular incluyendo la fusión de las vesículas que contienen GLU-4 con la membrana plasmática.

31 Al parecer se requieren de tanto AKt como de AMPK para activar a AS160. Cuando AS160 es fosforilada únicamente por AKt, no se activa completamente y no impulsa el mecanismo de trafico vesicular de GLUT-4 a la membrana plasmática inhibiendo la captación de glucosa. También se ha propuesto una vía de señalización alterna, en la cual la activación del receptor de insulina provoca el reclutamiento de las proteínas asociadas con los dominios SH2 y de homología a la pleckstrina (APS, por Adaptor proteins associated with Pleckstrin homology and SH2 domains ) y la proteína asociada a Cbl-c (CAP, por c-cbl-associated Protein ) a la vecindad del receptor lo, cual conduce a la fosforilación de la proteína adaptadora llamada linfoma c de línea de células B casitas, (c-cbl, por Casitas B-lineage Lymphoma c ). Después de la fosforilación el complejo c-cbl-cap se transloca a las balsas lipídicas en la membrana plasmática. Luego ccbl interactúa con la proteína adaptadora llamada regulador de una tirosina quinasa CT10 (CrkII, por CT10 regulator of a tyrosine kinase II ), la cual está constitutivamente asociada al factor liberador de nucleótidos de guanina de unión al dominio SH3 de Crk (C3G, por Crk SH3-binding Guanine nucleotide-releasing factor ), un factor intercambiador de nucleótidos de guanina de la familia Rho, que a su vez activa a la GTPasa llamada virus tumoral de pollo 10 (TC10, por Tumoral Chicken 10 ) un miembro de la familia de unión a GTP. La activación de TC10 por medio del complejo TC10 vía CAP-Cbl-CrkII incide en la dinámica de polimerización de la actina y promueve la translocación de las vesículas conteniendo GLUT-4 a la membrana plasmática a través de la activación de una molécula adaptadora todavía desconocida. Sin embargo, las vías PI3K y TC10 podrían no ser tan independientes como originalmente se propuso, ya que ccbl puede conducir a PKC-λ/ζ por medio de PI3K en forma paralela a la activación de PKC-λ/ζ por la ruta convencional IRS PI3K. Curiosamente TC10 puede afectar la translocación de GLUT-4 independientemente de su actividad GTPasa activada por Cbl-CrkII. Terminación de la vía de transducción de señales de la insulina Cuando los niveles de glucosa sanguíneos caen es necesario termina la señal mediada por la insulina inactivando o deteniendo la ruta de señalización. Esto se logra inactivando el receptor por medio la proteína tirosina fosfatasa 1B (PTP1B, por Protein Tyrosine Phosphatase 1B ) que promueve la desfosforilación de residuos de tirosina de la subunidades beta del receptor de insulina. La terminación de la vía de señalización de la insulina también se logra por la internalización del complejo insulina-receptor de insulina en endosomas y degradación de la insulina por las enzimas degradadoras de insulina (IDE, por Insulin Degrading Enzyme ). Igualmente son importantes en la

32 atenuación de la señalización mediada por PIP 3, las fosfatasas PTEN y la inositol fosfatasa que contiene dominios de homología Src (SHIP2, por Src Homology 2 containing Inositol-Phosphatase ) que degradan el PIP 3 cortándolo por el enlace fosfodiester 3 y 5 respectivamente liberando Pi y convirtiéndolo en PIP 2 terminado la señal mediada por PI3K y Akt (5). (Ilustración 37) La vía de transducción de señales del glucagón y la epinefrina El glucagón y la epinefrina provocan la hidrólisis del glucógeno. La actividad muscular o su anticipación conducen a la liberación de la epinefrina (adrenalina), una catecolamina derivada de la tirosina producida en la medula de la glándula adrenal. La epinefrina estimula notablemente la hidrólisis de glicógeno en las células musculares y en una menor medida en el las células hepáticas. Estas células son más sensibles al glucagón. Cuando los niveles de glucosa son bajos, el páncreas secreta glucagón, lo cual a la vez provoca que las células hepáticas conviertan las reservas del polisacárido glicógeno a monómeros de glucosa, lo cual provoca la liberación de glucosa a la sangre. Este proceso es llamado glicogenolisis. Cuando estas reservas se reducen, el glucagón estimula a las células hepáticas y a las células renales para que sinteticen más glucosa por gluconeogénesis. El glucagón provoca la desactivación de la glucolisis en las células hepáticas, causando que los intermediarios glicolíticos sean enviados a la gluconeogénesis. Las moléculas de señalización epinefrina y glucagón se unen a receptores de siete dominios transmembrana específicos en la membrana plasmática de las células musculares y hepáticas respectivamente. La epinefrina se une a los receptores adrenérgicos en las células musculares, mientras que el glucagón se une a los receptores de glucagón. Los cuales son receptores acoplados a proteínas G, localizadas en la membrana plasmática.

33 Ilustración 18. Vía de transducción de señales de la insulina IRS, familia de receptores substratos de insulina; PI-3K, fosfatidil inositol quinasa 3; p85, la subunidad reguladora de PI-3K; p110, subunidad catalítica de PI-3K; PIP 2, fosfatidil inositol 4, 5 bifosfato; IP 3, fosfatidil inositol-3, 4, 5- trifosfato; PTEN; fosfatasa y homólogo de tensina delecionada sobre el cromosoma 10; PDK, proteína quinasa 1 dependiente de PIP 3 ; AKT (PKB, proteína quinasa B); PKC-λ/ζ, proteína quinasa C; GLUT-4, receptores de transporte de glucosa 4; APS, proteínas asociadas con los dominios SH2 y de homología a la pleckstrina; CAP, proteína asociada a Cbl-c; Cbl, linfoma c de línea de células B casitas; CrkII, regulador de una tirosina quinasa CT10; C3G, factor liberador de nucleótidos de guanina de unión al dominio SH3 de Crk; virus tumoral de pollo 10; PTP1B, proteína tirosina fosfatasa 1B; IDE, enzima degradadora de insulina; SHIP2, inositol fosfatasa que contiene dominios de homología Src. ERC, compartimientos de re ciclación endosómicos; TGN, red trans-golgi; SC, compartimientos especializados; VAMP2, proteína 2 de membrana asociada a vesícula.

34 La unión de estos ligandos, induce un cambio conformacional en el receptor de modo tal que activa a la proteína G, una proteína heterotrimérica con subunidades, y. Cuando la proteína G interactúa con el receptor, sufre un cambio conformacional que da como resultado la sustitución de la molécula de GDP que está unida a la subunidad con la molécula de GTP. Esta sustitución provoca la liberación de la subunidad de la subunidad y la subunidad. La subunidad activa específicamente a la siguiente enzima en la cascada, la AC una proteína transmembrana que cataliza la formación del segundo mensajero camp a partir de ATP. Los niveles citosólicos elevados de camp activan a la enzima PKA dependiente de camp. La forma inactiva de la PKA, es un tetrámero constituido por dos subunidades catalíticas y dos subunidades reguladoras. El camp se une a las subunidades reguladoras provocando su disociación de las subunidades catalíticas. Luego, las subunidades catalíticas libres son enzimáticamente activas y capaces de fosforilar residuos de serina de sus proteínas diana. Una vez activa PKA fosforila la subunidad de la fosforil quinasa (PhK, por Phosphorylase kinase ). Por su parte, la epinefrina también puede provocar la degradación del glucógeno en el hígado. Sin embargo, además de unirse a los receptores adrenérgicos, se une también a receptores adrenérgicos de siete dominios transmembrana de las células hepáticas lo cual activa a la enzima PLC por medio de las proteínas G ( q ). La activación de PLC conduce a la hidrólisis del fosfolípido de membrana PIP 2 hasta DAG e IP 3. El IP 3 induce la liberación de Ca 2+ desde las reservas del RE. La subunidad de PhK es la calmodulina y la unión de cuatro iones Ca 2+ conlleva a la activación parcial de PhK. Una vez activa la enzima PhK, tanto en células musculares como hepáticas fosforila a la enzima glicógeno fosforilasa b (por glycogen phosphorylase b ), convirtiéndola a la forma activa llamada glicógeno fosforilasa a (por glycogenphosphorylase a ). La glicógeno fosforilasa a es la enzima responsable de liberar la glucosa 1 fosfato (por glucose-1-phosphate ) a partir del polisacárido glicógeno. La glucógeno fosforilasa a rompe el enlace 1-4 glicosídico en el extremo de la molécula de glucagón, liberando una molécula de glucosa como glucosa 1 fosfato (glucosa 1-p). Con el fin de que esta pueda ser usada en el metabolismo debe ser convertida a glucosa 6 fosfato (glucosa 6- p) por la fosfoglucomutasa (6).

35 Ilustración 19. La vía de transducción de señales del glucagón y la epinefrina.,,, subunidades de la proteína G heterotrimérica; AC, adenilato ciclasa; camp, Adenosina monofosfato cíclico; PKA, proteína quinasa A; PhK, fosforil quinasa; PLC, fosfolipasa C; PIP 2, fosfatidil inositol 4, 5 bifosfato; DAG, diacilglicerol; IP 3, fosfatidil inositol-3, 4, 5- trifosfato; calmudulina (subunidad de PhK); ER, retículo endoplásmico; PDE, fosfodiesterasa; PP1, proteína fosfatasa 1. Adicionalmente, el control coordinado de la glucolisis y la gluconeogénesis en las células hepáticas es ajustado por el estado de fosforilación de las enzimas que catalizan la formación de un potente activador de la glucolisis llamado fructuosa 2, 6 bifosfato (por Fructose-2,6-Bisphosphate ). La enzima FBPase-2/ PKF-2 bifuncional que contiendo tanto la enzima fructuosa 2, 6 bifosfatasa (FBPase-2, por Fructose-2,6-BisphosPhatase ) como a la fosfofructoquinasa 2 (PKF-2, por PhosphoFructoKinase-2 ), puede actuar de tal modo que favorezcan la vía glicolítica o la gluconeogénesis. Cuando PKF-2 está activa (es decir no está fosforilada y FBPase-2 esta inactiva), convierte la fructosa 6- fosfato a fructosa 2, 6 bifosfato. Los niveles elevados de fructuosa 2, 6 bifosfato regulan positivamente a la enzima fosfofructoquinasa 1 (PKF-1, por PhosphoFructoKinase-1 ) que es la enzima que convierte la fructuosa 6 fosfato a fructuosa 1, 6 bifosfato y que

36 además, es el paso regulatorio principal de la glucolisis con lo cual se favorece la vía glicolítica. La enzima PKA que fue estimulada por la cascada iniciada por el glucagón también puede fosforilar covalentemente un único residuo de serina de la cadena polipeptídica de PKF-2, con lo cual esta subunidad catalítica se inactiva y se activa la subunidad FBPase-2. Una vez activa FBPase-2 hidroliza a la fructuosa 2, 6 bifosfato convirtiéndola en fructuosa 6 fosfato. Los niveles disminuidos de fructuosa 2, 6 bifosfato regulan en forma negativa a la enzima PKF-1 con lo cual disminuye la velocidad de conversión de la fructuosa 6 fosfato a fructuosa 1, 6 bifosfato. Del mismo modo, la disminución en los niveles de fructuosa 2, 6 bifosfato regulan positivamente la actividad de enzima fructosa 1, 6 bifosfatasa (FBPase-1, por Fructose-1,6-BisphosPhatase ), también conocida como bifosfatasa 1. La enzima FBPase-1 convierte la fructosa 1, 6 bifosfato a fructosa 6 fosfato. La doble inhibición de la formación de la fructuosa 1, 6 bifosfato y los niveles incrementados de fructuosa 6 fosfato detienen la vía glicolítica y permiten que la gluconeogénesis predomine (7). Este proceso es reversible en la ausencia de glucagón (y por tanto en presencia de insulina). La activación de la PKA mediada por el glucagón también inactiva por fosforilación la enzima glicógeno sintetiza de la vía de glicogénesis y la enzima piruvato quinasa (por pyruvate kinase ) de la vía glicolítica favoreciendo igualmente la liberación de glucosa. En este caso, la fosforilación inhibe la actividad enzimática y por lo tanto el incremento del camp y la activación de la PKA bloquea la síntesis de glucógeno a la vez que activa su hidrólisis (6). La doble estimulación tanto por glucagón como por la epinefrina provoca una gran movilización de glicógeno por las células hepáticas.

37 Ilustración 20. Activación de la glicogenolisis por medio de la enzima bifuncional FBPase-2/ PKF-2.,,, Subunidades de la proteína G heterotrimérica; AC, adenilato ciclasa; camp, Adenosina monofosfato cíclico; PKA, proteína quinasa A; FBPase-2, fructuosa 2, 6 bifosfatasa; PKF-2, fosfofructoquinasa 2; PKF-1, fosfofructoquinasa 1; FBPase-1, enzima fructosa 1, 6 bifosfatasa; PDE, fosfodiesterasa; PP1, proteína fosfatasa 1. Terminación de la vía de transducción de señales del glucagón y la epinefrina Debe haber una manera de detener rápidamente el sistema de alta demanda de hidrólisis de glicógeno para evitar el agotamiento despilfarrador de glicógeno después de que las necesidades energéticas se han satisfecho. Son otras enzimas que detienen la ruta de señalización y conducen a la desfosforilación y a la inactivación de la PhK y de la glicógeno fosforilasa. Con la activación simultanea de la síntesis de glicógeno. La vía de transducción de señales que conduce a la activación de la glucógeno fosforilasa, se detiene por el proceso ya descrito para las vías que emplean proteínas G