TEMA 27: Recuento celular: fundamento, técnica y aplicaciones

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1 PROCEDIMIENTOS DIAGNÓSTICOS Recuento celular 1 TEMA 27: Recuento celular: fundamento, técnica y aplicaciones Esquema: REV.: 10/09 info@preparadores.eu Web: 1. Concepto 2. Recuentos en cámara 2.1. Material necesario 2.2. Reactivos 2.3. Muestra 2.4. Limpieza del material 3. Recuentos en contadores electrónicos 3.1. Componentes de que consta un contador electrónico 3.2. Métodos electrónicos de recuento celular Método de la resistencia eléctrica o de la impedancia Métodos de la dispersión de la luz o de la difracción 3.3. Parámetros que determina un contador electrónico 4. Técnicas de recuento manuales 4.1 Recuento de hematíes 4.2 Recuento de reticulocitos 4.3 Recuento de leucocitos 5. Conclusiones 6. Bibliografía 1. CONCEPTO Los recuentos celulares son una serie de procedimientos que tienen por objeto determinar el número de cada uno de los tipos celulares que están comprendidos en una unidad de volumen de sangre (generalmente, en 1 mm 3 ). Todos los recuentos celulares constan de 3 fases: 1ª Dilución de la sangre. 2ª Cómputo del número de células. 3ª Cálculo matemático del número de células presentes en 1 mm 3 de sangre. Los recuentos celulares pueden realizarse mediante métodos manuales (recuentos en cámara) o automáticos (recuentos en contadores electrónicos).

2 PROCEDIMIENTOS DIAGNÓSTICOS Recuento celular 2 2. RECUENTOS EN CÁMARA 2.1. Material necesario Cámara de recuento También se llama cámara cuentaglóbulos o hemocitómetro. Consiste en una placa gruesa de cristal con forma de porta, cuya porción central está dividida en 3 bandas perpendiculares al eje longitudinal de la cámara. De ellas, las dos laterales se hallan sobreelevadas 0,1 mm con respecto a la central, y en esta última hay grabado un retículo cuadrangular. La banda central puede estar, a su vez, subdividida en 2 semibandas idénticas y separadas por un surco paralelo al eje longitudinal de la banda. En cada una de estas dos semibandas hay grabado un retículo idéntico (véase figura 1). Figura 1. Cámaras de recuento. A = Visión superior (cámara con un retículo). B = Visión superior (cámara con dos retículos). C = Visión lateral. Hay varios tipos de retículos, de los cuales los más utilizados son el de Bürker, el de Thoma, y sobre todo el de Neubauer (véase figura 2).

3 PROCEDIMIENTOS DIAGNÓSTICOS Recuento celular 3 Figura 2. Cuadrados de los distintos tipos de retículos de recuento. A = Cuadrado grande. B = Cuadrado mediano. C = Cuadrado pequeño. Cubreobjetos Preferiblemente, debe ser algo más grueso que los normalmente utilizados. Se coloca de forma que apoye sobre las dos bandas laterales de la porción central de la cámara. De esta manera queda delimitado un espacio entre la banda central y el cubre, en el que se deposita la muestra y cuyo espesor es de 0,1 mm. Algunas cámaras también constan de dos pinzas especiales que parten, cada una, de una de las porciones laterales de la cámara y que tienen por misión la de asegurar la fijación del cubre a la misma. Cuando está bien montado sobre la cámara, se observan unas irisaciones de colores entre las dos láminas de vidrio llamadas anillos de Newton. Pipetas diluidoras de Thoma Son unas pipetas especiales de cristal que constan de un largo tubo capilar graduado y de una dilatación ampular o bulbo. El tubo capilar termina en punta, a nivel de uno de sus extremos, y se continúa con el bulbo, a nivel del otro de sus extremos. Además, está

4 PROCEDIMIENTOS DIAGNÓSTICOS Recuento celular 4 dividido en 10 partes iguales, y en su superficie están especialmente bien marcadas la 5ª división (con un 0,5) y la 10ª (con un 1). El bulbo contiene una perla de vidrio para facilitar la mezcla de la sangre con el líquido de dilución, y acaba en un tubo capilar corto. La perla de vidrio es roja en las pipetas empleadas para el recuento de hematíes, y blanca en las usadas para el recuento de leucocitos. Además, en las pipetas para hematíes la capacidad del bulbo es 100 veces superior a la del tubo capilar largo, por lo que en el tubo capilar corto hay una marca de 101, y en las pipetas para leucocitos la capacidad del bulbo es 10 veces mayor que la del tubo capilar largo, por lo que en el tubo capilar corto hay una marca de 11. Goma de aspiración Es un tubo de goma que permite la aspiración de la muestra y del líquido de dilución. En uno de sus extremos tiene encajada una boquilla, y por el otro se ensambla al tubo capilar corto de cualquiera de las pipetas de Thoma (véase figura 3). Figura 3. Pipetas diluidoras: A = pipeta para recuento de glóbulos rojos. B = pipeta para recuento de glóbulos blancos Reactivos Líquido de dilución Hay varias clases. Su composición varía según el tipo de células que se pretende contar. Los que se utilizan para el recuento de hematíes contienen cloruro sódico para hacerlos isotónicos con respecto al plasma y evitar, de esta forma, la hemólisis. Pero algunos incorporan también anticoagulantes como el citrato de sodio, e incluso antisépticos como la formalina.

5 PROCEDIMIENTOS DIAGNÓSTICOS Recuento celular 5 Los que se emplean para el recuento de leucocitos contienen una sustancia, como el ácido acético glacial, que rompe los hematíes y un colorante, como el violeta de genciana, que tiñe el núcleo de los leucocitos. Los que se usan para el recuento de plaquetas pueden incorporar una sustancia hemolítica y un antiagregante plaquetario. Los líquidos diluyentes más utilizados son el de Hayem, para el recuento de hematíes, y el de Türck, para el recuento de leucocitos Muestra Sangre capilar o venosa anticoagulada con EDTA. Esta sangre se utilizará convenientemente diluida Limpieza del material Limpieza de la cámara de recuento Tras su uso, ha de ser aclarada con agua tibia y posteriormente debe secarse con un paño suave y limpio o dejándola al aire. Limpieza de las pipetas diluidoras Después de su empleo, tienen que lavarse interiormente de la siguiente forma: Primero, haciendo pasar a través de ellas agua corriente, una vez. Luego, haciendo pasar a través de ellas agua destilada, 3 veces. Y, finalmente, haciendo pasar a través de ellas acetona o alcohol de 95º, una vez. Tras ello, ha de secarse su interior, preferentemente mediante un secador de aire o en estufa. 3. RECUENTOS EN CONTADORES ELECTRÓNICOS 3.1. Componentes de que consta un contador electrónico Diluidor Disminuye la concentración de la sangre hasta el nivel adecuado para el funcionamiento del contador (generalmente diluye a 1/500 para el recuento de leucocitos, y a 1/ para el de hematíes). Como líquido diluyente utiliza una solución isotónica con capacidad conductora.

6 PROCEDIMIENTOS DIAGNÓSTICOS Recuento celular 6 Compresor-aspirador Aporta la presión y el vacío necesarios para transportar la sangre, convenientemente diluida, al dispositivo de medida. Dispositivo de medida Es la cámara donde se cuentan realmente las células sanguíneas. Su diseño depende del método de recuento utilizado por cada modelo de contador. Transductor Transforma las señales, procedentes del dispositivo de medida, en impulsos eléctricos. Suele ser un fotomultiplicador. Discriminador Diferencia los impulsos eléctricos generados por cada uno de los tipos de células sanguíneas. Lector Recoge los datos obtenidos, los procesa y los proyecta en una pantalla. Registrador Imprime en papel los resultados conseguidos Métodos electrónicos de recuento celular Método de la resistencia o de la impedancia Es el utilizado por los primeros contadores, ya que fue descubierto por Coulter en Se basa en lo siguiente: Mientras que las células sanguíneas conducen mal la electricidad, el líquido diluyente es un buen conductor de la electricidad (posee una gran conductividad eléctrica). El dispositivo de medida consiste en un pequeño orificio, a través del cual se hace pasar la sangre diluida. Tiene colocados un electrodo a su entrada y otro a su salida. También se hace pasar una corriente eléctrica constante a través de ese mismo orificio.

7 PROCEDIMIENTOS DIAGNÓSTICOS Recuento celular 7 Si el orificio es atravesado solamente por líquido diluyente, la resistencia eléctrica medida por los electrodos es mínima y constante, pero cuando el orificio es atravesado por una célula sanguínea, se produce un aumento de la resistencia eléctrica y un cambio de potencial entre los electrodos. El número de señales eléctricas generadas indica el número de células presentes en la sangre y la amplitud de estas señales es directamente proporcional al volumen celular (véase figura 4). Figura 4. Esquema de dispositivo de medida basado en la medida de la impedancia Métodos de la dispersión de la luz o de la difracción Método del campo oscuro El dispositivo de medida consiste en un capilar por el que circula la sangre diluida y que es atravesado por un haz de luz halógena. Cuando no pasan células a lo largo del capilar, el haz de luz incide sobre una zona no sensible (disco de campo oscuro); pero si una célula pasa a través del capilar, dispersa los rayos del haz luminoso hacia afuera del disco, donde son captados por un fotodetector. El número de señales lumínicas detectado indica el número de células presentes en la sangre, y la intensidad de la dispersión lumínica producida por cada una de ellas es directamente proporcional al tamaño de éstas (véase figura 5).

8 PROCEDIMIENTOS DIAGNÓSTICOS Recuento celular 8 Figura 5. Esquema del dispositivo de medida basado en el método del campo oscuro. Método del rayo láser El dispositivo de medida consta de un detector situado detrás de un capilar por el que circula un flujo continuo de sangre diluida; es pues un citómetro de flujo. Un rayo láser atraviesa el capilar y se dirige hacia el detector. Cuando no pasan células a lo largo del capilar, el rayo láser incide sobre el detector, pero si una célula pasa a través del capilar, el rayo láser es interceptado por ella y deja de incidir sobre el detector. El número de interferencias indica el número de células presentes en la sangre, y el grado de interferencia que produce cada célula a su paso es directamente proporcional a su tamaño. En este método se basan, por ejemplo, los autoanalizadores Technicon de la serie H (véase figura 6). Figura 6. Esquema del dispositivo de medida basado en el método del rayo láser.

9 PROCEDIMIENTOS DIAGNÓSTICOS Recuento celular Parámetros que determina un contador electrónico Los contadores electrónicos pueden llegar a determinar los siguientes parámetros: Número de hematíes por mm 3 de sangre. Número de leucocitos por mm 3 de sangre. Número de plaquetas por mm 3 de sangre. Valor hematocrito. Concentración de Hb en la sangre. Índices hematimétricos. Fórmula leucocitaria. Para el recuento de leucocitos es necesaria una lisis previa de los hematíes mediante sustancias tensioactivas (detergentes). Para el recuento de plaquetas es necesaria la separación de los hematíes, por ejemplo, mediante centrifugación. La concentración de la Hb se mide colorimétricamente con el método de la cianmetahemoglobina. Los índices hematimétricos pueden ser calculados electrónicamente. Los autoanalizadores Technicon de la serie H determinan la fórmula leucocitaria mediante el estudio de los leucocitos bajo dos aspectos: El aspecto morfológico de su núcleo, mediante su análisis con técnicas de difracción luminosa, es decir, por la desviación o descomposicón del rayo luminoso al incidir sobre él. Su actividad biológica, mediante la cuantificación del contenido en peroxidasa de su citoplasma (véase figura 7).

10 PROCEDIMIENTOS DIAGNÓSTICOS Recuento celular 10 Figura 7. Esquema de un automatizador hematológico. 4. TÉCNICAS DE RECUENTO MANUALES 4.1 Recuento de Hematíes El recuento de hematíes o RBC (Red Blood Count) consiste en la determinación del número de eritrocitos presentes en un volumen determinado de sangre (generalmente, en 1 mm 3 o µl). Para el recuento de glóbulos rojos en cámara, se diluye la sangre problema en un líquido apropiado y con la pipeta de Thoma para hematíes. Posteriormente se deposita en la cámara de recuento, donde se cuentan las células presentes en algunos cuadrados de uno de los retículos. Reactivos Líquido de dilución. Éste debe ser isotónico con el plasma, para evitar la alteración morfológica e incluso la lisis de los hematíes. El más utilizado es el de Hayem, que se compone de las siguientes sustancias: - 2,5 g de sulfato sódico. - 0,5 g de cloruro sódico. - 0,25 g de cloruro mercúrico.

11 PROCEDIMIENTOS DIAGNÓSTICOS Recuento celular ml de agua destilada. Si contiene precipitados, antes de usarlo debe ser filtrado. Muestra Sangre capilar obtenida por punción del pulpejo de un dedo o sangre venosa procedente de una punción venosa y anticoagulada con EDTA. Técnica 1º. Situar un cubre sobre el retículo de la cámara. Para facilitar su adhesión a ésta, se ejerce una ligera presión al tiempo que se desliza el cubre sobre las bandas laterales, previamente humedecidas con H 2 O, de su porción central. 2º. Aspirar la sangre hasta la señal de 0,5 (si se cree que puede haber una policitemia) o hasta la de 1 (si se piensa que puede existir una anemia). En el caso de que se sobrepase algo el enrase, se hace descender la columna de sangre tocando la punta de la pipeta con un algodón. 3º. Limpiar cuidadosamente el exterior de la pipeta con un algodón y sin hacer bajar el nivel de sangre. 4º. Aspirar líquido diluyente hasta la señal º. Desenganchar el tubo de goma de la pipeta y homogeneizar el contenido del bulbo. Para ello se sujeta la pipeta por sus extremos, con los dedos pulgar e índice, y se agita suavemente en sentido horizontal durante 2 ó 3 minutos. 6º. Desechar las 3 primeras gotas emitidas por la pipeta. 7º. Depositar la siguiente gota entre la cámara y el cubre. Esto se realiza ubicándola en uno de los bordes no adheridos del cubre y dejándola que penetre por capilaridad, en el espacio existente entre ambas estructuras. Durante esta operación hay que evitar que se formen burbujas y que rebose la sangre diluida por fuera de los bordes del cubre. Para ello se coloca la pipeta en posición casi vertical, se sitúa la punta de la pipeta en el borde apropiado, se disminuye algo la presión ejercida por el dedo índice sobre el otro extremo de la pipeta y se retira ésta justo antes de que se llene completamente el espacio comprendido entre el cubre y la cámara. 8º. Dejar reposar la sangre diluida, contenida en la cámara, durante unos minutos, para que las células presentes en ella puedan sedimentarse.

12 PROCEDIMIENTOS DIAGNÓSTICOS Recuento celular 12 9º. Enfocar el retículo con el objetivo de 40 x y con el condensador a baja altura, y verificar que la distribución de los hematíes es homogénea. 10º. Contar los hematíes presentes en 80 cuadrados pequeños del cuadrado grande central. Esto se logra, por ejemplo, contando los hematíes que hay en los 4 cuadrados medianos de las esquinas y en el del centro (véase figura 8). Figura 8. Forma de hacer un recuento en cámara de hematíes. Para evitar contar repetidamente los mismos hematíes, sólo se cuentan los que están contenidos dentro del cuadrado y los que están en contacto con sus líneas de demarcación superior o derecha (véase

13 PROCEDIMIENTOS DIAGNÓSTICOS Recuento celular 13 figura 9). Figura 9. Forma correcta de contar los hematíes contenidos en un cuadrado pequeño (los hematíes rayados se cuentan y los no rayados no se cuentan). A la hora de observar los cuadrados, se sigue un orden en zig-zag (véase figura 10). Figura 10. Orden que se debe seguir a la hora de observar los cuadrados pequeños de un cuadrado mediano. Lectura de resultados Como se cuentan los hematíes presentes en 5 cuadrados medianos del cuadrado grande central, y éste tiene 25 cuadrados medianos, hay que multiplicar por 5 la cifra obtenida en el recuento, para calcular el número de hematíes que hay en un cuadrado grande. Como la longitud de cada uno de los lados del cuadrado grande central es de 1 mm, y la longitud del espacio comprendido entre éste y el cubre es de 0,1 mm, hay que multiplicar por 10 el resultado anterior, para determinar así el número de hematíes existentes, no en 0,1 mm 3, sino en 1 mm 3. Como la sangre, previamente al recuento propiamente dicho, se diluye,

14 PROCEDIMIENTOS DIAGNÓSTICOS Recuento celular 14 hay que multiplicar el resultado anterior por 100, si se ha partido de la sangre entera contenida hasta el enrase de 1, o por 200, si se ha partido de la sangre entera contenida hasta el enrase de 0,5 (para calcular las diluciones realizadas, no se tiene en cuenta el líquido contenido en el tubo capilar largo de la pipeta diluidora, pues se considera que éste no se mezcla con el resto a nivel del bulbo). En definitiva, para su cálculo puede emplearse la siguiente fórmula: RBC = H x 5 x 10 x D. RBC = recuento de hematíes (número de hematíes por mm 3 de sangre) H = hematíes contados en 5 cuadrados medianos D = factor de dilución (100 ó 200) El margen de error de esta técnica es alto (un ± 20%). Interpretación clínica de los resultados obtenidos La disminución del RBC se produce en las anemias. Y su aumento se da en las policitemias. Se considera normal un RBC comprendido entre los 4 y los 5,5 millones/mm 3 en las mujeres, y entre los 4,5 y los 6 millones/mm 3 en los varones Recuento de Reticulocitos Los reticulocitos son eritrocitos inmaduros que contienen, como su nombre indica, un retículo o red cromatínica formada por restos de ARN (ribosomas), mitocondrias y otros órganos celulares. Tienen un tamaño de 7 a 10 μm de diámetro. Permanecen en médula ósea unos 2 o 3 días y después salen a sangre periférica, donde terminan el proceso de maduración en unas 24 horas. Su cantidad en sangre periférica es un reflejo de la actividad eritropoyética medular. Podemos observar los reticulocitos al microscopio óptico mediante la tinción con colorantes vitales, azul de metileno nuevo o azul de cresil brillante. Estos colorantes dan lugar a la precipitación de los restos de ARN, y se observan como filamentos de color azul intenso en el interior de la célula. Según el grado de maduración que posea el reticulocito presentará un modelo de retículo distinto, de ovillo denso en el caso de los más inmaduros o de gránulos escasos para los más maduros. Se pueden

15 PROCEDIMIENTOS DIAGNÓSTICOS Recuento celular 15 clasificar en cuatro grupos distintos tal como se observa en la figura 11. Figura 11. Grados de maduración del reticulocito. Reactivos Azul de cresil brillante en polvo Solución salina al 0,9% Citrato sódico al 3% Agua destilada Aceite de inmersión Muestra Sangre anticoagulada con EDTA. Debido a que los reticulocitos también maduran in vitro, es aconsejable que la sangre utilizada se haya extraído recientemente, como máximo 6 horas antes de su análisis. Técnica 1. Preparación del colorante: Mezclamos 80 ml de solución salina y 20 ml de citrato sódico al 3%. Pesamos 1 g de azul de cresil brillante y lo disolvemos en la mezcla anterior. Filtramos antes de usarlo. 2. Tinción de los reticulocitos: Es una tinción supravital, es decir, se hace mientras las células aún están vivas. Para ello echamos 3 gotas de la solución colorante en un tubo de hemólisis y otras 3 gotas de sangre total previamente homogeneizada.

16 PROCEDIMIENTOS DIAGNÓSTICOS Recuento celular 16 Mezclamos suavemente y tapamos con papel parafilm. Introducimos en el baño maría a 37º C durante 5 minutos. Pasado este tiempo volvemos a homogeneizar y tomamos una gota de la suspensión para depositarla en un porta. Realizamos una extensión y dejamos secar al aire. Lectura de resultados Con una gota de aceite de inmersión observamos la extensión con el objetivo de 100 x. Los hematíes se habrán teñido de color verde amarillento y los reticulocitos se diferencian porque presentan en su interior unos hilos finos de color azul. Se deben contar hematíes en total, y el cálculo del porcentaje de reticulocitos es el siguiente: % reticulocitos = Nº de reticulocitos contados x 100 Nº de hematíes contados Para descartar errores en la técnica, debemos realizar dos extensiones y hacer el recuento en ambas, de manera que la diferencia entre ellas sea igual o menor a 5 reticulocitos. El resultado final es la media de los dos porcentajes obtenidos. Interpretación clínica de los resultados obtenidos En adultos y niños los valores normales están entre 0,5 y 1,5%. Se produce reticulopenia o disminución en la cifra de reticulocitos, en casos de aplasia medular, anemia ferropénica, anemia megaloblástica y anemias que cursan con dificultad en la eritropoyesis. Por el contrario, hay reticulocitosis en anemias hemolíticas y posthemorrágicas, donde se aumenta el nivel de producción de hematíes para contrarrestar su pérdida. La cantidad de reticulocitos expresada en tanto por ciento es un valor relativo referido a una cifra normal de hematíes. Por ello, cuando existe una anemia con disminución en la cantidad de hematíes se compensa con un aumento en el número de reticulocitos y debemos corregir su valor en tanto por ciento para poder considerarlo real. La corrección se hace en base al valor hematocrito (HCT) del paciente, y se calcula de la siguiente forma:

17 PROCEDIMIENTOS DIAGNÓSTICOS Recuento celular 17 % de reticulocitos corregido = % reticulocitos x HCT. paciente HCT. normal Si existe una anemia muy intensa, aparece en sangre periférica un número de reticulocitos mayor del que correspondería por regeneración eritroblástica. Esto se debe a que el estímulo eritropoyético compensador va acompañado de un período de maduración intramedular más corto y una etapa de maduración en sangre periférica más larga. Esto se conoce como desviación reticulocitaria y se observa en el frotis por la aparición de hematíes grandes con un color azulado (macrocitos policromáticos). Para evitar pensar que hay una capacidad regenerativa medular intensa se debe hacer una segunda corrección del % de reticulocitos en función de los días que tarda en madurar el reticulocito en sangre periférica, y a esto se le llama índice de producción reticulocitaria (IPR). Se obtiene con la siguiente fórmula: IPR = % reticulocitos corregido días de maduración en sangre periférica Los días que tarda en madurar el reticulocito están reflejados en la siguiente tabla, cuyos valores se han obtenido experimentalmente. El IPR nos da un valor numérico de la estimulación hematopoyética por encima de la actividad de la línea base normal. Un IPR mayor de 3 nos indica un aumento de la actividad eritropoyética medular, mientras que un IPR menor de 2 indica una escasa actividad eritropoyética.

18 PROCEDIMIENTOS DIAGNÓSTICOS Recuento celular Recuento de Leucocitos (WBC) El recuento de leucocitos (WBC) consiste en la determinación del número de leucocitos presentes en un volumen determinado de sangre (generalmente en 1 mm 3 ). Para el recuento de glóbulos blancos en cámara, se diluye la sangre problema en un líquido apropiado y con la pipeta de Thoma para leucocitos. Posteriormente se deposita en la cámara de recuento, donde se cuentan las células presentes en algunos cuadrados de uno de los retículos. Reactivos El líquido de dilución más utilizado es el de Turck, que se compone de las siguientes sustancias: - 2 ml de ácido acético glacial. - 1 ml de solución acuosa de violeta de genciana al 1% ml de agua destilada. El ácido acético produce la lisis de los eritrocitos sin alterar a los leucocitos. El violeta de genciana tiñe el núcleo de los leucocitos para que éstos puedan observarse mejor. El violeta de genciana puede ser sustituido por azul de metileno. Muestra La misma que en el RBC. Técnica Es la misma que en el recuento de hematíes, pero se cuentan los leucocitos presentes en los 4 cuadrados grandes de las esquinas del retículo (cada uno de ellos está dividido a su vez en 16 cuadrados medianos). (Véase fig. 12.) Si los leucocitos se ven bien, se pueden contar con el objetivo de 10 x. Figura 12. Cuadrados en los que se cuentan los leucocitos en el WBC.

19 PROCEDIMIENTOS DIAGNÓSTICOS Recuento celular 19 Lectura de resultados Como se cuentan los leucocitos presentes en 4 cuadrados grandes, hay que dividir por 4 la cifra obtenida en el recuento, para calcular el número de leucocitos que hay en 1 cuadrado grande. Como la longitud de cada uno de los lados de los cuadrados grandes es de 1 mm, y la longitud del espacio comprendido entre éstos y el cubre es de 0,1 mm; hay que multiplicar por 10 el resultado anterior, para determinar el número de leucocitos existentes, no en 0,1 mm 3, sino en 1 mm 3. Como la sangre previamente al recuento propiamente dicho se diluye, hay que multiplicar el resultado anterior por 10, si se ha partido de la sangre entera contenida hasta el enrase de 1, o por 20, si se ha partido de la sangre entera contenida hasta el enrase de 0,5. En definitiva, para su cálculo puede emplearse la siguiente fórmula: L WBC = - 4 x 10 x D WBC = recuento de leucocitos (número de leucocitos por mm 3 de sangre). L = leucocitos contados en 4 cuadrados grandes. D = factor de dilución (10 o 20). Interpretación clínica de los resultados obtenidos La disminución del WBC se produce en las leucopenias, su aumento se da en las leucocitosis. Se considera normal un WBC comprendido entre y /mm Recuento de plaquetas con hemocitómetro Para el recuento en cámara de plaquetas, se diluye la sangre problema en un líquido apropiado y, posteriormente, se deposita en la cámara de recuento, donde se cuentan las células presentes en alguno de los cuadrados de uno de los retículos. Material necesario Un tubo de ensayo, preferentemente, de plástico.

20 PROCEDIMIENTOS DIAGNÓSTICOS Recuento celular 20 Una pipeta diluidora de Thoma, para recuento de glóbulos rojos. Un tubo de goma con boquilla, adaptable a la pipeta diluidora. Gasas. Una cámara de recuento, con un retículo tipo Neubauer mejorado. Un cubreobjetos, preferentemente, del tipo especialmente diseñado para su uso en recuentos con cámara. Un microscopio, preferentemente, de contraste de fases. Papel siliconado, para la limpieza de la cámara y de las lentes. Una placa de Petri. Papel de filtro. Reactivos Agua destilada o desionizada. Líquido de dilución. Hay varias soluciones que pueden emplearse para el recuento de trombocitos. Sin embargo, en esta práctica se recomienda el uso del líquido de dilución suministrado por los Laboratorios Spinreact. Este líquido rompe los hematíes, evita la agregación de las plaquetas entre sí y su adhesión a otros elementos, y facilita la visualización de las plaquetas al hacerlas refringentes. Muestra Sangre capilar o sangre venosa extraida recientemente y recogida en un tubo con EDTA-K 3. Técnica 1º. Verter, en un tubo de ensayo, el volumen necesario de líquido de dilución para efectuar los ensayos requeridos (aproximadamente, 1 ml para cada determinación). El volumen de líquido de dilución sobrante no ha de ser reintegrado al frasco donde estaba envasado, para no contaminar al resto de líquido de dilución. 2º. Con una pipeta diluidora de Thoma, aspirar la muestra de sangre, adecuadamente homogeneizada, hasta la señal de 1. 3º. Limpiar, con una gasa, la sangre adherida al exterior de la pipeta. 4º. Aspirar el líquido de dilución hasta la señal de 101 de la pipeta.

21 PROCEDIMIENTOS DIAGNÓSTICOS Recuento celular 21 5º. Agitar la pipeta, con movimientos de suave inversión, durante unos 5 minutos. 6º. Desechar las 5 primeras gotas de dilución que salen de la pipeta. 7º. Cargar, correctamente, una cámara de recuento, con la dilución de sangre que queda en la pipeta. 8º. Colocar la cámara de recuento cargada, en el interior de una cámara húmeda. Se puede preparar una cámara húmeda con una placa de Petri cerrada, en cuyo interior se deposita un papel de filtro embebido en agua. 9º. Dejar reposar la cámara de recuento cargada, durante 15 minutos. La cámara húmeda evita el resecamiento de la dilución de sangre presente en la cámara de recuento y el reposo asegura la sedimentación completa de todas las plaquetas. 10º. Colocar la cámara de recuento sobre la platina del microscopio. 11º. Enfocar uno de los retículos de la cámara de recuento, con un objetivo de bajo aumento (10 x). Con este objetivo se observa la homogeneidad de la distribución celular, de forma que, si ésta no es satisfactoria, se efectúa una nueva dilución de la muestra. 12º. Enfocar uno de los cuadrados grandes del retículo (por ejemplo, el central), con el objetivo de mediano aumento (40 x). Si se utiliza un microscopio normal, las plaquetas se visualizan mejor situando el condensador ligeramente bajo. 13º. Contar la totalidad de las plaquetas depositadas en ese cuadrado grande. Lectura de resultados Los trombocitos se observan como corpúsculos redondeados u ovalados, de tamaño muy pequeño y muy refringentes. Hay que procurar no confundirlos con leucocitos, restos eritrocitarios y, sobre todo, con partículas de polvo. Para calcular el número de plaquetas por mm 3 de sangre, se aplica la siguiente fórmula: PLT/mm 3 = P x V x D = P x 1.000

22 PROCEDIMIENTOS DIAGNÓSTICOS Recuento celular 22 PLT/mm 3 = Número de plaquetas por mm 3 de sangre. P = Número de plaquetas contadas en 1 cuadrado grande. V = Corrección de volumen (10). D = Corrección de dilución (100). Si la cifra de plaquetas obtenida es, sospechosamente, muy reducida, se efectúa una dilución menor de la muestra y se cuentan los trombocitos depositados en varios cuadrados grandes. Por el contrario, si la cifra de plaquetas obtenida es, sospechosamente, muy elevada, se efectúa una dilución mayor de la muestra. REV.: 10/09 Preparadores@arrakis.es Web: Esto implica un ajuste de los cálculos necesarios para obtener el PLT/mm 3 y tiene por objeto el confirmar los resultados obtenidos. 5. CONCLUSIONES El recuento celular es una herramienta habitual en el diagnóstico de las enfermedades, por ello es importante adiestrar a los alumnos en las diferentes técnicas de recuento, manuales y automáticas, ya que en los institutos suele haber un contador celular que les aproxime a las técnicas automatizadas. 6. BIBLIOGRAFÍA: Fundamentos y técnicas de análisis hematológicos y citológicos. F. Rubio, B. García y M. Carrasco. Ed. Thomson-Paraninfo. Técnicas de laboratorio en hematología. J. Lluis Vives y J. Luis Aguilar. Ed. Salvat