RNA-seq y Anotación Funcional. Ana Conesa & Diego de Pannis Noviembre 2013 FCEyN UBA. Ciudad Universitaria Buenos Aires, Argentina

Transcripción

1 RNA-seq y Anotación Funcional Ana Conesa & Diego de Pannis Noviembre 2013 FCEyN UBA. Ciudad Universitaria Buenos Aires, Argentina

2 Programa Dia 1 Mañana: Introducción a RNA- seq Introducción a las tecnologías de ultrasecuenciacion, aplicaciones y limitaciones. Conceptos básicos de RNA- seq. Preparación de librerías, diseño experimental, RNA- seq en presencia y ausencia de un genoma de referencia. Control de calidad en secuenciación masiva. Tarde: RNA- seq con genoma de referencia Mapeo CuanEficación Expresión diferencial Enriquecimiento funcional Dia 2 Mañana: RNA- seq sin genoma de referencia Reconstrucción de tránscritos Calidad e ideneficación de nuevos tránscritos Tarde: Anotación Funcional Conceptos de Anotación Funcional Herramienta Blast2GO. Dia 3 Mañana: Asignación de función Métodos de anotación automácca EstadísEcas de anotación Estrategias de anotación. Que hacer en sets de datos dipciles? Tarde: Análisis de información Funcional Visualización Análisis de Enriquecimiento

3 NGS: using sequencing to study muleple aspects of nucleic acids

4 Next GeneraEon Sequencing Cost-effective Fast Ultra throughput Cloning-free Short reads

5 Comparison of NGS technologies PacBio Roche 454 Solexa SOLiD Long fragments Errors: poly nts/many Low throughput Expensive De novo sequencing Amplicon sequencing Closing genomes Full-length transcripts Short fragments 2x150 Errors: Hexamer bias High throughput Cheap Resequencing: ChipSeq RNASeq MethylSeq Short fragments 2x75 Color-space High throughput Cheap Resequencing: ChipSeq RNASeq MethylSeq Long Reads Low throughput Short Reads High throughput

6 ApplicaEons De novo sequencing Resequencing Exome Sequencing RNA-seq Genome annotation Chip-seq Methyl-seq.

7 RNA- seq: transcript ideneficaeon Mortazavi, 2008 Haas and Zody, 2010

8 RNA- seq: quaneficaeon Map to genomes Map to transcripts

9 ApplicaEons of RNA- seq Qualitative Quantitative AlternaEve splicing IdenEficaEon of transcripts * AnEsense expression * Extragenic expression * AlternaEve 5 and 3 usage * DetecEon of fusion transcripts. * DifferenEal expression * Dynamic range of gene expression.

10 Advantages of RNA- seq RNA-seq * Non targeted transcript deteceon * No need of reference genome * Strand specificity * Find novels splicing sites * Larger dynamic range * Detects expression and SNVs * Detects rare transcripts. microarrays * Restricted to probes on array * Needs genome knowledge * Normally, not strand specific * Exon arrays difficult to use * Smaller dynamic range * Does not provide sequence info * Rare transcripts difficult. and. are there any disadvantages?????

11 RNA- seq pipeline Library preparaeon Sequence preprocessing Mapping QuanEficaEon DifferenEal expression Transcript assembly FuncEonal annotaeon InterpretaEon

12 RNA- seq pipeline Library preparacon Sequence preprocessing Mapping QuanEficaEon DifferenEal expression Transcript assembly FuncEonal annotaeon InterpretaEon

13 RNA- seq protocol* total RNA purification mrna preparation oligodt RiboZ 2 nd strand synthesis fragmentation 1 st strand synthesis RNA DNA *Solexa Pair-End

14 RNA- seq protocol (II) 100bp lad adenylation 3 ends A A A A A A A A A A ligate adapters amplification library SEQUENCING!

15 Strand- specific RNA- seq

16 Strand- specific RNA- seq

17 RNA- seq landscape

18 Some surprises of RNA- seq RNAseq In RNA-seq, there is a relationship between the chance that a gene is declared differentially expressed and its length

19 Some surprises of RNA- seq The relative distribution of transcript species depends on the sequencing depth

20 Some surprises of RNA- seq Positive correlation between expression level and transcript length. Also with RPKM!!! The relative distribution of transcript species depends on the sequencing depth

21 RNA- seq pipeline Library preparaeon Sequence preprocessing Mapping QuanEficaEon DifferenEal expression Transcript assembly FuncEonal annotaeon InterpretaEon

22 Fastq Format for RNA- seq GATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAGTAAATCCATTTGTTCAACTCACAGTTT +!''*((((***+))%%%++)(%%%%).1***-+*''))**55CCF>>>>>>CCCCCCC65 n 1. Header (like the fasta but stareng ) n 2. Sequence (string of nt) n 3. + and sequence ID (opeonal) n 4. Encoded quality of the sequence

23 Quality codificaeon Phred scores Phred Quality Score Probability of incorrect base call 10 1 in 10 90% 20 1 in % 30 1 in % 40 1 in % Base call accuracy 50 1 in % 23

24 FastQC: Quality Control

25 Sequence quality per base posieon Good data Consistent High quality along the read l The central red line is the median value l The yellow box represents the inter-quartile range (25-75%) l The upper and lower whiskers represent the 10% and 90% points l The blue line represents the mean quality

26 Sequence quality per base posieon Bad data High variance Quality decrease with length SOLiD characteristic pattern

27 Per sequence quality distribueon Good data Most are high- quality sequences

28 Per sequence quality distribueon Bad data Non- uniform distribueon Low Quality Reads

29 Per base sequence content Good data Smooth over length Organism dependent (GC) Per base sequence content

30 Per base sequence content Bad data Sequence posieon bias

31 Per sequence GC content Good data Bad data Fits with expected Does not fit with expected Organism dependent Library contaminaeon?

32 Per base N content Good data Bad data Not good if there are N bias per base posicon

33 Sequence duplicaeon levels In transcriptomics, you expect higher number of duplicated sequences. In genomics you should be worried if this happens PCR arefact?

34 Filtering & trimming Removing bad quality data will improve our confidence on downstream analysis

35 Filtering & trimming Sequence filtering Mean quality Read length Read length aper trimming Percentage of bases above Q Adapter trimming Adapter reads minimum quality threshold Sequence filtering tools Fastx- toolkit Galaxy (hqps://main.g2.bx.psu.edu/) SeqTK (hqps://github.com/lh3/seqtk) Cutadapt (hqp://code.google.com/p/cutadapt/) And more...

36 Exercise 1. Quality Control

37 RNA- seq pipeline Library preparaeon Sequence preprocessing Mapping QuanEficaEon DifferenEal expression Transcript assembly FuncEonal annotaeon InterpretaEon

38 Mapping Small Length Reads Mapping (First step) Long Length Reads Mapping (Second step)

39 Considering library- type Strand- specific (ssrnaseq) data and not strand- specific (nsrnaseq) data

40 Considering Library type Single Reads (SR) and Paired- end Target (PET) SR PET Forward Read Fragment length Insert length Reverse Read Single Reads result in One fastq file, Paired- end in Two 40

41 IdenEfying library- type for mapping

42 Mapping with TopHat Fast splice junceon mapper for RNA- Seq reads Free and open- source sopware tool

43 TopHat algorithm Tophat mapea con BowCe TopHat ensambla con mac TopHat2 usa BowCe2, un mapeador con huecos, apto para lecutras de 50 a 100/1000 nts.

44 Esquema mapeo TopHat Genoma referencia (fichero fasta) RNA- seq data (fichero fastq) bow1e- build Ficheros índice (6 files.ebwt) TopHat Ficheros de mapeo (bam and bed files)

45 Sintaxis para el indexado del genoma 1) Indexado del genoma de referencia Sintax: bowce- build [opcons]* <reference_in> <ebwt_base> <reference_in> <ebwt_base> [opcons]* Una lista de ficheros FASTA separados por comas, con el genoma de referencia. El nombre base dado a los ficheros indexados Para ajustar parámetros a cada análisis - C/- - color Indexado en color space

46 Sintaxis para el indexado del genoma 1) Indexado del genoma de referencia Sintax: bowce- build [opcons]* <reference_in> <ebwt_base> Ejemplo: > bowce- build NC_ fna e_coli_o157_h7 Output index files: e_coli_o157_h7.1.ebwt e_coli_o157_h7.3.ebwt e_coli_o157_h7.rev.1.ebwt e_coli_o157_h7.2.ebwt e_coli_o157_h7.4.ebwt e_coli_o157_h7.rev.2.ebwt

47 Sintaxis para el mapeado con TopHat 1) Sopware se necesita: TopHat2, Botwie2 y samtools Sintax > tophat [opcons]* <index_base> <reads1_1[,...,readsn_1]> [reads1_2,...readsn_2] <index_base> Genoma indexado, obtenido con BowEe <reads1_1[,...,readsn_1]> Ficheros lecturas par 1 [reads1_2,...readsn_2] Ficheros lecturas par 2 [opcons]* Para ajustar parámetros a cada análisis - I or - i Maximum and minimum intron length - - library_type By default unstranded

48 OpEons for library- type

49 Ejemplo sintaxis mapping > tophat - - library_type fr- firtstrand e_coli_o157_h7 raw_data_1,raw_data_2,raw_data_3 Output tophat files: accepted_hits.bam Resultado del mapeo align_summary.txt Info sobre lecturas meadas tdeleeons.bed Posiciones y tamaño de delecciones insereons.bed Posiciones y tamaño de insercciones junceons.bed Posiciones de las uniones de exones Logs Info sobre el proceso de mapeo prep_reads.info unmapped.bam Lecturas no mapeadas

50 Visualización de los datos Bash Linux commands > ls l lista los ficheros del directorio

51 Visualización de los datos Bash Linux commands (para ficheros de texto, no bam) > cat muestra todo el contenido del fichero > more muestra el principio del fichero > less muestra el final del fichero > head muestra las primeras líneas del fichero

52 Visualización de los datos Samtools: programa para manejar ficheros de secuenciacion accepted_hits.bam List of read alignments (binary file) Openning binary file using samtools view accepted_hits.sam List of read alignments (text file) Transform.bam in.sam

53 Bam/Sam format Más info en hqp://samtools.sourceforge.net/samv1.pdf

54 BED format > head delecons.bed chr start end counts > Head inserccons.bed chr start end nt couts > head junccons.bed chr start end junct. Name counts strand

55 Exercise 2: Mapping

56 RNA- seq pipeline Library preparaeon Sequence preprocessing Mapping QuanEficaEon DifferenEal expression Transcript assembly FuncEonal annotaeon InterpretaEon

57 CuanEficación en RNA- seq Qué es cuancficación en RNA- seq? El número de lecturas en genes o tránscritos es una medida de la expresión del gen Aproximación más simple: contar el número de lecturas Objeto de la cuancficación: Determinar el número de genes expresados en una muestra Necesario para análisis de expresión diferencial Problemas: Diferentes aproximaciones à diferentes resultados Lecturas de mulemapeo Lecturas solapantes Especificiad de hebra No uniformidad de distribución de lecturas a lo largo del gen

58 Mapeo vs. CuanEficación

59 Mapeo vs. CuanEficación

60 Programas hqp://cufflinks.cbcb.umd.edu/manual.html hqp://www- huber.embl.de/users/anders/htseq/doc/count.html hqp://qualimap.bioinfo.cipf.es/

61 Cufflinks Sintax: > cufflinks [opcons]* <aligned_reads.(sam/bam)> * EsEma Fragment per Kilobase of exon Model per Million fragments mapped (FPKM) * Usa un método de máxima verosimilitud to asignar reads a transcritos solapantes. * Intenta considerar distribuciones heterogéneas de lecturas en la long.del transcrito * No Eene por que ser una solucion parsimoniosa. [opcons]* - G Se ueliza un g{ proporcionado. No ensambla transcritos - g Ensambla pero usando el gp proporcionado de referencia - u para tratar las mulereads - - library- type Igual que para TopHat

62 Cufflinks output

63 Htseq- count Sintax: > htseq- count [opcons]* <sam_file> <gff_file> <sam_file> Generado con un programa que hace gapped alignment (TopHat) Si se ueliza paired- end data, fichero Eene que estar ordenado (sort) <gq_file> Indica las posiciones de las features del genoma Está disponible para casi todos los genomas [opcons]* - m modo para lecturas solapantes (see next slide) - s si es strand- specific [yes, no, reverse] - t feature type. Tercera columna del g{. Defecto es exon - i Defecto es gene_id

64 Modos Htseq- count

65 Htseq- count output Fichero de texto con los conteos de cada feature. Al final se idica: No_feature lecturas que no solapan con features del g{ Ambiguous según el modo y el esquema anterior Too_low_aQual baja calidad (según parámetro a) Not_aligned Lecturas en SAM sin alginment Alignmnent not unique lecturas con mulemapping

66 Qualimap Use the right sequencing protocol Choose gene or transcript Choose exon reads Use this opeon for beqer treatment Of mulemapping reads * Implementa una version interseceon- reach del Htseq- count * Mucho más rápido * Considera las lecturas con múliples mapeos * Permite QC de conteos

67 Htseq- count/qualimap output

68 Exercise 3: Conteos

69 RNA- seq pipeline Library preparaeon Sequence preprocessing Mapping QuanEficaEon DifferenEal expression Transcript assembly FuncEonal annotaeon InterpretaEon