Xavier Montalban Gairin Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d'hebron Mario Notari CMRB Centre Medicina Regenerativa de Barcelona

Transcripción

1 REGENERACIÓN DE LA MIELINA EN LA ESCLEROSIS MÚLTIPLE: INVESTIGACIÓN DE NUEVAS TERAPIAS QUE CONTRIBUYAN A LA REMIELINIZACIÓN BASADAS EN LA FIRMA GENÉTICA DE CÉLULAS MADRE NEURALES Y CÉLULAS MADRE PLURIPOTENTES Xavier Montalban Gairin Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d'hebron Mario Notari CMRB Centre Medicina Regenerativa de Barcelona

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3 1. Resumen del proyecto La esclerosis múltiple (EM) es una patología autoinmune que produce desmielinización y daño axonal que causan déficits neurológicos a los pacientes. Los tratamientos de los que disponemos actualmente actúan principalmente sobre el sistema inmune y son bastante efectivos disminuyendo la actividad inflamatoria de la enfermedad, pero no tienen ningún efecto en la regeneración de la mielina dañada. Por ello, los objetivos de este estudio fueron: a) identificar compuestos químicos que favorezcan la oligodendrogénesis in vitro en dos modelos celulares células madre neurales (CMN) de ratón y células madre humanas pluripotentes inducidas (CMPI), y b) evaluar su potencial para mejorar la remielinización. Diferenciamos CMN de ratón a células progenitoras de oligodendrocitos (CPOs) y a oligodendrocitos, estudiamos su expresión génica y seleccionamos 15 genes como huella genética que define la diferenciación desde CMN a oligodendrocito. Con esta huella genética y el Connectivity Map obtuvimos una lista de compuestos. Cinco de ellos se testaron in vitro y 3 de ellos demostraron que favorecían el proceso de diferenciación de CMN a CPO y de CPO a oligodendrocito. Estos 3 compuestos se testaron en dos modelos animales de desmielinización. Desafortunadamente, ninguno de los fármacos seleccionados demostró tener efectos sobre la remielinización en ninguno de los dos modelos animales. También generamos 6 líneas de CMPI de 6 pacientes de EM, estratificados según un polimorfismo en el gen TNFRSF1A. Demostramos que las CMPI generadas tenían la capacidad de autorrenovarse y de diferenciarse a diferentes tipos celulares. Observamos que las CMPI del grupo que tenía el alelo de riesgo formaban menos rosetas neurales que el otro grupo, lo que indicaba que podría haber algún déficit en la diferenciación al linaje neural. También encontramos que había una expresión diferencial de OSP/claudina-11 entre los dos grupos durante el proceso de diferenciación. 3

4 2. Resultados 1.- Identificación de compuestos químicos que favorezcan la diferenciación de oligodendrocitos y que podrían ser terapias neuroprotectoras para pacientes con EM Definición de la huella de expresión génica y búsqueda de fármacos en librerías químicas En este estudio diferenciamos CMN de ratón a CPO y a oligodendrocitos, neuronas y astrocitos, y se recogió su ARNm para definir el perfil de expresión génica que caracteriza los diferentes estadios mediante microarrays. Con el análisis de los microarrays encontramos que en el proceso de diferenciación de CMN a CPO genes estaban sobreexpresados y reprimidos, y que en el proceso de maduración de CPO a oligodendrocitos mielinizantes 557 genes estaban sobreexpresados y 681 reprimidos. Los genes expresados diferencialmente se seleccionaron y obtuvimos una huella de expresión génica formada por 15 genes: Ncam2, Adra1a, Thra, Npas2, Sulf1, Cntn2, Prox1, Ndrg1, Bcl3, Cebp, Stat3, Sox5, Fcgr2b, Ifnar2 e Il13ra1. Esta huella se consideró informativa del proceso de diferenciación de CMN a oligodendrocito. La huella genética se comparó con los perfiles de expresión génica de pequeñas moléculas del Connectivity Map, y se obtuvo una lista de 39 compuestos. Los 5 mejor posicionados con potencial para favorecer la remielinización (deptropina, picrotoxinina, ácido valproico, perhexilina y pimozida) se seleccionaron para ser validados in vitro Validación in vitro de los compuestos seleccionados Las CMN se diferenciaron a CPO y a oligodendrocitos con los fármacos seleccionados durante 48 horas, juntamente con un control positivo, un control negativo y un control de vehículo (DMSO). Los cultivos celulares se fijaron para hacer inmunotinciones con marcadores específicos para CPO (NG2) y oligodendrocitos (O4, O1, MBP, PLP), y encontramos que la deptropina, la pimozida y el ácido valproico tenían un efecto positivo sobre los cultivos, induciendo la diferenciación a CPO y a oligodendrocito en comparación con el control negativo y el vehículo, aunque ninguno de ellos fue tan efectivo como los factores de crecimiento del control positivo. 4

5 Fig. 1. Diferenciación de CMN a CPO con los fármacos seleccionados. Los fármacos seleccionados se añadieron a cultivos de CMN y se compararon con cultivos que tenían factores de crecimiento (+ Control), sin factores de crecimiento ( Control) y con vehículo (DMSO), y se valoraron mediante inmunotinciones para Olig2 (oligodendrocitos), Nestin (CMN), GFAP (astrocitos) y NG2 (CPO). Los recuentos celulares demostraron que los fármacos testados inducían la diferenciación de CMN a CPO. Las barras representan la media ± error estándar de la media. El asterisco negro (*) indica significación estadística (p < 0,05) al comparar los fármacos con el Control +. El asterisco rojo (*) indica significación estadística (p < 0,05) al comparar los fármacos con el Control. El astersico verde (*) indica significación estadística (p < 0,05) al comparar los fármacos con DMSO. 5

6 Fig. 2. Diferenciación de CPO a oligodendrocitos con los fármacos seleccionados. Los fármacos seleccionados se añadieron a cultivos de CPO y se compararon con cultivos con factores de crecimiento (+ Control), sin factores de crecimiento ( Control) y con vehículo (DMSO), y se valoraron con inmunotinciones para NG2 (CPO), GFAP (astrocitos), Olig2 (oligodendrocitos), O1 (oligodendrocitos mielinizantes), O4 (oligodendrocitos premielinizantes) y MBP (oligodendrocitos mielinizantes). Los recuentos celulares demostraron que los fármacos testados inducían la diferenciación de CMN a CPO. Las barras representan la media ± error estándar de la media. El astersico negro (*) indica significación estadística (p < 0,05) al comparar los fármacos con el Control +. El astersico rojo (*) indica significación estadística (p < 0,05) al comparar los fármacos con el Control. El asterisco verde (*) indica significación estadística (p < 0,05) al comparar los fármacos con DMSO Validación in vivo de los fármacos seleccionados La deptropina, la pimozida y el ácido valproico, los tres fármacos que mejores resultados demostraron in vitro, fueron testados in vivo en dos modelos animales de desmielinización: la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) y un modelo murino con lisolecitina. Después de inducir la EAE, valoramos el curso clínico de la enfermedad en los grupos de ratones tratados con deptropina, pimozida, ácido valproico o DMSO en comparación con un grupo control de EAE. El curso clínico fue similar entre los diferentes grupos tratados con los fármacos seleccionados y el grupo de DMSO en comparación con el grupo control de EAE. Concluimos que la administración de estos fármacos de forma terapéutica no producía una mejora en el curso clínico de la EAE. 6

7 También inducimos desmielinización con lisolecitina a ratones que después se trataron con deptropina, pimozida, ácido valproico o DMSO. Valoramos el efecto de estos fármacos en los diferentes grupos con inmunotinciones y observamos que la densidad de oligodendrocitos (células olig2 +) era comparable en todos los grupos, excepto en el grupo tratado con ácido valproico, donde se observaba un ligero incremento en la densidad de oligodendrocitos que no resultó ser estadísticamente significativo. Fig. 3. CPO en lesiones de lisolecitina. El análisis de la densidad de CPO en les lesiones de lisolecitina no evidenció diferencias remarcables entre los ratones tratados con ácido valproico (VA), pimozida (PZ), deptropina (DP) o vehículo (ctrl), a pesar de que el grupo tratado con VA mostraba un cierto incremento en la densidad de CPO que estadísticamente no fue significativo. Además, este grupo de animales mostró una cierta dificultad en la recuperación de la pérdida de peso debida al estrés de la cirugía. Los datos se muestran como media +/ s.e.m. y como valores individuales. 2.- Identificación de buenos y malos remielinizadores basándose en la diferenciación de oligodendrocitos generados a partir de CMPI de pacientes con EM clasificados según factores genéticos Estratificación de pacientes con EM con alelos de riesgo asociados a la susceptibilidad de sufrir EM Pacientes con EM se estratificaron según la presencia o ausencia del alelo de riesgo para el polimorfismo rs del gen TNFRSF1A, que codifica el principal receptor 7

8 del TNF-alfa, TNF-R1, y que en los portadores del alelo de riesgo genera una isoforma funcional soluble que no contiene el exón 6 (Δ6-TNF-R1) y que se asocia a un aumento del riesgo de sufrir EM. En total 6 pacientes con EM, 3 portadores del alelo de riesgo y 3 sin este alelo, se seleccionaron como candidatos para la generación de CMPI Generación de CMPI a partir de fibroblastos de pacientes de EM y diferenciación a oligodendrocitos Usando retrovirus se generaron 6 líneas de CMPI de pacientes de EM con dos genotipos diferentes, CC o TT, del polimorfismo rs Las líneas tenían un cariotipo normal, expresaban genes de pluripotencia y se diferenciaron a células de las tres capas germinales. Así, demostramos que las CMPI de EM tenían capacidad de autorrenovarse y diferenciase a distintos tipos celulares. Fig. 4. Capacidad de diferenciación de las líneas de CMPI de EM. El potencial de diferenciación de las líneas de CMPI de EM se confirmó in vitro con la diferenciación de los cuerpos embrioides a las tres capas germinales. Como se demuestra con las inmunotinciones, había expresión de marcadores endodérmicos: α-fetoproteína (AFP) y forkhead box A2 (FOXA2), ectodérmicos: βiii-tubulina (TUJ1) y proteína ácida fibrilar glial (GFAP), y mesodérmicos: α-smooth muscle actin (ASMA) y α-sarcomeric actin (ASA). Los protocolos de diferenciación de CMPI a oligodendrocitos en humanos son muy ineficientes y variables, así que la producción de oligodendrocitos resulta ser un proceso muy largo y caro. A pesar de ello, con el protocolo de diferenciación que usamos, como mínimo, pudimos diferenciar CPO de forma eficiente. Con las CPO obtenidas caracterizamos molecularmente las 6 líneas de CMPI de EM para identificar diferencias entre los dos grupos. El protocolo de diferenciación se inicia con la 8

9 diferenciación al linaje neural. En ese momento observamos que las células del grupo con el alelo de riesgo formaban menos rosetas neurales (característica del desarrollo de progenitores neurales en cultivo) que el otro grupo, lo cual indicaba algún posible déficit en la diferenciación al linaje neuroglial. También encontramos que había una expresión diferencial de OSP/claudina-11 entre grupos durante los diferentes estadios de la diferenciación. Fig. 5. Diferenciación de CMPI a precursores de oligodendrocitos. En el estadio de progenitores neurales se observaba la formación de rosetas con contraste de fases. En el estadio de precursor de oligodendrocito expresaban Olig2 y O4. Las líneas derivadas de los pacientes 1, 2 y 5 (genotipo TT) presentaban represión de OSP/claudina-11 en comparación con las líneas 3, 4 y 6. Estas 6 líneas de CMPI de EM están disponibles en el Banco Español de Líneas Celulares (ISCIII) y se pueden obtener con la presentación de un proyecto que deberá ser aprobado por el comité competente. 4. Relevancia y posibles implicaciones Este proyecto nos ha llevado a la identificación de fármacos con capacidad para inducir mielinización in vitro. Aunque no hemos podido demostrar ningún efecto en la remielinización in vivo con ninguno de los modelos animales de EM, pensamos que la estrategia utilizada es la apropiada para identificar compuestos químicos con potencial para inducir remielinización. Cabe destacar que una limitación muy importante en este tipo de estudios es el número de compuestos químicos que se pueden testar a la vez para demostrar efectos tanto in vitro como in vivo. Se identificaron 39 compuestos químicos, de los cuales solo 5 se han podido testar. Como ya hemos dicho antes, este número es el resultado de nuestras limitaciones para manejar grandes cantidades de 9

10 fármacos al mismo tiempo, lo que nos ha llevado a poder testar solo 5 fármacos. Mientras, han quedado pendientes de estudio 34 compuestos más que podrían tener capacidad remielinizante tanto in vitro como in vivo, y que podrían ser candidatos para estudios futuros. La generación de 6 líneas de CMPI específicas de pacientes de EM ofrece un modelo de la enfermedad que podría aportar ventajas en el estudio de las causas de la EM y de sus mecanismos patogénicos, la búsqueda de nuevos fármacos y el desarrollo de la medicina personalizada. El hecho de que estas líneas de CMPI sean accesibles para la comunidad científica maximiza los beneficios de este campo de la investigación. Los resultados obtenidos en este proyecto apuntan a un posible papel de OSP/claudina- 11 en los mecanismos patogénicos de la EM. Previamente se habían encontrado anticuerpos anti-osp/claudina-11 en el líquido cefalorraquídeo de pacientes con EM recurrente-remitente y también se había descrito una expresión aberrante de OSP/claudina-11 en leucocitos de pacientes de EM. Teniendo en cuenta que OSP/claudina-11 es la tercera proteína más abundante de la mielina y que controla la migración y la proliferación de oligodendrocitos, sugiere una posible correlación genotipo-fenotipo que podría explicar el mayor riesgo que confiere el genotipo CC. Estos resultados demuestran claramente que es necesario seguir investigando el papel de los anticuerpos anticlaudina-11 en estos pacientes para aclarar el rol de claudina-11 en la etiología de le EM. 4. Literatura generada Congresos Search of therapies that favour remyelination based on genomic-signatures of neural stem cells. Costa C, Nurtdinov R, Malhotra S, Pohl H, Montalban X, Comabella M. ECTRIMS, Londres Póster. Artículos Generation of six multiple sclerosis patient-derived induced pluripotent stem cell lines. 10

11 Miquel-Serra L, Duarri A, Muñoz Y, Kuebler B, Aran B, Costa C, Martí M, Notari M, Comabella M, Malhotra S, Montalban X, Veiga A, Raya A. Stem Cell Research. (En revisión.) Registro de líneas celulares Las 6 líneas de CMPI de EM generadas en este proyecto están en proceso de ser registradas en el Banco Nacional de Líneas Celulares y de ser inscritas en el Human Pluripotent Stem Cell Registry. 11