1. Resumen. Los resultados esperados de nuestros estudios comprenden la caracterización detallada de la vía de señalización por Wnt que controla la

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1 BASES MOLECULARES Y CELULARES E IMPLICACIONES FUNCIONALES DE LA NEUROGÉNESIS DEL HIPOCAMPO ADULTO; IMPLICACIONES PARA LA PATOGÉNESIS DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER Investigadores principales: Dr. Juan Carlos Izpisúa Belmonte Centre de Medicina Regenerativa de Barcelona Dra. Joana Visa Esteve Institut d Investigació Biomèdica de Bellvitge Dr. Fred H. Gage Salk Institute for Biological Studies Duración: 3 años 1

2 1. Resumen El resurgimiento reciente del campo de la neurogénesis adulta abre una ventana de esperanza de nuevos tratamientos y curas para lo que parecía un campo irreparable de desórdenes neurodegenerativos. Actualmente sabemos que el nacimiento de neuronas en el cerebro adulto humano es un proceso biológico continuo en, al menos, dos regiones: el bulbo olfativo y el hipocampo. No obstante, los mecanismos celulares y moleculares que regulan la neurogénesis adulta, así como el significado funcional de este proceso, son aún desconocidos. Los principales objetivos del presente proyecto incluyen profundizar en nuestro conocimiento sobre los mecanismos moleculares que controlan la neurogénesis en el hipocampo adulto, investigar directamente las consecuencias de la eliminación de la neurogénesis del hipocampo en la adquisición de conductas controladas por el hipocampo, y explorar las posibilidades de que los genes relacionados con la enfermedad de Alzheimer interaccionen con las vías de señalización por Wnt y Notch durante la regulación de la neurogénesis en el hipocampo adulto, y que las manifestaciones preclínicas de la enfermedad de Alzheimer son una consecuencia, al menos en parte, de la pérdida de la neurogénesis en adultos. Metodología: para responder estas cuestiones, proponemos una metodología de trabajo multidisciplinar que combina resultados de análisis in vivo de la regulación de la expresión génica y ensayos con reporteros y diferenciación de células madre neurales genéticamente manipuladas, análisis in vivo de la neurogénesis del hipocampo adulto después de modificaciones genéticas mediadas por lentivirus, y/o manipulación genética de componentes específicos de vías de señalización relevantes, y análisis funcionales de las conductas controladas por el hipocampo tras la manipulación experimental de los procesos de la neurogénesis adulta. Los resultados esperados de nuestros estudios comprenden la caracterización detallada de la vía de señalización por Wnt que controla la 2

3 neurogénesis del hipocampo y el esclarecimiento del papel que la señalización a través de Notch ocupa durante este proceso. Además, esperamos demostrar que la neurogénesis en el hipocampo adulto proporciona la plasticidad estructural que subyace al aprendizaje y a la formación de memoria, y que estos procesos son, al menos en parte, regulados conjuntamente por genes relacionados con la enfermedad de Alzheimer. 2. Resultados Modificaciones en la metodología y/o plan de trabajo original y justificación. Generación de células ips de pacientes con Alzheimer para poner a prueba nuestro nuevo método desarrollado de producción de células nerviosas en el contexto real de la enfermedad. Los actuales modelos animales usados para estudiar la enfermedad de Alzheimer no resumen fielmente la patología y la progresión típica de la enfermedad en humanos. Con el fin de crear un modelo para estudiar in vitro esta enfermedad, generamos líneas de células ips específicas de pacientes a partir de fibroblastos obtenidos de pacientes con Alzheimer. Nuestros laboratorios han demostrado una amplia experiencia en la generación de células ips humanas (T Aasen et al., Giorgetti A. et al.) y también de líneas celulares ips específicas de paciente (Raya, A. et al.). Por tales motivos, en la última parte de este proyecto produjimos células ips específicas de pacientes por transducción retroviral con OCT4, SOX2, KLF4 y c-myc, para ser utilizadas como modelo in vitro para estudiar la enfermedad de Alzheimer. Para generar las células ips corregidas genéticamente, seguimos nuestros estudios en la producción exitosa de células ips, a las cuales se les ha corregido la mutación portadora de la enfermedad de anemia de Fanconi (Raya, A. et al.). 3

4 Hemos demostrado que la generación de ips humanas a partir de fibroblastos es un proceso muy eficiente, permitiendo la generación de células ips específicas de pacientes a partir de pequeñas cantidades de muestras biológicas, tales como un único folículo piloso de una persona adulta. Recientemente, utilizando vectores retrovirales y lentivirales, nuestros laboratorios fueron capaces de corregir y reprogramar los queratinocitos humanos de pacientes con anemia de Fanconi y diferenciar estas células ips curadas en progenitores hematopoyéticos de los linajes eritroide y mieloide. En este proyecto no sólo hemos aplicado la técnica descrita anteriormente, sino que también se ha puesto en práctica. El nuevo enfoque nos ha permitido obtener las células ips corregidas derivadas de pacientes y desprovistas de cualquier modificación genética, conjuntamente con la deseada corrección en el sitio específico de uno de los alelos mutados que causa la enfermedad. Mutaciones sin sentido en el gen de la presenilina 1 (PS1) son dominantes y causan la forma más común de la enfermedad de Alzheimer familiar de aparición temprana, y se asocian con mayores niveles en plasma y fibroblastos de la piel de péptidos beta-amiloide (A-beta) que finalizan en el residuo 42 (A-beta 42) en aquellos portadores del gen. La mutación E280A en el gen PS1 ha sido identificada como la más común en pacientes con la enfermedad de Alzheimer. Comenzamos a generar células ips específicas de la enfermedad a partir de fibroblastos aislados de pacientes afectados por esta mutación y más tarde utilizando recombinación homóloga combinada con ruptura de la doble hélice inducida por nucleasas de dedos de zinc introdujimos la copia no mutada (wt) del gen PS1 con el fin de corregir uno de los alelos mutados. Las colonias de células generadas con morfología ips fueron recogidas y expandidas en placas cubiertas con Matrigel o con feeder layer. 4

5 Es entonces cuando caracterizamos las líneas de células ips derivadas de pacientes de Alzheimer según: Comprobación de la morfología (colonias con bordes agudos y definidos compuestas de células compactas con una alta relación núcleo-citoplasma). Evaluación de las características de crecimiento celular. Tinción positiva para la fosfatasa alcalina. Cariotipo normal. Niveles de expresión elevados para los factores de transcripción (Oct4, Sox2, NANOG). Tinción para marcadores de superficie de pluripotencia (SSEA3, SSEA4, TRa1-60, TRa1-81). Silenciación de transgenes retrovirales. Estado de metilación del Oct4 y promotores NANOG. Además, se analizó la capacidad de las líneas celulares ips específicas obtenidas a partir de pacientes de diferenciación in vitro en las tres capas embrionarias: ectodermo endodermo, mesodermo, teniendo en cuenta la morfología celular y la tinción inmune específica con α-fetoproteína/foxa2, TuJ1/GFAP, y α-actinina, respectivamente. En particular, hemos centrado nuestro estudio de diferenciación en establecer un protocolo eficiente para obtener la diferenciación neuronal in vitro de las líneas de células ips derivadas de pacientes con Alzheimer. 3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados finales obtenidos Aunque esta tecnología es muy prometedora, hasta la fecha no es posible la aplicación médica. Las células ips siguen siendo una poderosa herramienta para investigar in vitro esta patología, lo que supondría avances en su terapia. 5

6 4. Publicaciones Raya A., Rodríguez-Pizà I., Consiglio A., Guenechea G., Vassena R., Navarro S., Barrero M.J., Tiscornia G., Garreta E., Aasen T., Veiga A., Verma I.M., Bueren J., Izpisúa Belmonte J.C. (2009) Disease-corrected haematopoietic progenitors from Fanconi anaemia induced pluripotent stem cells. Nature, 460(7251):53-9. Epub 2009 May 31. I.F.: 31,434 Aasen T., Raya A., Barrero M.J., Garretta E., Consiglio A., Gonzales F., Vassena R., Bilic J., Edel M., Tiscornia G., Pekarik V., Boue S., Belmonte JC. (2008). Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat. Biotechnology, 26(11): I.F.: 22,848 Raya, A., Arán, B., Rodríguez-Pizà, I., Consiglio, A., Barri, P., Veiga, A., and Juan Carlos Izpisúa Belmonte, JC. (2008). Generation of cardiomyocytes from new human embryonic stem cell lines derived from poor-quality blastocysts. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73: Epub 2008 Nov 21. I.F.: Rodríguez-Pizà I, Richaud-Patin Y, Vassena R, González F, Barrero MJ, Veiga A, Raya A, Belmonte JC. (2010) Reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells under xeno-free conditions. Stem Cells. Jan; 28(1): I.F.: 7,741 M, Lie DC, Moore L, Nakashima K, Asashima M, Gage FH. (2009). Wnt-mediated activation of NeuroD1 and retro-elements during adult neurogenesis. Nat Neurosci.12(9): I.F.: 14,805 6

7 Jessberger S., Clark R.E., Broadbent N.J., Consiglio A., Clemenson G.D., Lie C.D., Squire L.R., and Gage F.H. (2009). Dentate gyrus-specific knockdown of adult neurogenesis identifies a role for newborn neurons in hippocampus-dependent learning and memory. Learning and Memory 29;16(2): I.F.: 4,079 7