Déficit de acetil CoA deshidrogenasa de cadena media detectado por pesquisa neonatal en Uruguay

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1 Bioquímica Clínica Déficit de acetil CoA deshidrogenasa de cadena media detectado por pesquisa neonatal en Uruguay Newborn screening of medium-chain acyl-coa dehydrogenase deficiency in Uruguay Cecilia Queijo 1, Aída Lemes 2, María Machado 1, Paola Garlo 1, Fernanda González 3, Karina Franca 3, Lylián Corbo 3, Graciela Queiruga 4 1. Bioquímica Clínica. Laboratorio de Pesquisa Neonatal, Banco de Previsión Social, Montevideo, Uruguay. 2. Dr. en Medicina. Laboratorio de Pesquisa Neonatal, Banco de Previsión Social. 3. Licenciada en Laboratorio Clínico. Laboratorio de Pesquisa Neonatal. Banco de Previsión Social, Montevideo, Uruguay. 4. Dra. en Química Farmacéutica. Re su men La pesquisa neonatal comienza con el diagnóstico de fenilcetonuria en la década del 60 por el método de inhibición bacteriana. Hoy la pesquisa se realiza por espectrometría de masa en tándem, que permite en un ensayo identificar y cuantificar múltiples analitos simultáneamente. El Sistema Nacional de Pesquisa Neonatal de Uruguay accedió a esta tecnología y se está trabajando en un programa piloto para incorporar la detección de 20 enfermedades en el grupo de las aminoacidopatías, acidemias orgánicas y errores en la beta oxidación mitocondrial de ácidos grasos. En este marco, se detecta en las primeras muestras estudiadas, el primer caso de deficiencia de acil-coa-dehidrogenasa de cadena media. Es el objetivo de este trabajo el informe de este caso. Palabras clave: pesquisa neonatal * espectrometría de masa en tándem * acil CoA deshidrogenada de cadena media Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana Incorporada al Chemical Abstract Service. Código bibliográfico: ABCLDL. ISSN ISSN en línea ISSN X (CD-ROM) Summary Newborn screening for phenylketonuria began in the late 60 through the bacterial inhibition method, one test for one analyte. Nowadays, the screening is performed by tandem mass spectrometry, which makes it possible to identify and quantify multiple analytes simultaneously in only one test. The National Newborn Screening of Uruguay acquired this technology and is now working on a pilot programme to incorporate the detection of 20 diseases in the group of the defects of the metabolism of amino acids, organic acidemias and defects in the mitochondrial beta oxidation of fatty acid. From the samples studied, the first case of medium chain acyl-coa dehydrogenase deficiency was detected. It is the aim of this study the report of this case. Key words: newborn screening * tandem mass spectrometry * medium-chain acyl-coa dehydrogenase

2 88 Queijo C et al. Introducción La pesquisa neonatal comienza en la década del 60 con el propósito de identificar precozmente pacientes con fenilcetonuria (PKU), para comenzar el tratamiento lo antes posible y así evitar el retardo mental (1). Muy rápidamente, los programas de pesquisa se expandieron para incluir otros trastornos genéticos. En 1980 se introdujo la espectrometría de masas en tandem (MS/MS) en el laboratorio clínico. En la década del 90 se implementa su uso para pesquisa neonatal. Este método permite la identificación de varios analitos en un único análisis (2)(3). Actualmente el MS/MS es usado para la identificación de desórdenes de los aminoácidos, ácidos orgánicos y trastornos de la beta oxidación mitocondrial de los ácidos grasos, que detectados tempranamente permiten el inicio precoz del tratamiento y de esta manera se previene el desarrollo de la enfermedad genética específica (4)(5). A partir de la pesquisa con MS/MS, para estos tres grupos de patologías se estima una incidencia de 1 en 4000 recién nacidos (6). La oxidación de los ácidos grasos en la mitocondria tiene un rol muy importante en la producción de energía. Los ácidos grasos aportan el 80% de la energía que el organismo necesita durante las últimas etapas del ayuno. Esto se logra a través de la síntesis hepática de cuerpos cetónicos y su oxidación directa en los tejidos. El defecto más común de la beta oxidación mitocondrial de los ácidos grasos es el déficit de acil CoA deshidrogenada de cadena media (MCAD), la cual tiene una presentación casi exclusivamente hepática (7)(8). Generalmente no hay compromiso de músculo esquelético ni cardíaco. Los individuos afectados son completamente normales hasta que, luego de un período de ayuno prolongado o de un requerimiento energético importante como un proceso infeccioso y febril, se desencadena un episodio de descompensación aguda. Este se caracteriza por hipoglucemia no cetósica o hipocetósica, signos de encefalopatía aguda con letargia, depresión de la conciencia, síntomas digestivos como náuseas o vómitos, se pueden presentar convulsiones y han sido descritos casos de muerte súbita. El American College of Medical Genetics ubica la deficiencia de MCAD en primer lugar en la tabla de enfermedades recomendadas para entrar en un programa de pesquisa o screening (9). El aumento de los ésteres de acil-coa de cadena media dado por la deficiencia de MCAD resulta en el aumento de ácidos grasos de cadena media, ácidos dicarboxilicos, acilglicinas y acilcarnitinas de cadena media en plasma y orina. Se han estudiado varios marcadores para el diagnóstico de la MCAD. Los internacionalmente aceptados son el aumento de octanoilcarnitina (C8), normalmente acompañada de elevaciones de decanoilcarnitina (C10), hexanoilcarnitina (C6) y decenoilcarnitina (C10:1), así como la relación C8/C10 y C8/C2 (10). Basados en los datos de programas de pesquisa neonatal, la incidencia de MCAD es variable: 1:4900 recién nacidos en el norte de alemania (11), 1:15700 recién nacidos en Estados Unidos de Norteamérica (12), 1:25000 recién nacidos en el sur de Australia (13). Si bien en Uruguay el Sistema Nacional de Pesquisa Neonatal (SNPN) comenzó en 1994 con la detección de hipotiroidismo congénito, desde diciembre de 2008, por un préstamo no reintegrable del Banco Interamericano de Desarrollo, (1293/OC-UR BID) obtenido por un concurso de Proyectos de Desarrollo Tecnológico del Ministerio de Educación y Cultura se incorpora un MS/MS, dando inicio a un programa Piloto de Pesquisa ampliado. En el mismo se estudian algunas aminoacidopatías, acidemias orgánicas y defectos de la beta oxidación mitocondrial de ácidos grasos a todos los recién nacidos del país. El objetivo de este trabajo es presentar el primer caso de deficiencia de MCAD detectado por pesquisa neonatal mediante MS/MS en el Sistema Nacional de Pesquisa Neonatal en Uruguay. Materiales y Métodos Muestras La pesquisa neonatal se realiza a partir de muestras de sangre obtenida por punción de talón de todos los niños nacidos en Uruguay. La cobertura de nuestro SNPN es del 99% de los recién nacidos. El periodo de este estudio se extendió desde diciembre de 2008 a julio de 2009 (Programa Piloto), habiéndose procesado muestras. Se recomienda realizar la toma de muestra luego de las 40 horas de vida habiendo ingerido algún tipo de alimentación proteica. La sangre se recoge sobre papel de filtro Whatman S&S 903, se deja secar al menos cuatro horas en posición horizontal y se envía por correo al Laboratorio de Pesquisa Neonatal. Reactivos Se utilizaron solventes, (metanol y acetonitrilo) con calidad HPLC. El agua usada fue de calidad MiliQ y los reactivos (ácido fórmico, butanol-hcl), puros para análisis. Se utilizaron estándares internos comerciales (NSK-B, Cambridge Isotope Laboratories, Inc.). Estos consistieron en isotopos estables de acilcarnitinas (0,76 µmol/l 2 H 9 -carnitina; 0,19 µmol/l 2 H 3 -acetilcarnitina (C2); 0,04 µmol/l 2 H 3 -propionilcarnitina (C3); 0,04 µmol/l 2 H 3 -butirilcarnitina (C4); 0,04 µmol/l 2 H 9 -isovalerilcarnitina (C5); 0,04 µmol/l 2 H 3 -octanoilcarnitina (C8); 0,04 µmol/l 2 H 9 -miristoilcarnitina (C14); 0,08 µmol/l 2 H 3 -palmitoilcarnitina (C16)).

3 Déficit de acetil CoA deshidrogenasa de cadena media 89 PREPARACIÓN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS A partir de una gota de sangre absorbida en el papel de filtro se cortó un disco de 3 mm de diámetro y se colocó en una microplaca de 96 pocillos de polipropileno. Para controlar la calidad del procesamiento de la placa en su totalidad se adicionaron a la corrida controles de calidad proporcionados por el Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC, Estados Unidos). A cada muestra se le adicionaron 100 µl de una solución de metanol conteniendo estándares internos deuterados comerciales. Luego de 30 min de agitación, se extrajo el papel y la muestra eluida en el metanol se llevó a sequedad. Una vez culminado este paso se reconstituyó con 60 µl de butanol-hcl (3N) y se incubó tapado por 15 min a 65 ºC de forma de realizar la derivatización (butilación) de los aminoácidos y acilcarnitinas presentes en la muestra. La mezcla resultante se llevó nuevamente a sequedad y el residuo se retomó en 100 µl de fase móvil (mezcla 50:50 de acetonitrilo: agua con 1% de ácido fórmico). La muestra obtenida se introdujo al MS/MS mediante un HPLC Ultimate 3000 Dionex (Germering, Alemania). Las condiciones fueron: de 20 µl de volumen de inyección y 0,100 µl/min de flujo. El MS/MS tiene una configuración de triple cuadrupolo (API 3200, Applied Biosystems). Se analizaron todas las acilcarnitinas en modo positivo de ion precursor de m/z 85 (en un rango de 100 a 700 m/z). Se adquirieron los datos por el software Analyst y luego se procesaron mediante la aplicación informática Chemoview. La cuantificación de las acilcarnitinas se realizó en forma relativa al estándar interno deuterado correspondiente. En caso de no disponer de ningún estándar se cuantificaría con relación al estándar de m/z más cercano. Resultados En el período comprendido por el plan piloto de Pesquisa Neonatal por MS/MS, se procesaron muestras. Se encontró una cuyo perfil de acilcarnitinas fue compatible con una deficiencia de MCAD. De la muestra de punción de talón de pesquisa se obtuvo el espectro que se observa en la Figura 1B. Luego de realizado el procesamiento informático, los resultados obtenidos para el perfil de acilcarnitinas se muestran en la Tabla I. De acuerdo con el protocolo de trabajo se repitió el análisis por duplicado en la primera muestra. Al haber obtenido un resultado igual se descartó un error analítico. Se solicitó la toma de una segunda muestra de sangre en papel, obteniéndose un resultado similar, como se ve en la Figura 2 y en la Tabla I: incremento de la concentración en sangre de C8 y C10. Caso clínico L.S es una recién nacida de sexo femenino de 2 días de vida al momento de la primera muestra de sangre para pesquisa y de 62 días en la segunda obtención de muestra de sangre. Embarazo complicado con infección urinaria. Parto de término. Peso del recién nacido 3380 g, longitud 47,5 cm, perímetro cefálico 35 cm. Test de Apgar 9/10. Alta habitual sin patología perinatal. Tiene un hermano varón de 2 años de edad. Crecimiento y desarrollo normal. Discusión En las muestras de L. S. el perfil de acilcarnitinas encontrado fue compatible con el diagnostico de deficiencia de MCAD (Tabla I). Si bien los marcadores referidos son altamente específicos para esta afección, se requiere de estudios confirmatorios para llegar a un diagnóstico definitivo. Dado que al momento se trata de un Programa Piloto, se enviaron gotas de sangre de ambas muestras al Laboratorio de FESEN (Fundación para el Estudio de las Enfermedades Neurometabólicas) de Argentina, quien verificó los resultados. El SNPN cuenta con una policlínica de seguimiento y tratamiento formada por un equipo multidisciplinario al cual se refirió la paciente. Se efectuó estudio confirmatorio: ácidos orgánicos en orina por cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas (GC-MS), el cual, mostró aumento de hexanoilglicina y octanoilglicina. Se confirmó así el diagnóstico de deficiencia de MCAD en L.S. Aún no se cuenta con el estudio molecular de esta paciente. Tabla I. Resultados obtenidos en la primera y segunda muestra de la paciente. Analito Punto de corte Muestra Muestra (μmol/l) (μmol/l) (μmol/l) C8 0,21 0,76 3,04 1,64 C10 0,27 0,30 0,73 0,43 C8/C10 2,57 3,00 4,16 3,83

4 90 Queijo C et al. A B Figura 1. Espectro de masas (ion precursor 85 m/z) de acilcarnitinas. A, paciente sin alteraciones; B, primera muestra de la paciente ( )

5 Déficit de acetil CoA deshidrogenasa de cadena media 91 Figura 2. Espectro de masas (ion precursor 85 m/z) de acilcarnitinas de la segunda muestra de la paciente ( ) Por tratarse de una situación de alto riesgo de recurrencia en la hermandad, dado que el déficit de MCAD es una afección genética con mecanismo de herencia autosómico recesivo, se estudió al único hermano de la paciente mediante MS/MS, obteniéndose un perfil de acilcarnitinas normal (Figura 3) (Tabla II). Para la obtención de la muestra se indicó un ayuno algo mayor al habitual para este paciente. Se informó a los padres respecto al diagnóstico una vez confirmado el mismo, así como de la situación de riesgo, los síntomas de alarma, las medidas a tomar en domicilio y la consulta inmediata ante signos y síntomas de alarma. Se les proporcionó un instructivo con todas las indicaciones que incluían evitar ayunos prolongados y todas las primeras medidas a tomar de evaluación clínica y paraclínica por parte del pediatra ante la consulta en sala de emergencia. Se mantuvieron controles regulares por parte del equipo y contacto permanente con el pediatra de la paciente. Su crecimiento y desarrollo con 10 meses al momento actual ha sido adecuado. Se han presentado episodios febriles por catarro respiratorio sin hipoglicemias ni descompensaciones clínicas. Se debe recordar que luego de un período de ayuno prolongado o de un requerimiento energético importante como un proceso infeccioso y febril se desencadena un episodio de descompensación. Estos se caracterizan por hipoglucemia no cetósica o hipocetósica, signos de encefalopatía aguda con letargia, depresión de la conciencia, síntomas Tabla II. Resultados obtenidos en la muestra del hermano de la paciente. Analito Punto de corte (μmol/l) Muestra (μmol/l) C8 0,21 0, C10 0,27 0, C8/C10 2,57 3, digestivos como náuseas o vómitos, se pueden presentar convulsiones, síndrome Reye-like y se han descrito casos de muerte súbita (14)(15). Es de destacar que si bien en la gran mayoría de los casos no hay producción de cuerpos cetónicos, se han descripto casos en los que hay hipoglicemia con cetosis (8). Es importante ante un paciente con hipoglicemias con cetosis evaluar perfil de acil carnitinas. Todas estas complicaciones se han podido evitar en la paciente detectada. Las características de esta patología han llevado al estudio de varios integrantes de algunas familias, demostrándose la gran variabilidad en su expresión clínica, que puede ir desde muerte súbita en el niño hasta adultos sanos (15). Como puede verse en la Tabla III son múltiples los defectos del ciclo de la beta oxidación de los ácidos grasos. El fenotipo clínico de varios de ellos es similar. Los signos clínicos generalmente son por afectación miocárdica, hepática y/o músculo esquelética. En el caso de la MCAD las manifestaciones clínicas son exclusivamente por afectación hepática.

6 92 Queijo C et al. Figura 3. Espectro de masas (ion precursor 85 m/z) de acilcarnitinas del hermano de la paciente. Trabajos como el de Venditti et al (16) muestran que la pesquisa neonatal para deficiencia de MCAD tiene una relación costo beneficio muy favorable. La incidencia para el SNPN ha sido 1: recién nacidos. Se considera que esta cifra se irá modificando en la medida que se obtenga un número mayor de recién nacidos estudiados. Conclusiones La incorporación en Uruguay de la espectrometría de masas en tándem al SNPN permitió el diagnóstico de una deficiencia de MCAD. Este hallazgo facilita la intervención terapéutica temprana evitando descompensaciones graves con riesgo Tabla III. Desórdenes de la oxidación mitocondrial de ácidos grasos. Adaptado de Ref. 14. Manifestaciones clínicas Defecto Hepática Cardiaca Músculo esquelético Agudo Crónico Ciclo de la Beta-Oxidación Acil CoA deshidrogenasa VLCAD MCAD + SCAD + 3 hidroxiacil CoA deshidrogenasa LCHAD SCHAD + + MCKT + + DER + DER, 2,4 dienoil-coenzima A reductasa; LCHAD, 3-hidroxiacil-coenzima A deshidrogenasa de cadena larga; MCAD, acil-coenzima A deshidrogenasa de cadena media; MCKT, cetoacil-coa tiolasa de cadena media; SCAD, acil-coenzima A deshidrogenasa de cadena corta; SCHAD, 3 hidroxiacil-coenzima A deshidrogenasa de cadena corta; VLCAD, acil-coenzima A deshidrogenasa de cadena muy larga.

7 Déficit de acetil CoA deshidrogenasa de cadena media 93 vital. Se estudió a su hermano en situación de alto riesgo genético para igual afección, descartándola. Además, se realiza asesoramiento genético de alto riesgo a los padres ante futura descendencia con independencia del sexo fetal. AGRADECIMIENTOS A FESEN por la desinteresada colaboración en la verificación de los resultados. CORRESPONDENCIA DRA. GRACIELA QUEIRUGA gqueiruga@bps.gub.uy Referencias bibliográficas 1. Guthrie R, Susi A. A simple phenylalanine method for detecting phenylketonuria in large populations of newborn infants. Pediatrics 1993; 32: Sweetman L. Newborn screening by tandem mass spectrometry: gaining experience. Clin Chem 2001; 47(11): Chace DH. Mass spectrometry in the clinical laboratory. Chem Re 2001; 101(2): Mass Spectrometry in the Clinical Laboratory: General Principles and Guidance; Approved Guideline. CLSI C50-A Vol. 27 Nº Garg U, Dasouki M. Expanded newborn screening of inherited metabolic disorders by tandem mass spectrometry: Clinical and laboratory aspects. Clin Chem 2006; 39: Dietzen D, Rinaldo P, Whitley R, Rhead W, Hannon H, Garg, U, et al. National academy of Clinical Biochemistry Laboratory Medicine Practice Guidelines: Follow- Up Testing for Metabolic Disease Identified by Expanded Newborn Screening Using Tandem Mass Spectrometry Executive Summary. Clin Chem 2009; 55:9: Coates PM, Stanley CA. Inherited disorders of mitochondrial fatty acid oxidation. Prog Liver Dis 1992; 10: Iafolla AK, Thompson RJ, Roe CR. Medium-chain acylcoenzyme A dehydrogenase deficiency: clinical course in 120 affected children. J Pediatr 1994; 124; Watson M, Lloyd-Puryear M, Mann M, Rinaldo P, Howell R. Newborn screening: toward a uniform screening panel and system. Genet Med 2006:8(5, Suppl): 12S 252S. 10. Chace D, Hillman S, Van Hove J, Naylor E. Rapid diagnosis of MCAD deficiency: quantitative analysis of octanoylcarnitine and other acylcarnitines in newborn blood spots by tandem mass spectrometry. Clin Chem 1997; 43(11): Sander S, Janzen N, Janetzky B, Scholl S, Steuerwald U, Schafer J, et al. Neonatal screening for medium chain acyl-coa deficiency: high incidence in Lower Saxony (northern Germany). Eur J Pediatr 2001; 160: Chace DH, Kalas TA, Naylor EW. The application of tandem mass spectrometry to neonatal screening for inherited disorders of intermediary metabolism. Annu Rev Genomics Hum Genet 2002; 3: Carpenter K, Wiley V, Sim KG, Heath D, Wilcken B. Evaluation of newborn screening for medium chain acyl-coa dehydrogenase deficiency in 275,000 babies. Arch Dis Child Fetal Neonatal 2001; 85: F Stanley CA, Bennett MJ, Mayatepek E. Disorders of mitochondrial fatty acid oxidation and related metabolic pathways. Inborn Metabolic Diseases. Diagnosis and Treatment. Fernandes, Saudubray, van den Berghe, Walter.Eds. Springer-Verlag Duran M, Hofkamp M, Rhead WJ, Saudubray JM, Wadman SK. Sudden child death and healthy affected family members with medium- chain acyl-coenzyme A dehydrogenase deficiency. Pediatrics 1986; 78: Venditti LN, Venditti CP, Berry GT, Kaplan PB, Kaye EM, Glick H, et al. Newborn screening by tandem mass spectrometry for medium-chain Acyl-CoA dehydrogenase deficiency: a cost-effectiveness analysis. Pediatrics 2003; 112: Aceptado para su publicación el 3 de febrero de 2011