obtención y multiplicación de plantas de fresa libres de virus

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1 obtención y multiplicación de plantas de fresa libres de virus 1

2 CONTENIDO INTRODUCCIÓN ETAPA I. SANEAMIENTO DE PLANTAS POR TÉCNICAS DE CULTIVO in vitro ETAPA II. EVALUACIÓN SANITARIA ETAPA III. EXPOSICIÓN DE PLANTAS A LUZ ARTIFICIAL PARA ESTIMULAR LA PRODUCCION DE ESTOLONES ETAPA IV. MULTIPLICACIÓN DE PLANTAS BAJO CUBIERTA ESTABLECIMIENTO DE VIVERO ANEXO 1. Composición de sales inorgánicas del medio MS ANEXO 2. Composición de medios de cultivo ANEXO 3. Esquema para la obtención de plantas de fresa libres de virus por cultivo in vitro de meristemos ANEXO 4. Esquema para la producción de planta madre de fresa libre de virus obtención y multiplicación de plantas de fresa libres de virus

3 OBTENCION Y MULTIPLICACION DE PLANTAS DE FRESA LIBRES DE VIRUS Patricia Eugenia López González 1 Kunio Inoue 2 INTRODUCCION En Morelos, la fresa es un cultivo alternativo de nueva introducción y su producción comercial depende de la importación de la planta madre. Estas plantas no tienen garantía de sanidad y la presencia de patógenos, entre ellos los llamados virus, afectan negativamente el rendimiento; por otra parte, su multiplicación por más de un ciclo bajo condiciones naturales se dificulta, y la planta pierde calidad. Mediante la aplicación de técnicas de cultivo in vitro, evaluación sanitaria y métodos adecuados para estimular la producción de estolones, se puede producir planta madre nacional de alta calidad fitosanitaria para el establecimiento de viveros comerciales. El siguiente esquema para la obtención y multiplicación de plantas de fresa libres de virus consta de cuatro etapas y se aplicó a las variedades Camarroza y Chandler, que son las más importantes en la entidad. I. Saneamiento de plantas por técnicas de cultivo in vitro. II. Evaluación sanitaria. 1 Investigador Titular del Programa de Biotecnología. SAGARPA, INIFAP, CIRCE. 2 Experto de largo plazo. INIFAP, JICA, CIRCE. obtención y multiplicación de plantas de fresa libres de virus 3

4 III. Exposición de plantas a luz artificial para estimular la producción de estolones. IV. Multiplicación de plantas bajo cubierta. Las plantas producidas por este método son apropiadas para ser utilizadas como planta madre para el establecimiento de los viveros comerciales. ETAPA I. SANEAMIENTO DE PLANTAS POR TECNICAS DE CULTIVO in vitro. Aislamiento y cultivo de meristemos a) Desinfectar superficialmente los estolones sumergiéndolos en una solución de alcohol al 70% durante 5 segundos y de cloro comercial al 10% por 10 minutos. Enjuagar tres veces con agua destilada esterilizada. b) Aislar los meristemos de mm en un ambiente aséptico, con el auxilio de una campana de flujo laminar, instrumental de disección y un microscopio estereoscópico. Se debe prevenir la desecación y evitar daños físicos al meristemo. c) Sembrar los meristemos en un medio de cultivo sólido complementado con vitaminas, aminoácidos, una fuente de carbohidratos y reguladores del crecimiento (Anexo 2). d) Incubar a una temperatura de 26 ± 2 ºC; humedad relativa > 50%; fotoperiodo 16/8 hr luz/oscuridad (mantener las mismas condiciones físicas controladas en cada una de las etapas del cultivo in vitro). e) Al cabo de 70 a 90 días de incubación, se observa una masa de yemas axilares. 4 obtención y multiplicación de plantas de fresa libres de virus

5 Micropropagación a) Aislar los brotes axilares desarrollados a partir de los meristemos, y subcultivarlos individualmente en el mismo medio fresco cada 4-6 semanas. Se sugiere no realizar más de 4 propagaciones in vitro. b) Seleccionar los brotes más grandes para el enraizamiento y los más pequeños para continuar la multiplicación. Fig. 1. Aspecto de los brotes axilares de fresa durante la micropropagación. Enraizamiento Aislar los brotes y transferirlos a un medio nutritivo sin reguladores del crecimiento (Anexo 2). El desarrollo de raíces se presenta después de los 30 días de incubación. obtención y multiplicación de plantas de fresa libres de virus 5

6 Aclimatación a) Seleccionar plantas obtenidas in vitro mayores de 4 cm y con raíces vigorosas. Lavar las raíces con agua corriente hasta eliminar completamente los residuos de agar. b) Utilizar un sustrato esterilizado preparado con peatmoss +vermiculita en proporción 1:1. Se sugiere utilizar charolas para almácigo de 50 cavidades. Fertilizar las plantas cada tercer día con una solución de la fórmula NPK (1g/l). c) Las plantas deben cubrirse con bolsas de plástico transparente para conservar alta humedad relativa; esta cubierta se retira gradualmente hasta su eliminación total. d) La aclimatación de las plantas requiere aproximadamente de 20 días y se sugiere realizarla entre los meses de diciembre y enero. Fig 2. Vitroplantas en aclimatación 6 obtención y multiplicación de plantas de fresa libres de virus

7 e) Para estimular la producción de estolones estas plantas deben ser expuestas a luz artificial 1 hr a la media noche en todo el proceso se aclimatación. Consultar la sección Etapa III: Trasplante a maceta (c-f) y Tratamiento con luz artificial. ETAPA II. EVALUACION SANITARIA Se realiza mediante un injerto de hoja sobre plantas indicadoras de especies silvestres de fresa, y se aplica para comprobar la ausencia de virus en las plantas obtenidas en el laboratorio. Comprende los siguientes pasos: a) Tomar hojas maduras de plantas indicadoras de Fragaria vesca ( clones: EMC y UC-5) así como de las plantas prueba obtenidas por cultivo in vitro. b) Retirar el foliolo central de la planta prueba y prepararla en forma de cuña. Mantener esa porción en agua para evitar la deshidratación. c) Eliminar el foliolo central de la planta indicadora y realizar una incisión a lo largo y por el centro del peciolo, de longitud similar a la de la cuña del foliolo preparado anteriormente. d) Insertar el foliolo de la planta que se probará, en el corte del peciolo de la planta indicadora. Atar con banda de polietileno. e) Cubrir el injerto así preparado, con una bolsa de plástico transparente la cual se retirará gradualmente. Al cabo de 2 a 5 semanas observar si hay síntomas en las nuevas hojas desarrolladas. La ausencia de síntomas señala la sanidad de los materiales evaluados. f) Eliminar plantas con síntomas de mosaicos, moteado, deformaciones de hojas y tallos, amarillamiento, achaparramiento, anillos cloróticos o necróticos. obtención y multiplicación de plantas de fresa libres de virus 7

8 g) Las plantas libres de virus se micropropagarán a partir de los cultivos réplica que permanecieron in vitro. (Foto: K. Ohkoshi) Fig. 3. Injerto de hoja sobre planta indicadora de fresa. Se muestran síntomas de virosis como mosaicos y amarillamiento en el clon EMC de F. vesca. ETAPA III. EXPOSICION DE PLANTAS A LUZ ARTIFICIAL PARA ESTIMULAR LA PRODUCCION DE ESTOLONES Obtención de planta madre para el primer año De las plantas libres de virus se puede emplear la primera o segunda generación obtenida fuera del laboratorio. Trasplante a maceta a) Se recomienda utilizar plantas cosechadas en el mes de octubre. 8 obtención y multiplicación de plantas de fresa libres de virus

9 b) Podar las hojas más grandes de la plantas y proteger las raíces de la deshidratación antes del trasplante. c) Trasplantar en macetas de 10 cm de diámetro con suelo agrícola esterilizado, cuidando que las raíces no queden dobladas. d) Evitar que el cogollo de la planta quede bajo el nivel del suelo. e) Fertilizar a los 30 días del trasplante, aplicando 3 gr de triple 17, mateado en cada planta. El fertilizante debe taparse y se evitará dejarlo en contacto con la planta. Repetir la aplicación cada mes hasta el trasplante a piso (Cuadro 1). f) Colocar las macetas bajo cubierta de malla contra insectos, y evitar su contacto directo con el piso. Tratamiento con luz artificial a) Mantener las plantas en iluminación 1 hr a la media noche a partir del mes de noviembre, hasta la fecha de trasplante a piso (Cuadro 1). b) Se sugiere utilizar un foco de 60 w para una superficie de 4 m² en la que se colocan 304 macetas. Ubicar los focos 1.5 m arriba de las macetas. c) La aparición de estolones se presenta después de los 40 días de iniciar la exposición con luz artificial. Cortar los botones florales. d) Las plantas tratadas pueden utilizarse para la producción de planta madre para el segundo año o como planta madre para el vivero comercial. obtención y multiplicación de plantas de fresa libres de virus 9

10 Fig. 4. Desarrollo de estolones en plantas expuestas al tratamiento de luz artificial ETAPA IV. MULTIPLICACION DE PLANTAS BAJO CUBIERTA Todas las multiplicaciones de las plantas libres de virus fuera del laboratorio y antes de establecer los viveros comerciales, deben realizarse bajo cubierta de malla contra insectos y con un estricto control de plagas y enfermedades. Producción de planta madre para el segundo año a) Plantas tratadas con luz artificial se trasplantan a camas con suelo previamente desinfectado. b) En cuanto a la preparación de suelo, época de trasplante, densidad, fertilización, plagas y enfermedades se describen en la sección de establecimiento de vivero. c) Cada planta tratada con luz artificial produce de plantas hijas. 10 obtención y multiplicación de plantas de fresa libres de virus

11 d) Las plantas se cosechan en octubre y antes del establecimiento del vivero, los materiales se someten nuevamente al tratamiento con luz artificial para estimular la producción de estolones. Fig 5. Producción de planta madre bajo cubierta de malla contra insectos ESTABLECIMIENTO DE VIVERO Obtención de la planta madre Los viveros deben utilizar plantas que no estén separadas más de tres generaciones de una planta libre de virus obtenida en el laboratorio. Selección del terreno a) Utilizar terrenos sin problemas de salinidad y drenaje. obtención y multiplicación de plantas de fresa libres de virus 11

12 b) Evitar establecer el vivero en donde se haya cultivado fresa, papa, jitomate, pepino, melón y ornamentales durante los tres años anteriores. c) El vivero debe estar alejado de la plantación comercial para reducir la presencia de plagas y enfermedades. Preparación del terreno a) El suelo debe prepararse mediante un barbecho a 30 cm de profundidad, una cruza y varios pasos de rastra, hasta dejar el suelo mullido, a continuación se debe nivelar. b) Preparar camas de 1.10 m de separación y de 15 a 20 cm de altura. Cuadro 1. Epoca del trasplante Variedad Localidad msnm Epoca de trasplante Chandler Zacatepec feb-30 marzo Camaroza marzo Chandler Oacalco marzo Tepoztlán Forma de trasplante a) A las plantas tratadas con luz artificial se les retiran las macetas, y sin eliminar el suelo que cubre las raíces se trasplantan cuidando que el cuello de la raíz quede al nivel del suelo. b) Los estolones que estén presentes deben mantenerse en contacto con el suelo para su enraizamiento. 12 obtención y multiplicación de plantas de fresa libres de virus

13 Densidad de plantas por hectárea Trasplantar a una hilera y con una distancia entre planta de 1 m, lo que dará un total de plantas /ha. (Fig. 6) Fig. 6 Trasplante a 1 hilera en camas de 1.10 m de separación Fertilización y control de maleza a) Se recomienda la fórmula de N-P-K la cual se obtiene con 585 kg de sulfato de amonio, 308 kg de superfosfato de calcio simple y 120 kg de sulfato de potasio. b) Realizar dos aplicaciones: la primera a los 30 días del trasplante aplicando la mitad de nitrógeno y todo el fósforo y potasio; la segunda a los 60 días de la primera aplicación, con el resto del nitrógeno. c) Aplicar el fertilizante mateado a cada planta madre, tapándolo, y evitando que quede en contacto directo con la planta. obtención y multiplicación de plantas de fresa libres de virus 13

14 d) Mantener el vivero libre de malas hierbas mediante deshierbes continuos. Riegos a) Regar el terreno antes y después del trasplante de tal manera que el suelo quede bien húmedo. b) Después del trasplante los riegos deben ser ligeros y frecuentes con agua de buena calidad y sin exceso de sales. Plagas Las principales plagas son araña roja, trips, pulgones y gallina ciega; las tres primeras se controlan utilizando 2 lt/ha de Thiodan 35%; Malation 1000 E 1 lt/ha; para la tercera, aplicar 12 kg/ha de Furadan 10G. Enfermedades Se presentan principalmente antracnosis y mancha o peca de la hoja; para la primera aplicar Folpan 80 PH 1 a 2 kg/ha; para la segunda aplicar Direne 50% PH 2-4 kg/ha. Cosecha La cosecha se realiza entre el 15 de agosto y el 30 de septiembre y debe efectuarse en terreno húmedo (Fig. 7). Clasificación de la planta Clasificar las plantas por diámetro de la corona seleccionando las de más de 5 cm porque son las de mayor rendimiento. Las plantas se deben proteger de la deshidratación manteniéndolas en contacto con el suelo húmedo y sombreado hasta su trasplante definitivo en el lote de producción frutícola (Fig. 8). 14 obtención y multiplicación de plantas de fresa libres de virus

15 Fig. 7 Cosecha de planta Fig. 8. Clasificación de planta por el diámetro de la corona obtención y multiplicación de plantas de fresa libres de virus 15

16 Anexo 1. Composición de sales inorgánicas del medio MS Compuesto NH 4 NO 3 KNO 3 CaCl.2H 2 O KH 2 PO 4 MgSO 4.7H 2 O MnSO 4.4H 2 O H 3 BO 3 ZnSO 4.4H 2 0 Na 2 MoO 4.2H 2 O KI CoCl.6H 2 O CuSO 4.5H 2 O Na 2 EDTA FeSO 4.7H 2 O Concentración ( mg/litro) MS= Murashige y Skoog, 1962 Anexo 2. Composición de medios de cultivo Constituyentes Sales inorgánicas Inositol Tiamina-HCl Piridoxina-HCl Acido nicotínico Glicina Sacarosa Agar BAP AIB GA3 Concentración (mg/litro ) Cultivo de meristemos y micropropagación MS , , Enraizamiento MS , , BAP = 6-benzil-aminopurina AIB = ácido 3- indolbutírico GA3 = ácido giberélico 16 obtención y multiplicación de plantas de fresa libres de virus

17 Anexo 3. Esquema para la obtención de plantas de fresa libres de virus a partir del cultivo in vitro de meristemos Laboratorio Saneamiento por cultivo in vitro de meristemos Micropropagación Aclimatación Bajo cubierta Evaluación sanitaria Luz artificial obtención y multiplicación de plantas de fresa libres de virus 17

18 Anexo 4. Esquema para la producción de planta madre de fresa libre de virus Laboratorio Plantas libres de virus Bajo cubierta Vitroplantas en maceta con luz artificial (16 plantas de laboratorio) Planta madre segundo año Propagación en piso (16 plantas / 32 m 2 ) Plantas en maceta con luz artificial (1 200 plantas/32m 2 ) Cielo abierto Vivero (1000 plantas x 100) Cultivo comercial de producción frutícola ( 100 mil plantas / ha)