6. MATERIALES Y MÉTODOS. 6.1 Materia prima
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- María Ángeles Montero Soriano
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1 6. MATERIALES Y MÉTODOS 6.1 Materia prima Se utilizó fresa fresca variedad Camarosa adquirida en una tienda local en Valencia, España, la cual fue usada inmediatamente después de su adquisición. 6.2 Métodos Caracterización de la pulpa fresa Las fresas se escogen, se lavan y se les retira el pedúnculo y las hojas. La fruta es triturada en un procesador eléctrico de alimentos (Thermomix TM 21, Vorerk, España), aplicando velocidad alta por 4 min, para obtener una pulpa homogénea, a la que se le realizan los siguientes análisis fisicoquímicos por triplicado: a) Humedad (g agua/1 g muestra): Se determina de acuerdo al método 2.13 de la AOAC (AOAC, 198) usando una estufa a vacío modelo Vaciotem, J.P. Selecta, España a 6 C hasta alcanzar peso constante. b) Sólidos solubles totales ( Bx): Se determinan con un refractómetro Atago Pocket, pal-1, Atago Co Ltd., Japón. c) Actividad de agua: Se determina con un medidor de actividad de agua modelo FA-st lab 1, GBX, Francia. d) ph: Se determina con un phmetro modelo SevenEasy Conductivity, Mettler- Toledo, Suiza. e) Acidez (% ácido cítrico): Se determina por titulación con NaOH.1 N hasta llegar a un ph de 8.1, de acuerdo al método de la AOAC (AOAC, 198) Obtención de los polvos de pulpa de fresa Se obtiene la pulpa de fresa de la misma manera que en el apartado anterior. Para obtener las mezclas se aplica velocidad alta por 1 min en el mismo procesador eléctrico, posteriormente se añade maltodextrina de alto ED ( ) o goma arábiga en la
2 proporción de 1 kg/1 kg de sólidos solubles de la pulpa de fresa (Telis y Martínez-Navarrete, 29), con base en la determinación de Bx, y se vuelve a aplicar velocidad alta por 3 min. Se usa maltodextrina (ED ) de Sigma-Aldrich (EE.UU.) y goma arábiga de Panreac (Barcelona, España). Aproximadamente 25 g de la pulpa de fresa y de las mezclas son vaciados en bandejas de aluminio (forradas en su interior también con papel de aluminio) formando una capa delgada de alrededor de.5 cm, las cuales son llevadas a congelación a -4 C por 48 horas antes de la liofilización en un liofilizador nivel laboratorio (modelo Lioalfa-6, Telstar, Gran Bretaña) a 1-2 Pa y 4 C por 72 horas. Después de la liofilización, los productos secos son molidos en una máquina picadora (modelo A32R1, Moulinex, España) para generar polvos, a los que inmediatamente se les determina la humedad inicial en una estufa a vacío (modelo Vaciotem, J.P. Selecta, España) a 6 C, de acuerdo al método 2.13 de la AOAC (AOAC, 198) Generación de isotermas Muestras de aproximadamente 2 g de los tres productos en polvo: fresa liofilizada, fresa con maltodextrina (ED ) y fresa con goma arábiga, se equilibran a 2 C en cámaras herméticas con soluciones saturadas de sales para mantener una actividad de agua (humedad relativa del ambiente) constante. Las sales a emplear con su correspondiente actividad de agua son LiCl:.113, CH 3 COOK:.23, MgCl 2 :.33, K 2 CO 3 :.43, Mg(NO 3 ) 2 :.52, NaNO 2 :.65, NaCl:.755 y KCl:.85. Las muestras se colocan en las cámaras inmediatamente después de la liofilización y, en caso de no ser así, se ponen en bolsas de plástico, las cuales se sellan a vacío y se mantienen dentro de un desecador para evitar la ganancia de humedad. Las muestras de cada tipo de producto se colocan en crisoles de vidrio dentro de cada cámara, de manera que se tengan seis crisoles por cámara. Antes de colocar las muestras en las cámaras se registra el peso de cada crisol vacío y con muestra y, una vez en las cámaras, se registra el peso de cada muestra (incluido el crisol) semanalmente hasta llegar al equilibrio, es decir, cuando el peso de las muestras se considera constante (variación < ±.5 g) (Mosquera et al., 29). La humedad en el equilibrio ( e ) experimental en base seca (g de agua/g de s.s.) de los tres productos a cada actividad de agua se calcula en base al método gravimétrico, usando los pesos finales e iniciales de las muestras y la humedad inicial (según el tipo de producto), tal como se muestra en la Ec. 5 (Martínez et al., 2):
3 e m x m (5) m 1 x donde m es la masa inicial de la muestra en g, x la humedad inicial de la muestra en g agua/g producto y m la diferencia de peso del adsorbente o muestra. Con los datos experimentales promedio de cada producto se construyen las isotermas Determinación de temperaturas de transición vítrea La temperatura de transición vítrea se determina en un calorímetro de barrido diferencial (DSC) modelo DSC 22CU-SSC52, Seiko Instruments Inc., Japón, una vez que las muestras de los tres productos han alcanzado el equilibrio. Para ello, las muestras se sacan de las cámaras y se toman cerca de 6 mg que se colocan directamente en los platillos del DSC (P/N SSCC8, Seiko Instruments, Japón), mismos que son rápidamente pesados y sellados para proteger las muestras de la ganancia de humedad. La velocidad de calentamiento en el equipo es de 5 C/min y el rango de temperaturas varía entre -1 C y 2 C, dependiendo del contenido de humedad y del tipo de producto. Se toma como referencia un platillo vacío y se usa el nitrógeno líquido para el enfriamiento de las muestras antes de las corridas. Los valores de las temperaturas de inicio y final de la transición vítrea arrojados por el DSC se usan para obtener la temperatura en el punto medio, que se considera como la Tg característica (Telis y Martínez-Navarrete, 29). Se grafican los valores promedio de las temperaturas de transición vítrea experimentales contra la humedad en el equilibrio (base húmeda) experimental promedio a cada actividad de agua Modelación de los datos Modelación de los datos de sorción Los datos experimentales promedio de humedad en el equilibrio de los tres productos a las diferentes actividades de agua (isotermas) son ajustados con el modelo de GAB (Ec. 1) para predecir la humedad en el equilibrio a cualquier actividad de agua o viceversa. La Ec. 1 reordenada de otra forma resulta en un polinomio de segundo grado:
4 a e 1 C 2 1 C 2 K a a C K C C (6) De esta manera, el ajuste se realiza graficando el término del lado izquierdo de la Ec. 6 contra la a y aplicando regresión polinomial para obtener una parábola cuyo comportamiento está definido por una ecuación de segundo grado, de la cual se obtienen las constantes del modelo resolviendo la Ec. 7, 8 y 9 por el método matemático de sustitución sucesiva. 1 C K c (7) C 2 b C (8) K 1 C C a (9) Modelación de las Tg experimentales Los valores experimentales de Tg de los tres productos en el equilibrio a cada a son ajustados con el modelo de Gordon y Taylor (Ec. 4) para predecir la Tg de la pulpa de fresa liofilizada y de las mezclas anhidras a cualquier humedad o actividad de agua. El ajuste se realiza reordenando la Ec. 4 como un polinomio de primer grado: Tg Tg s x k Tg 1 x Tg (1) donde la Tg experimental se grafica contra el término de la derecha (x (Tg -Tg)/1-x ) y se aplica regresión no lineal para obtener una ecuación de primer orden que describa el comportamiento de los datos, de la cual se obtienen directamente las constantes del modelo (k=m y Tg s =b). Para el ajuste se emplea el softare Origyn 6.1. Tanto en la Ec. 4
5 como en la 1, x corresponde a la humedad en el equilibrio ( e en la Ec. 1) en base húmeda (g agua/g producto) Diagramas de Estado (DE) Los datos experimentales de humedad y Tg de los tres productos obtenidos a distintas actividades de agua y modelados mediante las ecuaciones de GAB y Gordon y Taylor respectivamente, se analizan conjuntamente en diagramas de estado para observar la relación entre humedad, actividad de agua y temperatura de transición vítrea. En estos diagramas se puede definir para un determinada temperatura de almacenamiento la actividad de agua y humedad críticas, por arriba de las cuales los polvos de fresa liofilizados comienzan a deteriorase. También se pueden hacer recomendaciones de las mejores condiciones de almacenamiento del producto para mantenerlo estable (Martínez et al., 2) Análisis del color y pruebas de compresión mecánica Para el análisis de color y las pruebas de compresión mecánica se colocan igualmente muestras de aproximadamente 2 g de cada producto en crisoles dentro de cámaras con las mismas sales que se usan para la generación de isotermas y se procede a realizar las determinaciones una vez alcanzado el equilibrio. También se realizan estos análisis a las muestras recién liofilizadas (antes de colocarlas en las cámaras). El cambio en el estado físico de los polvos se analiza mediantes pruebas de compresión mecánica que se llevan a cabo con un texturómetro TA-XT Plus (Stable Micro Systems, Gran Bretaña), usando una sonda cilíndrica de 1 mm de diámetro. Las muestras de polvos de fresa en el equilibrio a las diferentes actividades de agua son colocadas en un recipiente circular de aluminio de 11 mm de diámetro y 5.5 mm de altura. La parte de abajo del recipiente que contiene la muestra es hueca, por lo que se usa un disco de polietileno deslizante de 1 mm de diámetro y 1 mm de espesor para cubrir el hueco. Durante las pruebas de compresión, el recipiente se mantiene en una posición fija, adecuándolo a una cavidad en el equipo de diámetro sólo ligeramente mayor que el del recipiente. El recipiente se llena con muestra suficientemente y se coloca en la cavidad, para entonces proceder a la compresión a una distancia establecida de 3 mm y una velocidad constante de
6 .5 mm/s. La fuerza máxima obtenida durante estas pruebas se reporta como la fuerza máxima para deformar el producto (Telis y Martínez-Navarrete, 29). Las mediciones de color se realizan antes de las pruebas de compresión usando el mismo recipiente circular. El recipiente se invierte rápidamente sobre un pequeño vidrio reflectante (CR-A51, Minolta Camera, Japón) que es fijado sobre los lentes de un espectrofotómetro (modelo CM-36d, Minolta Camera, Japón), dando una ventana de medición de 6 mm de diámetro. Finalmente, la muestra es forzada contra la superficie del vidrio empujando el disco de polietileno de la parte inferior del recipiente, para así obtener una superficie y espesor más uniformes para los ensayos de color midiendo las coordenadas colorimétricas CIEL*a*b* con un iluminante D65 y un observador 1 (Telis y Martínez-Navarrete, 29). En este sistema, la coordenada L* denota la luminosidad en una escala de a 1, donde corresponde al negro y 1 al blanco; a*denota rojo para valores (+) y verde para (-); y b* representa la variación de amarillo (+) a azul (-). Se determinan también con el equipo los valores de croma (C*) y tono (h*) de las muestras recién liofilizadas, así como las diferencias netas de color ( E*) de las muestras en el equilibrio a cada actividad de agua con respecto a las muestras recién liofilizadas de cada producto (estándar) Análisis de microorganismos Se analiza el contenido de bacterias mesófilas aerobias (BMA) y mohos y levaduras en la fresa liofilizada y fresa con goma arábiga. Para este análisis, se colocan muestras de entre 1.5 y 2 g aproximadamente en crisoles dentro de las cámaras con KCl. Se tienen ocho cámaras, la mitad de ellas contienen crisoles con fresa liofilizada y la otra mitad crisoles con fresa con goma arábiga. De las cuatro cámaras de un producto, dos corresponden a muestras que se analizan antes equilibrio y las otras dos a muestras que se dejan en las cámaras después del equilibrio para ser analizadas. Los análisis de las muestras antes del equilibrio se realizan al tiempo (muestras recién liofilizadas) y a los 4, 7, 1 y 17 días de almacenamiento en las cámaras de KCl, mientras que los análisis después del equilibrio se realizan a los 46 y 51 días en las cámaras. Las siembras se realizan de acuerdo al método horizontal para el recuento de microorganismos a 3 C basado en la norma NF V 8-51 (Allaert y Escolá, 22), que consiste en siembra en profundidad con el agar para recuento (PCA) usando temperatura y
7 tiempo de incubación de 3 C y 48 horas respectivamente; así como de acuerdo al método horizontal para el recuento de levaduras y mohos basado en la norma ISO 7954 y en la norma XF V 8-59, reportadas ambas por Allaert y Escolá (22) y que corresponden a siembra en profundidad y superficie respectivamente, utilizando como medio de cultivo agar glucosa y cloranfenicol (CGA) con una temperatura de 25 C y 5 días de incubación Análisis estadístico de resultados La evaluación estadística de los valores experimentales de humedad inicial, e y Tg de los tres productos, así como la evaluación del color, compresión mecánica y microorganismos en los productos recién liofilizados, se realiza con el softare Minitab 14 mediante análisis de varianza ANOVA simple aplicando el modelo de Tukey de comparación múltiple de medias. La evaluación de la bondad de ajuste de los modelos se realiza mediante prueba t de student empleando también Minitab 14. En este caso se usa t de student pues se confrotan sólo valores experimentales y predichos. En todos los análisis se utiliza un nivel de confianza del 95%. La bondad de ajuste de los modelos también se evalúa con el error medio relativo (EMR), que se calcula en base a la siguiente ecuación: 1 Exp Pred EMR (11) n Exp donde n es el número de datos y las leyendas Exp y Pred corresponden a datos experimentales y predichos respectivamente. Para el análisis estadístico de color, compresión mecánica y del contenido de microorganismos se aplica primeramente ANOVA múltiple (2 vías) para saber si existe diferencia significativa en la interacción del factor tratamiento o tipo de producto y el factor actividad de agua (tiempo en el caso de microorganismos) y posteriormente se aplica ANOVA simple (1 vía) y contraste múltiple de medias o rangos, pero si la interacción es positiva se analiza por separado el factor tratamiento y el factor tiempo o a, es decir, se analiza el efecto del tratamiento sobre el color, compresión mecánica y el contenido de microorganismos para un mismo tiempo o a y el efecto de la a o el tiempo sobre el color, compresión mecánica y el contenido de microorganismos para un mismo tratamiento. El análisis del color y compresión mecánica se realiza también con Minitab 14 y el análisis del
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