Control genético de la tolerancia a los aislados del ToMV que superan la resistencia del gen Tm-2 2 en tomate.

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1 Control genético de la tolerancia a los aislados del ToMV que superan la resistencia del gen Tm-2 2 en tomate. S. Soler-Aleixandre y F. Nuez Instituto de Conservación y Mejora de la Agrodiversidad Valenciana, Universidad Politécnica de Valencia, Camino de Vera 14, València. Palabras clave: resistencia, tomate, virus. Resumen La incorporación del gen Tm-2 2 en las variedades comerciales de tomate está permitiendo en la actualidad el control de la enfermedad ocasionada por el virus del mosaico del tomate (Tomato mosaic virus, ToMV) en este cultivo. Sin embargo, recientemente se han identificado aislados del ToMV en Catalunya capaces de superar la resistencia conferida por este gen, procedente de Solanum peruvianum. La realización de ensayos de inoculación mecánica permitió identificar elevados niveles de resistencia en la línea de tomate LYC-3. Las plantas inoculadas de esta variedad presentaron niveles de acumulación viral muy bajos y muchas veces indetectables mediante la técnica serológica DAS-ELISA. En ningún caso se observaron síntomas de la enfermedad. Estos resultados hacen de LYC-3 una fuente de resistencia muy prometedora para el desarrollo de variedades de tomate resistentes a estos nuevos aislados de ToMV. El hecho de que el híbrido de la línea LYC-3 con el control susceptible RDD muestre un comportamiento resistente similar a LYC-3 indica que la resistencia es de tipo dominante. Por otra parte, la observación clara de una proporción 3: 1 (plantas resistentes: plantas susceptibles) en la F2, sugiere un control monogénico para el comportamiento resistente de LYC-3 frente al ToMV. Estas características de la resistencia identificada facilitan en gran manera su incorporación a las variedades comerciales de tomate. Además, disponer de esta nueva fuente de resistencia al ToMV en tomate constituye una seguridad frente a la posible dispersión en nuestro país de los aislados del ToMV que superan la resistencia del gen Tm-2 2. INTRODUCCIÓN El virus del mosaico del tomate (Tomato mosaic virus, ToMV) pertenece al género Tobamovirus, del cual es miembro tipo el virus del mosaico del tabaco (Tobacco mosaic virus, TMV). El ToMV, fue considerado durante mucho tiempo la raza tomate (Solanum lycopersicum L.) del TMV. La enfermedad causada por el virus del mosaico del tomate fue descrita en Holanda en 1910 y en EEUU en En la actualidad se conocen tres genes de resistencia al ToMV: el Tm-1, el Tm-2 y el Tm-2 2. Este último es alélico del segundo. El gen Tm-1, procedente de S. habrochaites Humb & Bonpl. (Pelham, 1966), produce una restricción de la acumulación viral y una ausencia de síntomas asociados a la enfermedad (Motoyoshi y Oshima, 1977) y es más efectivo en homocigosis que en heterocigosis (Fraser et al., 1980). Los genes Tm-2 y Tm-2 2 de S. peruvianum L. (Pelham, 1966) son alélicos y desencadenan una respuesta hipersensible. Recientemente ha sido clonado el gen Tm-2 2 Teniendo en cuenta la existencia de estos genes, los aislados de ToMV se clasifican en los tipos 0, 1, 2 y 2 2 según no superen ningún gen de resistencia, al gen Tm-1, al gen Tm-2 o al Tm-2 2 respectivamente. 1295

2 En la actualidad la mayoría de las variedades comerciales de tomate incorporan alguno de estos genes (principalmente el Tm-2 2 ) y el ToMV ha dejado de ser un problema en el cultivo del tomate e incluso no había hasta la actualidad cepas que superaran completamente esta resistencia (Fraser, 1990). La aparición en Cataluña de aislados de ToMV capaces de superar la resistencia conferida por el gen Tm2 2 (tipo 2 2 ), nos ha llevado a plantear de nuevo la búsqueda de nuevas fuentes de resistencia a este patógeno. El objetivo del presente trabajo ha sido la búsqueda de fuentes de resistencia frente a los nuevos aislados del ToMV que superan la resistencia del gen Tm-2 2. Posteriormente se ha procedido al estudio del control genético de aquellos materiales más prometedores. MATERIAL Y MÉTODOS Material vegetal 1. Ensayo 1: Búsqueda de fuentes de resistencia. Se ha utilizado la línea NE-1 de S. lycopersicum (7 plantas) tolerante a los aislados antiguos del ToMV, como control resistente. Como control susceptible hemos empleado las líneas Fortuna-C (20 plantas) y RDD (7 plantas) de S. lycopersicum. En ensayos previos se cribó una colección de germoplasma formada por 120 entradas de la especie cultivada y las especies silvestres S. peruvianum y S. habrochaites. Las mejores respuestas se encontraron en las entradas LYC-1 de S. habrochaites y LYC-3 de S. lycopersicum. Tratamos aquí de confirmar la utilidad de estas entradas para el desarrollo de variedades tolerantes o resistentes. Por tanto, el material a ensayar consistió en la entrada LYC-1 (20 plantas) y la variedad de tomate LYC-3 (20 plantas). 2. Ensayo 2: Estudio del control genético de la resistencia al ToMV en la variedad LYC-3 Con el fin de estudiar los sistemas genéticos implicados en el control de la tolerancia de LYC-3, se cruzó esta línea con la línea de tomate RDD susceptible al ToMV. A partir de esta F1 se obtuvo mediante autofecundación la generación F2. Se utilizaron 10 plantas de las líneas NE-1, RDD y la variedad LYC-3, 5 plantas de la generación F1 y 156 de la generación F2. En los dos ensayos las semillas de cada entrada o variedad fueron sometidas a un tratamiento con una solución de lejía comercial (10% de hipoclorito sódico) al 30%, durante 10 minutos, para desinfectarlas y facilitar su germinación en placas Petri. Las placas se mantuvieron en el interior de una cámara de germinación en condiciones controladas de temperatura (25 ºC/18 ºC (día/noche)), humedad relativa (60-65 %/ % (día/noche)) y fotoperiodo (14 horas de luz). Una vez germinadas las semillas, las plántulas fueron puestas en macetas de 6x6x8 cm con turba negra y ubicadas en una cámara de cultivo con las condiciones ambientales anteriormente citadas. Aislado del virus Se ha utilizado el aislado TM04-1 que rompe la resistencia del gen Tm2 2. Este aislado fue suministrado por el Dr. José Aramburu de l Institut de Recerca i Tecnologia Agrària i Alimentària (IRTA) de Cabrils (Catalunya). Método de inoculación La inoculación del virus se realizó mecánicamente. Para esto se preparó un inoculo a partir de hojas de plantas de tomate infectadas con el aislado TM04-1. El material infectado se pesó y trituró en un mortero con una maza de vidrio. A este triturado se añadió poco a poco agua destilada. El volumen (ml) de agua destilada necesaria se 1296

3 determinó siguiendo una relación 1/20 (peso en gramos del material vegetal/volumen en ml de agua destilada). La inoculación mecánica se realizó mediante un aplicador de algodón, el cual, una vez humedecido en el inóculo, se deslizó por toda la superficie foliar de las plantas a inocular. Las plantas fueron inoculadas en el estado de 4 a 5 hojas desarrolladas. Una semana más tarde se volvieron a inocular las hojas nuevas que se habían formado, con el fin de asegurar la infección de las plantas y evitar escapes. Criterios de evaluación Se tomaron muestras de hojas apicales no inoculadas de cada planta a los 15, 30, 45 y 60 días después de la segunda inoculación (DDI). Éstas fueron analizadas por medio de la técnica serológica DAS-ELISA para detectar la presencia o ausencia del ToMV. La absorbancia de la reacción serológica se midió a una longitud de onda de 405 nm en un fotómetro Titertek multiscan MCC/340. Las muestras se consideraron positivas cuando la absorbancia fue mayor de tres veces la media de la absorbancia de muestras tomadas de plantas no inoculadas. Paralelamente a la toma de muestras se realizó un seguimiento de los síntomas de la enfermedad en las plantas a los 15, 30, 45 y 60 días después de la segunda inoculación, utilizando un índice de síntomas generales que varía entre 0 para una planta sin síntomas y 4 para una planta que muestra síntomas muy graves o está muerta. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se ha observado elevados niveles de resistencia en las dos entradas probadas. En primer lugar la entrada LYC-1 muestra un comportamiento heterogéneo, con plantas susceptibles y plantas con una fuerte tolerancia (Tabla 1). No obstante, para su utilización habría que proceder a fijar este comportamiento tolerante. La línea NE-1 también mostró un buen comportamiento. Sin embargo, la tolerancia que presenta se ve superada por los aislados de ToMV del tipo 1 (datos no mostrados). Cabe destacar el comportamiento de la línea de tomate LYC-3. Las plantas inoculadas de esta variedad presentaron niveles de acumulación viral muy bajos y muchas veces indetectables mediante la técnica serológica DAS-ELISA. En ningún caso se observaron síntomas de la enfermedad, presentando una clara tolerancia. Estos resultados hacen de LYC-3 una fuente de resistencia muy prometedora para el desarrollo de variedades de tomate resistentes a estos nuevos aislados de ToMV. Además presenta también el mismo nivel de tolerancia frente a los aislados de tipo 0, 1 y 2 (datos no mostrados). El hecho de que todas las plantas de la F1 (LYC-3 x RDD) mostraran un comportamiento resistente similar a LYC-3 (Tabla 2), indica que la tolerancia es de tipo dominante. Por otra parte, la observación clara de una proporción 3: 1 (plantas tolerantes : plantas susceptibles) en la F2, sugiere un control monogénico para el comportamiento tolerante de LYC-3 frente al ToMV. El análisis estadístico efectuado confirma esta hipótesis (Tabla 3). Estas características de la resistencia identificada facilitan en gran manera su incorporación a las variedades comerciales de tomate. Además, disponer de esta nueva fuente de resistencia al ToMV en tomate constituye una seguridad frente a la posible dispersión en nuestro país de los aislados de ToMV que superan la resistencia del gen Tm

4 Referencias Fraser, R. S. S., Loughlin, S. A. R., y Connor, J. C Resistance to Tobacco mosaic virus in tomato: Effects of the Tm-1 gene on symptom formation and multiplication of virus strain 1. J. Gen. Virol. 50: Fraser, R. S. S The genetics of resistance to plant viruses. Annu. Rev. Phytopathol. 28: Pelham, J Resistance in tomato to Tobacco mosaic virus. Euphytica 15: Motoyoshi, F. y Oshima, N Expression of genetically controlled resistance to Tobacco mosaic virus infection in isolated tomato leaf mesophyll protoplasts. J. Gen. Virol. 34:

5 Tabla 1. Respuesta frente a la inoculación mecánica con el aislado TM04-1 de ToMV de las líneas NE-1,RDD y Fortuna-C de S. lycopersicum, la entrada LYC-1 de S. habrochaites y la variedad LYC-3 de S. lycopersicum. Entrada Índice de síntomas máximo medio 2 Absorbancia máxima media 3 LYC-1 (20) 1 0,43 1, ,0 LYC-1-1 (15+) 0,57 1, ,0 LYC-1-2 (5-) 0,0 0, ,0 LYC-3 (20) 0,0 0, ,0 NE-1 (7) 0,0 0, ,0 RDD (7) 2,1 2, ,0 Fortuna-C 4,0 2, ,0 % de plantas con infección sistémica 1: Número de plantas inoculadas. En el caso de LYC-1 se diferencian plantas con niveles elevados de absorbancia (LYC-1-1) o con niveles reducidos de absorbancia (LYC-1-2). 2: Índice de síntomas máximo medio calculado como la media del índice de síntomas máximo de cada planta de la entrada (0, planta sin síntomas; 1, planta con síntomas leves; 2, planta con síntomas moderados; 3, planta con síntomas graves; 4, planta con síntomas muy graves o muerta). 3: Absorbancia máxima media calculada como la media de la absorbancia máxima de cada planta de la entrada. Tabla 2. Respuesta frente a la inoculación mecánica con el aislado TM04-1 de ToMV de las generaciones F1 (LYC-3 x RDD) y F2 (LYC-3 x RDD). Índice de Absorbancia % de plantas % de plantas Generación síntomas máxima con infección máximo medio 2 media 3 tolerantes sistémica LYC-3 (10) 1 0,0 0,07 100,0 100,0 RDD (10) 3,3 1,88 100,0 0,0 F1 (LYC-3 x RDD) (5) 0,0 0,01 0,0 100,0 F2 (LYC-3 x RDD) (118) 0,0 0,15 100, ,0 (38) 2,1 1,77 100,0 0,0 Fortuna-C (10) 3,7 2,12 100,0 0,0 1: Número de plantas inoculadas. En el caso de la F2 se diferencian 118 plantas con niveles reducidos de absorbancia (tolerantes) o 38 con niveles elevados de absorbancia (susceptibles). 2: Índice de síntomas (0, planta sin síntomas; 1, planta con síntomas leves; 2, planta con síntomas moderados; 3, planta con síntomas graves; 4, planta con síntomas muy graves o muerta) máximo medio calculado como la media del índice de síntomas máximo de cada planta de la entrada 3: Absorbancia máxima media calculada como la media de la absorbancia máxima de cada planta de la entrada. 4: Ninguna de estas plantas mostraron síntoma alguno asociado a la enfermedad producida por el ToMV. Sin embargo, presentaron acumulaciones virales variables; algunas elevadas, entre 0,5 y 0,7 unidades de absorbancia, y otras tan bajas como las de la generación F

6 Tabla 3. Análisis genético de la respuesta frente a la inoculación mecánica con el aislado TM04-1 de ToMV de las generaciones F1 (LYC-3 x RDD) y F2 (LYC-3 x RDD). Generación Número Número de Número Proporción de Plantas Plantas total de plantas tolerantes susceptibles plantas resistentes:plantas susceptibles χ2 LYC :0 - RDD :1 - F1 (LYC-3 x RDD) :0 - F2 (LYC-3 x RDD) :1 0,034 ns 1300