FISH y Fragmentación de ADN: utilidad clínica

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1 FISH y Fragmentación de ADN: utilidad clínica 04 Dr. Alberto Pacheco Castro IVI- Madrid BLOQUE 2 ESTERILIDAD MASCULINA

2 Contenido Resumen FISH de espermatozoides Metodología y limitaciones de la técnica En que pacientes es recomendable pedir un FISH antes del tratamiento de reproducción asistida? FISH y resultados de reproducción asistida Utilidad clínica de la realización del FISH Fragmentación de ADN espermático Relación entre fragmentación de ADN espermático y fertilidad del varón Fragmentación y resultados de reproducción asistida Utilidad clínica del estudio de fragmentación de ADN espermático Bibliografía Tabla 1. Test de análisis de fragmentación existentes en la actualidad UNIDAD 04: FISH y Fragmentación de ADN: utilidad clínica Página 1 de 13

3 Resumen El factor masculino es responsable directa o indirectamente en aproximadamente el 50% de los casos de infertilidad de las parejas. En estos casos en los que hay un factor masculino claro, especialmente cuando hay un defecto severo, la técnica de elección es la ICSI, pero en la actualidad las tasas de éxito permanecen en valores por debajo de lo deseable. Una posible causa de este bajo porcentaje de éxito es que a menudo el varón no se encuentra debidamente estudiado, ya que en la mayoría de los centros el diagnóstico del varón se realiza de acuerdo a los resultados de un único seminograma (a lo sumo dos). Pero el seminograma tiene varias limitaciones importantes: presenta una alta variabilidad intra e inter-individuo, no identifica el origen de la baja calidad seminal, y no da información de la capacidad fecundante del espermatozoide. Por ello, para ampliar el estudio de la capacidad fértil del varón, es importante realizar otros test diagnósticos que nos aporten otra información relevante para determinar con mayor precisión la capacidad fértil del varón, y tengan utilidad clínica, es decir, sirvan para establecer nuevos protocolos médicos en base a esos resultados. Dentro de los estudios posibles, destacan dos pruebas diagnósticas que analizan el ADN espermático bajo distinta perspectiva: FISH de espermatozoides y Fragmentación de AND. UNIDAD 04: FISH y Fragmentación de ADN: utilidad clínica Página 2 de 13

4 1. FISH de espermatozoides 1.1. Metodología y limitaciones de la técnica El FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) es una técnica que permite detectar secuencias específicas de ADN en las células, mediantes la utilización de sondas de ADN marcadas con compuestos fluorescentes. De esta forma, en el FISH de espermatozoides se utilizan distintas sondas específicas cada una de un tipo de cromosoma, de tal forma que su detección posterior en el interior del espermatozoide permite el análisis de la constitución cromosómica de los espermatozoides de una muestra. En base a la dotación cromosómica, se considera una dotación haploide (normal) cuando hay una única copia de cada cromosoma, disómico aquel espermatozoide que tiene una copia de mas, nulisómico el que tiene una copia de menos, y diploide si tiene 2 copias de todos los cromosomas estudiados. Aunque hay variación entre los distintos laboratorios, en un reciente metaanálisis establecen unos valores de normalidad (en individuos fértiles de 0,23% de frecuencia media de diploidía, y de 0,15% de frecuencia de disomía Uno de los problemas que presenta esta técnica aplicada al espermatozoide, es que el reducido tamaño del nucleo espermático limita la utilización de múltiples sondas al mismo tiempo, aun realizándose una correcta descondensación del ADN espermático. Así, habitualmente se emplean 2 o 3 sondas por cada preparación, realizándose el estudio habitualmente sobre 5 cromosomas (13, 18, 21, X e Y), aunque algunos laboratorios, empleando sistemas automáticos, realizan FISH múltiple sobre 9 cromosomas (13, 15, 16, 17, 18, 21, 21, 22, X e Y). Otra limitación evidente de la técnica es que la muestra empleada en el estudio no puee ser la misma que la empleada para el tratamiento, con lo que puede existir una cierta variabilidad inter-muestras que altere parcialmente el resultado. UNIDAD 04: FISH y Fragmentación de ADN: utilidad clínica Página 3 de 13

5 1.2. En que pacientes es recomendable pedir un FISH antes del tratamiento de reproducción asistida? El estudio de FISH está encaminando a la identificación de aquellos pacientes con alteraciones en el proceso meiótico, pudiendo ser la consecuencia de los problemas reproductivos. Así, la incidencia de aneuploidías está incrementada significativamente en pacientes con alteraciones seminales, como oligoastenoteratozoospermia, oligozoospermia severa (< 2 millones/eyaculado) o teratozoospermia severa (<2% formas normales). Por ejemplo, cuando hay un alto porcentaje de macrocefalia, multinucleación, o flagelos múltiples, las frecuencia de aneuplodías se incrementa en 10 veces con respecto a los valores de normalidad. También hay incrementos muy significativos de aneuploidías en espermatozoides extraidos de testículo o epidídimo; de hecho, se ha descrito en numerosos trabajos una alta tasa de aneuploidías en pacientes con azoospermia no obstructiva, así como una mayor incidencia de anomalías cromosómicas en espermatozoides de epidídimo comparado con espermatozoides de eyaculado. Por último, se ha descrito también una mayor incidencia de aneuploidías en pacientes con cariotipo alterado, siendo especialmente relevante en el caso del síndrome de Klinefelter, donde la tasa media de disomías suben hasta un 4,6% (para XX) y un 11% (para XY) (con una incidencia media del 6%) y la de diploidía sube también, alcanzando hasta un 6% para el cromosoma 21; también se ha descrito un aumento significativo en el caso de pacientes con alteraciones estructurales), o incluso tambien en pacientes con microdelecciones. Por ello, todos estos serían los principales candidatos para la realización de esta prueba previo a cualquier tratamiento de reproducción asistida, ya que las alteraciones en el número de cromosomas en los espermatozoides se ha relacionado con una menor tasa de embarazo tras ICSI (1). Asimismo, en estos casos la realización de ICSI tiene un mayor riesgo de generar descendencia con una constitución cromosómica desbalanceada. UNIDAD 04: FISH y Fragmentación de ADN: utilidad clínica Página 4 de 13

6 1.3. FISH y resultados de reproducción asistida En múltiples trabajos se ha estudiado la relación de las aneuplodías espermáticas y los resultados tras el tratamiento de reproducción asistida. Así, se ha descrito una fuerte correlación negativa entre el incremento de aneuploidias y el éxito tras ICSI (1), determinándose una mayor tasa de fallos de implantación, menor tasa de gestación y mayor tasa de aborto (2). La contribución de la aneuplodía espermática en los abortos de repetición es debido fundamentalmente a la generación de embriones cromosómicamente anormales, ya que por ejemplo las trisomías autosómicas o las nulisomías no son viables. Así, los estudios citogenéticos de los abortos del tercer trimestre confirman que entre el 50-80% de los embriones eran cromosómicamente anormales; aunque la mayoría de las anormalidades numéricas son de origen materna, entre un 8-12% de los abortos con trisomías de los cromosomas 12, 18 y 21 son de origen paterno. En relación a las monosomías, cabe destacar que, exceptuando la monosomía X, suelen ser más deletéreas que las trisomías y por tanto es raro que lleguen a implantar; por ello, es importante valorar las nulisomías a nivel espermático que darán lugar a monosomías en el embrión con el consiguiente fallo de implantación. Sin embargo, un incremento de espermatozoides con disomía para los cromosomas sexuales se relaciona con un incremento de embriones aneuploides, principalmente con alteraciones para los cromosomas sexuales siendo en este caso compatibles con la vida. Con respecto a los fallos de implantación, los resultados publicados son contradictorios, existiendo trabajos que demuestran una mayor incidencia de alteraciones cromosómicas en casos de fallos de implantación, aunque también hay otros trabajos que, aunque ven una disminución de la tasa de implantación y gestación en pacientes con FISH alterado, no alcanza diferencias significativas con aquellos pacientes con FISH normal Utilidad clínica de la realización del FISH Teniendo en cuenta, como ya se ha comentado anteriormente, que los resultados reproductivos son menores en pacientes con FISH alterado, la utilidad clínica fundamental sería la aplicación de diagnóstico genético preimplantacional (PGD) en aquellos casos en los que se confirme un FISH alterado. De hecho, se ha demostrado que en aquellos embriones obtenidos tras FIV/ICSI y analizados por PGD hay una mayor incidencia de alteraciones UNIDAD 04: FISH y Fragmentación de ADN: utilidad clínica Página 5 de 13

7 numéricas, y esta incidencia es aún mayor si el paciente tiene un factor masculino severo (oligoastenoterato severa). En el año 2003 Escudero y cols publicaron un estudio prospectivo en pacientes con traslocaciones recíprocas, analizando en primer lugar el FISH y comparándolo luego con los resultados obtenidos por el PGD aplicado a los embriones generados en los ciclos de ICSI: los resultados obtenidos mostraron que el FISH tenía un valor predictivo: pacientes con más de 65% de espermatozoides anormales necesitaban más de 10 embriones para tener probabilidad de éxito en el tratamiento. Pero también hay otros trabajos que no encuentran diferencias significativas con respecto a la realización o no de PGD previo al tratamiento, ya que las tasas de gestación no son significativamente superiores con respecto al grupo control. En resumen, está ampliamente demostrado que la incidencia de FISH anormal es mayor cuanto peor calidad espermática presenta el varón, así como en los casos en los que haya un cariotipo anormal. La consecuencia clínica probable en caso de realizar un tratamiento de reproducción asistida es una disminución en la tasa de gestación, y un aumento en la tasa de aborto, con lo que se podría valorar la realización de PGD en el ciclo con el fin de intentar realizar una mejor selección embrionaria y reducir la tasa de aborto. Además, es importante mencionar que la aplicación del FISH puede tener relevancia desde el punto de vista del consejo genético a las parejas, ya que en diversos estudios se ha descrito una alta incidencia de espermatozoides con alteraciones para los cromosomas sexuales y para el cromosoma 21 en padres de niños con alteraciones para los cromosomas sexuales (Síndrome de Turner, Síndrome de Klinefelter) y de niños con Síndrome de Down, respectivamente. UNIDAD 04: FISH y Fragmentación de ADN: utilidad clínica Página 6 de 13

8 2. Fragmentación de ADN espermático La fragmentación del ADN espermático se entiende como el conjunto de alteraciones que pueden ocasionar roturas de cadena sencilla o doble del ADN, así como aquellas alteraciones que impliquen modificaciones de bases nitrogenadas, formación de aductos o fenómenos de cross-linking entre ADN o proteínas que pueden inducir la formación de nuevas roturas de ADN. La fertilidad del varón está intimamente relacionada con la integridad del ADN espermático, ya que es crucial no sólo para el proceso de fecundación, sino también para el correcto desarrollo temprano y tardío del embrión. De hecho, durante la selección espermática que ocurre en el aparato reproductor femenino de forma natural, uno de los procesos que tienen lugar es la selección de aquellos espermatozoides con un alta integridad del ADN espermático y, como consecuencia, la eliminación de aquellos espematozoides con ADN fragmentado. Pero con las técnicas de reproducción asistida, la fecundación puede llevarse a cabo con espermatozoides que habrían sido eliminados in vivo por su alto grado de ADN fragmentado, aumentando por tanto el riesgo de la transmisión de defectos o problemas médicos derivados de la utilización de estos espermatozoides en los nacidos mediante estos tratamientos, especialmente cuando la técnica utilizada es la ICSI, ya que en ella no hay ningún proceso de selección fisiológica. Por ello, parece fundamental estudiar la integridad del ADN espermático para, en aquellas muestras de semen con graves alteraciones, poder posteriormente eliminar los espermatozoides fragmentados con el fin de no utilizarlos para la realización de las técnicas de reproducción asistida Relación entre fragmentación de ADN espermático y fertilidad del varón Cada vez son más numerosos y concluyentes los estudios que demuestran que la integridad del ADN espermático está relacionada con la calidad seminal, así como con la funcionalidad del propio espermatozoide. Así, parece clara la correlación entre fragmentación de ADN espermático y ciertas caraterísticas seminales, especialmente respecto a la movilidad espermática (3). También se ha descrito una mayor incidencia de espermatozoides con ADN fragmentado en pacientes con determinadas patologías asociadas con alteraciones seminales, UNIDAD 04: FISH y Fragmentación de ADN: utilidad clínica Página 7 de 13

9 como varicocele (4), e incluso en individuos infértiles con parámetros seminales normales (5), lo que podría ser de gran utilidad para caracterizar y/o diagnosticar algunos casos de infertilidad masculina idiopática. Además, diversos estudios han mostrado que la integridad del ADN espermático va dismunuyendo con la edad del varón (6), lo que lo relacionaría con la funcionalidad del espermatozoide. Aun así, las principales sociedades científicas, como ESHRE (7) y ASRM (ASRM 2013) no recomiendaron el uso rutinario de este análisis para el estudio de la fertilidad masculina, basándose principalmente en la variabilidad de resultados publicados y a una baja correlación con los resultados en reproducción asistida. Esta controversia en la inclusión o no del test de fragmentación como prueba diagnóstica se debe a varios factores, como a) Origen de la fragmentación de ADN espermático: la fragmentación de ADN es un proceso final, que puede estar provocado por distintos mecanismos con diferentes orígenes. Por ello, el daño del ADN producido por todos estos mecanismos puede generar distintos grados de alteración molecular y como consecuencia, producir distintos efectos en los tratamientos de reproducción asistida. b) Posibilidad de reparación del daño en el ADN: está ampliamente demostrado que el ovocito tiene capacidad de reparar en parte el daño del ADN espermático. Esta capacidad dependerá principalmente de dos factores: a) del grado de daño que esté presente, siendo reparable si el daño es de hebra sencilla y no reparable si éste es de hebra doble y b) de la calidad ovocitaria, la cual se verá afectada a su vez por el aumento de la edad de la mujer. c) Diferentes técnicas de análisis del daño del ADN espermático. Existen diferentes técnicas de análisis de la fragmentación del ADN espermático (ensayo Cometa, SCSA, SCD, ensayo Tunel ), y a menudo una de las críticas que ha recibido el estudio ha sido la falta de equivalencia entre ambas (Tabla 1). Pero realmente no todas son iguales, ni miden los mismos procesos, por lo que los resultados no tienen por qué ser equivalentes. Así es importante tener en cuenta lo que analiza cada una y por tanto las posibles ventajas (e inconvenientes) que presentan, y sus posibles utilidades: En resumen, las principales indicaciones para realizar un estudio de fragmentación de ADN espermático serían: Baja calidad seminal, especialmente con astenozoospermia severa UNIDAD 04: FISH y Fragmentación de ADN: utilidad clínica Página 8 de 13

10 Infertilidad idiopática Varicocele Episodio febril en los últimos 3 meses Edad avanzada del varón 2.2. Fragmentación y resultados de reproducción asistida En estudios recientes, utilizando la técnica de cometa, se han observado una clara asociación entre daño en la integridad del ADN y los resultados en reproducción asistida (8). Estos resultados pueden variar dependiendo de la técnica de reproducción utilizada; así, (8) describió una tasa de gestación significativamente menor en pacientes con alta fragmentación de ADN espermático en comparación con pacientes con baja fragmentación, cuando se realizó FIV convencional, aunque no cuando se realizó ICSI. Por último, en un meta-análisis publicado recientemente POR Osma y cols se concluye que existen diferencias significativas en la tasa de recien nacido entre pacientes con baja tasa de fragmentación y alta tasa de fragmentación, especialmente en los casos de FIV convencional. Pero quizá donde hay un mayor consenso entre las distintas publicaciones es en la relación existente entre la fragmentación de ADN espermático y el aborto tras las técnicas de reproducción asistida, como así queda reflejado en un reciente metaanálisis basado en los resultados de 16 diferentes trabajos (9) Utilidad clínica del estudio de fragmentación de ADN espermático Una de las ventajas que presenta el estudio de fragmentación de ADN espermático es que en aquellos pacientes en los que se ha detectado altos niveles de fragmentación de ADN espermático, se puede intentar disminuir, sobre todo si el origen de la fragmentación de ADN espermático se encuentra en el estrés oxidativo. Así, una de las posibilidades es el tratamiento con antioxidantes orales. Un reciente estudio ha demostrado que en hombres de edad avanzada, una dieta rica en antioxidantes y micronutrientes reduciría el riesgo de producir espermatozoides con el ADN dañado. Actualmente hay varios compuestos o preparados comerciales que contienen antioxidantes, aunque la eficacia de estos tratamientos no ha sido UNIDAD 04: FISH y Fragmentación de ADN: utilidad clínica Página 9 de 13

11 plenamente contrastada, debido principalmente a un mal diseño (sin placebo, poco tiempo de tratamiento, diferentes tipos de compuestos con distinta formulación, ) de los trabajos realizados hasta la actualidad. Otra posibilidad descrita por varios autores es la reducción del periodo de abstinencia, con el fin de evitar la acumulación durante tiempo prolongado de espermatozoides en el epidídimo, lo cual favorece el estrés oxidativo. Pero además el estudio de fragmentación de ADN tiene especial relevancia desde el punto de vista clínico ya que en la actualidad hay técnicas de selección espermática relacionadas con la fragmentación de ADN que pueden ayudar a mejorar la calidad seminal de la muestra empleada para el tratamiento. La integridad del ADN está inversamente relacionado con las alteraciones del proceso apoptótico testicular, de tal forma que cuando hay alteraciones de la apoptosis testicular, se observa un incremento de la fragmentación de ADN espermático en el eyaculado. Si se emplean estos espermatozoides apoptóticos para el ICSI podría dar lugar a alteraciones embrionarias que produzcan fallos reproductivos, y un aumento de la tasa de aborto. Recientemente se ha desarrollado una nueva técnica de selección espermática que es capaz de detectar y aislar espermatozoides no apoptóticos (10). Está técnica, denominada MACS (Magnetic Activated Cell Sorting), utiliza el compuesto anexina-v que detecta células apoptóticas al unirse a residuos de fosfatidilserina. La anexina-v a su vez lleva unida una microesferas magnéticas de tal forma que tras la unión a cels apoptóticas, éstas son separadas al pasar, con una columna específica, a través de un campo magnético (imán), quedando retenidas las células apoptóticas, y eluyendo sólo las que no han entrado en el proceso de apoptosis. Se han descrito varios artículos que han visto como la utilización de esta técnica MACS mejora la calidad seminal, reduce la fragmentación espermática de la muestra y mejora las tasa de gestación, especialmente en casos de factor masculino severo. UNIDAD 04: FISH y Fragmentación de ADN: utilidad clínica Página 10 de 13

12 3. Bibliografía 1. Rubio C, Gil-Salom M, Simón C, Vidal F, Rodrigo L, Mínguez Y, Remohí J, Pellicer A, Incidence of sperm chromosomal abnormalities in a risk population: relationship with sperm quality and ICSI outcome. Hum Reprod.;16(10): Rodrigo L, Rubio C, Peinado V, Villamón R, Al-Asmar N, Remohí J, Pellicer A, Simón C, Gil-Salom M, Testicular sperm from patients with obstructive and nonobstructive azoospermia: aneuploidy risk and reproductive prognosis using testicular sperm from fertile donors as control samples. Fertil Steril. 95(3): Irvine DS, Twigg JP, Gordon EL et al, DNA integrity in human spermatozoa: relationships with semen quality. J Androl 21: Saleh, RA., Agarwal, A., Nelson, DR., Nada, EA., El-Tonsy, MH., Alvarez, JG., et al., Increased sperm nuclear DNA damage in normozoospermic infertile men: a prospective study. Fertil Steril, 78(2): Saleh, RA., Agarwal, A., Sharma, RK., Said, TM., Sikka, SC., Thomas, AJ. Jr., Evaluation of nuclear DNA damage in spermatozoa from infertile men with varicocele. Fertil Steril, 6: Wyrobek, AJ., Eskenazi, B., Young, S., Arnheim, N., et al., Advancing age has differential effects on DNA damage, chromatin integrity, gene mutations, and aneuploidies in sperm. PNAS, 103: Barratt, L.R., Aitken, R.J., Björndahl, L., Carrell, D.T., de Boer, P., Kvist, U., Lewis, S.E.M., Perreault, S.D., Perry, M.J., Ramos, L., Robaire, B., Ward, S., Zini, A., Sperm DNA: organization, protection and vulnerability: from basic science to clinical applications a position report. Hum. Reprod. 25, UNIDAD 04: FISH y Fragmentación de ADN: utilidad clínica Página 11 de 13

13 8. Simon L, Proutski I, Stevenson M, Jennings D, McManus J, Lutton D, Lewis SEM, Sperm DNA damage has negative association with the live birth rates after IVF. Reprod Biomed Online 26, Robinson L, Gallos ID, Conner SJ, Rajkhowa M, Miller D, Lewis S, Kirkman-Brown J, Coomarasamy A, The effect of sperm DNA fragmentation on miscarriage rates: a systematic review and meta-analysis. Hum Reprod; 27: Gil M, Sar-Shalom V, Melendez Sivira Y, Carreras R, Checa MA, Sperm selection using magnetic activated cell sorting (MACS) in assisted reproduction: a systematic review and meta-analysis. J Assist Reprod Genet. 30(4): UNIDAD 04: FISH y Fragmentación de ADN: utilidad clínica Página 12 de 13

14 Tabla 1. Test de análisis de fragmentación existentes en la actualidad Nombre del Test Mecanismo analizado Principal indicación SCSA - Defectos de maduración (protaminas) Cometa neutro Cometa alcalino - Diferenciación del tipo de roturas - Tasa de gestación - Tasa de aborto Tunel Detección directa de puntos de rotura en la hebra de ADN - Tasa de gestación - Anomalías cromosómicas SCD Susceptibilidad a la descondensación ácida - Varicocele IVI Reservados todos los derechos UNIDAD 04: FISH y Fragmentación de ADN: utilidad clínica Página 13 de 13