REGENERACIÓN ÓSEA PARA CÉLULAS MADRE DENTALES. Francesc Ventura Pujol Facultat de Medicina CSUB Corrado Paganelli Dental School Brescia

Transcripción

1 REGENERACIÓN ÓSEA PARA CÉLULAS MADRE DENTALES Francesc Ventura Pujol Facultat de Medicina CSUB Corrado Paganelli Dental School Brescia

2 2

3 1. Resumen del proyecto El proyecto se basa en la hipótesis de que las células madre de la pulpa dental (DPSC) y obtenidas mediante el método de fractura frágil son adecuadas para trasplantar a matrices tridimensionales seleccionadas y cultivadas para obtener células osteoprogenitoras. Los datos preliminares in vitro e in vivo también apoyaron la hipótesis de que el tratamiento con los agentes osteoinductivos BMP y Wnt3a aumentan sinérgicamente el potencial osteogénico de las células madre mesenquimales (Rodriguez-Carballo et al., 2011). Por lo tanto, nuestro enfoque de ingeniería de tejido óseo combina la optimización de matrices y la adición de agentes osteoinductivos a las células madre mesenquimales. Primero se analizó el potencial osteogénico de DPSC o BM-MSC sembradas en diferentes matrices y tratadas con diferentes combinaciones de los agentes osteoinductivos BMP y Wnt. Posteriormente analizamos la capacidad de este tejido óseo modificado para regenerar hueso en modelos de ratones para regeneración esquelética. Además, también se investigaron los mecanismos de este tipo de sinergismo osteogénico entre BMP y Wnt3a. En conjunto, el proyecto ofrece datos integradores sobre la viabilidad de la osteoinducción, así como la osteointegración de células madre mesenquimales para tratar defectos óseos. 2. Resultados Hemos sido capaces de cultivar y expandir DPSC de dentición humana decidua y permanente. Las células se comportan como células madre y expresan todos los marcadores de las células madre mesenquimales. Además, las células fueron capaces de diferenciarse en osteoblastos (figura 1). 3

4 Figura 1. Cultivos de RT-DPSC, FF-DPSC y BM-MSC durante 21 días en medio osteogénico teñidas con Alizarin Red para evaluar su mineralización. RT-DPSC, FF-DPSC y BM-MSC mostraron propiedades de crecimiento y capacidad de mineralización similares en condiciones osteogénicas que muestran su viabilidad para inducir la formación ósea in vitro. No había diferencias con respecto a los dientes de origen. Después de tres a cinco pases, las células comienzan a perder stemness y la capacidad de diferenciarse en osteoblastos en las diferentes condiciones de cultivo ensayadas. En estos momentos, la cantidad de células que se pueden cultivar no es suficiente para llevar a cabo una estrategia de trasplante exitosa. Entonces, concluimos que las DPSC, a menos que estuvieran inmortalizadas, serían una fuente limitada de MSC para realizar la regeneración ósea. Por ello abordamos la obtención de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea. Debido al elevado número de células obtenidas, podemos alcanzar en 3-5 pases células más que suficientes para establecer un procedimiento de trasplante. Por lo tanto, se buscó mejorar la ingeniería del tejido óseo mediante un enfoque que combina células madre, diferentes matrices y agentes osteoinductivos. Hemos identificado una combinación de gelatina y CaSO 4 como la mejor matriz para permitir el crecimiento y la diferenciación de BM-MSC in vitro e in vivo. Las células madre mesenquimales derivadas de médula ósea (BM-MSC) fueron inducidas a diferenciarse en células osteogénicas antes de la implantación in vivo. Se procedió a seleccionar una matriz óptima para crecer y diferenciar las células madre mesenquimales. En una placa microtituladora de 24 pocillos se cultivaron células para 4

5 cada condición. Después de 24 horas se evaluó la adhesión y proliferación de células en cada matriz. Las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio de fluorescencia. En el estudio se utilizaron células madre mesenquimales obtenidas a partir de ratones que expresan GFP, lo que nos permitió visualizar cualitativamente el grado de proliferación celular de cada condición (figura 2). Figura 2. Análisis de proliferación de MSC a las 24 horas. Resolución 10X and 20X. También cuantificamos en las células madre la expresión de marcadores osteogénicos por RT-qPCR. Cuantificamos dos factores de transcripción que regulan y mantienen el estado indiferenciado de las células madre (Nanog y Oct4) y tres marcadores de genes osteogénicos clave (Col1a1, Runx2 y Osx) (figura 3). Los datos de expresión muestran una correlación directa entre la expresión basal de Nanog y la matriz. Las células cultivadas en una combinación de matriz de colágeno y CaSO 4 tenían niveles más bajos de Nanog, sugiriendo un compromiso de esas células a la especificación de un linaje celular. En todos los casos, la adición de BMP-2 llevó a niveles más bajos de Nanog y Oct4. Las células cultivadas en una combinación de matriz de colágeno y CaSO 4 mostraron niveles más altos de Col1a1, Runx2 y Osx, sugiriendo mayor compromiso con la diferenciación de osteoblastos. La adición de BMP-2 llevó a un aumento adicional en los niveles de expresión de los factores clave de transcripción de osteoblasto Runx2 y Osx (figura 3). Después de 10 días en cultivo, las células cultivadas en una combinación de matriz de colágeno y CaSO 4 mostraron niveles más altos de Col1a1. La 5

6 adición de BMP-2 condujo a un aumento de los niveles de expresión de Col1a1. Así, se identificó la combinación de fibrillas de colágeno y CaSO 4 como mejor matriz para realizar ensayos in vivo de la regeneración ósea, ya que esta matriz promueve el compromiso y diferenciación hacia el fenotipo osteoblasto de células madre mesenquimales en cultivo. Figura 3. Cuantificación de marcadores de stemness y osteogénicos en células cultivadas en diferentes matrices y tratadas con BMP-2. También se estableció un modelo de ratón de defecto óseo utilizando un defecto de 5 mm de diámetro en la calvaria del ratón. Aplicamos combinaciones de diferentes matrices y células al defecto en un molde de agarosa. Los resultados mostraron que las BM-MSC implantadas en colágeno y CaSO 4 como matriz sobrevivieron y generaron hueso 5 semanas después de su implantación. La formación ósea se analizó mediante análisis de µct y tinción tricrómica de hueso. Además, se analizaron los mecanismos moleculares implicados y se observó un efecto cooperativo entre Ca 2+ y BMP-2 sobre la fosforilación de SMAD1/5, S6, GSK3 y los niveles totales de β-catenina. Además, el 6

7 Ca 2+ favoreció la fosforilación de SMAD1, que se correlaciona con la inducción de la expresión de los genes BMP-2 y BMP-4. Estos datos demuestran que el Ca 2+ y BMP-2 cooperan y promueven un bucle feed-forward osteogénico autocrino/paracrino. Estos resultados demuestran la utilidad de los injertos óseos basados en calcio o la adición de Ca 2+ exógeno en la ingeniería del tejido óseo. Figura 4. Análisis por µct y tinción tricrómica de la regeneración ósea inducida por combinación de BMP-2 y Wnt3a. 7

8 También buscamos mejorar la ingeniería del tejido óseo a través de un enfoque que combina células, la matriz óptima de gelatina/caso 4 y los agentes osteoinductivos. Es importante destacar que el pretratamiento ex vivo de BMMSC con bajas cantidades de BMP-2 (2 nm) y Wnt3a (50 ng/ml) durante 24 horas aumenta cooperativamente la expresión de marcadores osteogénicos in vitro y la regeneración ósea en el modelo de defecto de calvaria in vivo (figura 4). Estos datos proporcionan una justificación para el desarrollo traslacional de un uso cooperativo ex vivo de BMP-2 y Wnt3a. La cooperación con factores osteogénicos puede aplicarse para reducir la cantidad requerida de factores de crecimiento, al tiempo que se obtienen mayores efectos terapéuticos. Finalmente se identificaron los mecanismos por los cuales distintas señales osteogénicas (tales como IGF-1, Wnt y BMP) generan sinergia en la inducción de diferenciación osteoblástica y la regeneración ósea. Anteriormente, habíamos demostrado que Smad y β-catenina interactúan entre sí y forman un complejo en los promotores de genes de determinación osteoblástica. Hemos ampliado este análisis mediante la generación de ratones con supresión de la actividad PI3K en osteoblastos. Nuestros resultados mostraron que tanto p110α y p110β son necesarias para la supervivencia, la diferenciación y la función de los osteoblastos y, por tanto, controlar la formación ósea y la homeostasis ósea posnatal. La osteogénesis alterada se debe a una mayor actividad de GSK3 y a una supresión de los niveles de proteína SMAD1 en los osteoblastos deficientes en PI3K. Por consiguiente, la inhibición farmacológica de la actividad de GSK3 o la expresión ectópica de SMAD1 o SMAD5 normaliza la transducción de BMP y la diferenciación de osteoblastos. En conjunto, estos resultados identifican el eje PI3K-GSK3-SMAD1 como un nodo central que integra múltiples redes de señalización que gobiernan la formación y la homeostasis ósea. 8

9 Figura 5. Mecanismo molecular del sinergismo osteogénico entre IGF1, BMP-2 y Wnt3a. 3. Relevancia científica y clínica Existen varios tratamientos para los defectos óseos que son causados por la resección de tumores óseos malignos, lesiones traumáticas y enfermedades congénitas: implantación de biocerámica o injertos óseos autógenos y alógenos. Aunque tales tratamientos son extremadamente populares, existen algunos riesgos por la escasez de suministro de donantes, la persistencia del dolor, el daño nervioso, la fractura y la discapacidad cosmética en el sitio donante en los autoinjertos y la reacción inmunológica con aloinjertos. Además, el potencial de regeneración ósea disminuye exponencialmente con la edad en humanos. La ingeniería de tejidos óseos proporciona una opción para el tratamiento de los defectos óseos para resolver estos problemas. Nuestros resultados muestran que una combinación de múltiples agentes osteoinductivos (BMP-2 y Wnt3a) y matrices biodegradables (gelatina dopada con CaSO 4 ) proporcionan un ambiente osteoinductivo adecuado para células osteogénicas en modelos de regeneración de defectos óseos en ratón. Además, se identificó un mecanismo que actúa como un nodo para las señales osteogénicas que pueden ser explotado para maximizar estos efectos osteogénicos en células madre. De esta manera, el conocimiento generado en los métodos de expansión, cultivo y diferenciación de células madre mesenquimales es de interés en el desarrollo de 9

10 terapias en traumatología y odontología. Este proyecto ha permitido conocer el knowhow del manejo y cultivo de células madre adultas y evaluar el mejor método para cultivar estas células en matrices adecuadas, así como hallar la mejor combinación de osteoinductores recombinantes para usos futuros en la regeneración ósea. 4. Publicaciones Datos preliminares extremadamente relevantes para la hipótesis inicial y el desarrollo del proyecto: Rodríguez-Carballo, E.; Ulsamer, A.; Susperregui, A..G.; Manzanares, C.; Sánchez- García, E.; Bartrons, R.; Rosa, J.L.; Ventura, F. Conserved regulatory motifs in osteogenic gene promoters integrate cooperative effects of canonical Wnt and BMP pathways. Journal of Bone and Mineral Research (2011) (4): Publicaciones de los resultados directamente relacionados con los objetivos del proyecto: Aquino-Martínez R, Rodríguez-Carballo E, Gámez B, Artigas N, Carvalho-Lobato P, Manzanares-Céspedes C, Rosa JL, Ventura F Mesenchymal Stem Cells within Gelatin/CaSO4 Scaffolds Treated Ex Vivo with Low Doses of BMP-2 and Wnt3a Increase Bone Regeneration. Tissue Eng Part A. (2016)(2): Gámez B; Rodríguez-Carballo E; Graupera M; Rosa JL; Ventura F. Class I PI-3-Kinase signaling is critical for bone formation through regulation of SMAD1 activity in osteoblasts. Journal of Bone and Mineral Research (2016) (8): Aquino-Martínez R, Artigas N, Gámez B, Rosa JL, Ventura F Extracellular calcium promotes bone formation from bone marrow mesenchymal stem cells by amplifying the effects of BMP-2 on SMAD signalling (sometido para su publicación) 10