TRATAMIENTO DE LA OSTEONECROSIS DE CABEZA FEMORAL CON TERAPIA CELULAR AVANZADA Y BIOMATERIALES EN UN MODELO EXPERIMENTAL OVINO

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1 TRATAMIENTO DE LA OSTEONECROSIS DE CABEZA FEMORAL CON TERAPIA CELULAR AVANZADA Y BIOMATERIALES EN UN MODELO EXPERIMENTAL OVINO Màrius Aguirre Canyadell Institut de Recerca Hospital Universitari Vall d'hebron Maria Pau Ginebra Molins Escola Tècnica Superior d'enginyeria Industrial de Barcelona UPC

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3 1. Resumen del proyecto La osteonecrosis de cabeza femoral (ONCF) es una enfermedad adquirida que se caracteriza por un proceso isquémico y su progresión hacia una deformidad e incongruencia articular de la cadera, que en su estadio más avanzado presenta cambios degenerativos articulares (artrosis), dolor e incapacidad funcional. Típicamente afecta a pacientes jóvenes y activos, y se estima que cada año se diagnostican nuevos casos de osteonecrosis en Estados Unidos. Aproximadamente el 10% de todas las artroplastias de cadera se realizan a causa de su diagnóstico. Actualmente no se dispone de ningún tratamiento eficaz para evitar la progresión de los estadios más iniciales de la ONCF, y en las fases más avanzadas las opciones se limitan a técnicas quirúrgicas de reconstrucción articular como las artroplastias (prótesis) de cadera. Las modalidades de tratamiento para las fases más tempranas incluyen tratamientos no quirúrgicos (farmacológicos, biofísicos) y quirúrgicos que intentan preservar la cabeza femoral. Las técnicas quirúrgicas en las fases más iniciales incluyen la descompresión central, la descompresión central con el aporte de un injerto no vascularizado o vascularizado y las osteotomías rotacionales. Estas técnicas quirúrgicas solo han demostrado una utilidad relativa en lesiones de pequeñas a moderadas. Recientemente se han propuesto nuevos tratamientos para los estadios iniciales de la ONCF con el uso combinado de proteínas morfogénicas (BMP), concentrados de médula ósea o células madre mesenquimales (MSC), y se ha demostrado un retraso en la progresión radiológica de la lesión. La investigación de nuevos tratamientos para la ONCF requiere estudios prospectivos, aleatorizados y en un ambiente experimental controlado. No se ha progresado especialmente en este campo debido a la falta de modelos animales experimentales de ONCF que repliquen todos los estadios de la enfermedad humana. Los tratamientos se deberían enfocar hacia modalidades biológicas coadyuvantes con soporte estructural, que permitan la regeneración ósea y eviten el colapso de la cabeza femoral, por lo que se propone utilizar células madre mesenquimales derivadas de médula ósea que tienen la propiedad de renovarse y diferenciarse en varios tejidos, como el tejido óseo, 3

4 adiposo, cartilaginoso y muscular. Por estas razones, la obtención y manipulación de células madre mesenquimales pueden constituir una herramienta útil para el estudio del desarrollo y regeneración de órganos y tejidos mediante la ingeniería tisular. El uso de adyuvantes con los implantes de biomateriales en combinación con la descompresión central presenta el potencial de proporcionar ventajas estructurales de los injertos óseos sin el riesgo asociado de su obtención autóloga. Los implantes pueden ser de diferentes materiales biocompatibles, como las espumas de fosfato de calcio que se obtienen de la hidrólisis de α-tcp hacia hidroxiapatita, que tiene lugar en condiciones fisiológicas no exotérmicas, resultando en la formación de unas espumas de hidroxiapatita sólidas con una arquitectura 3D que potencian la colonización tisular. Las proteínas óseas morfogénicas, como la BMP-2 (bone morphogenic protein 2), son potentes inductores osteogénicos y se pueden combinar con este material. El objetivo general de este estudio es evaluar la eficacia de la descompresión ósea central asociando la bioingeniería tisular y la terapia celular avanzada para el tratamiento de la ONCF en un modelo ovino. Los objetivos específicos son: 1. Verificar la capacidad de estimular la regeneración ósea por medio de la implantación de una espuma de fosfato de calcio cargada con BMP Verificar la capacidad de estimular la regeneración ósea por medio de la implantación de un constructo de matriz ósea colonizado con MSC autólogas expandidas ex vivo. 3. Verificar la capacidad de estimular la regeneración ósea por medio de la implantación de un constructo de matriz ósea colonizado con MSC alogénicas expandidas ex vivo. 4. Verificar el origen celular, la multiplicación y la diferenciación in vivo de las MSC implantadas en lesiones osteonecróticas que previamente han estado expandidas ex vivo y marcadas con proteína de fluorescencia verde (GFP). 4

5 5. Determinar cuáles de los diferentes productos de ingeniería tisular ensayados, basándose en matrices óseas combinadas con MSC autólogas o alogénicas o con un concentrado de médula ósea, tienen mayor capacidad de regeneración ósea. 6. Determinar cuál de las diferentes concentraciones de MSC autólogas o alogénicas es la más adecuada para estimular la regeneración ósea. El modelo experimental consistió en inducir experimentalmente una lesión de ONCF en la extremidad derecha de 38 ovejas adultas mediante la introducción hasta el centro de la cabeza femoral de una sonda semipercutánea de crioterapia con control de temperatura regulada con los gases helio y argón. Al cabo de seis semanas de la inducción de la lesión, las ovejas se dividieron en seis grupos terapéuticos, donde la descompresión central se asoció a uno de los tratamientos establecidos, excepto el grupo control, al cual no se le aplicó ningún tratamiento añadido. Grupo A. Tratamiento con células mesenquimales obtenidas de concentrado de médula ósea y espuma de fosfato de calcio. Grupo B. Tratamiento con espuma de fosfato de calcio cargada con BMP-2. Grupo C. Tratamiento con un constructo de matriz ósea combinada con MSC expandidas ex vivo obtenidas de médula ósea autóloga a dosis alta. Grupo D. Tratamiento con un constructo de matriz ósea combinada con MSC expandidas ex vivo obtenidas de médula ósea autóloga a dosis baja. Grupo E. Tratamiento con un constructo de matriz ósea combinada con MSC expandidas ex vivo obtenidas de médula ósea alogénica a dosis alta. Grupo F. Tratamiento con un constructo de matriz ósea combinada con MSC expandidas ex vivo obtenidas de médula ósea alogénica a dosis baja. Grupo G. Tratamiento de descompresión ósea central. Después de un seguimiento total de 12 semanas, donde se hizo un seguimiento clínico y analítico de los animales, la ONCF se evaluó por radiología, microtomografía computada (micro-tc), ensayos biomecánicos, análisis histológico y análisis inmunohistoquímico con la finalidad de evaluar el potencial de regeneración ósea de cada tratamiento. 5

6 2. Resultados En todos los grupos experimentales, seis semanas después de la inducción de la lesión de ONCF mediante crioterapia, se volvió a realizar una segunda intervención quirúrgica para implantar todos los tratamientos experimentales correspondientes a cada grupo de estudio. Los tratamientos se realizaron siguiendo un procedimiento similar al que se realiza en la práctica clínica, donde a través de un trocar se implantaron los tratamientos experimentales hasta el centro de la cabeza femoral. En todos los casos se siguió una evaluación clínica y analítica postoperatoria de los animales hasta el final del periodo de estudio de los tratamientos experimentales de seis semanas. Evaluaciones clínicas y analíticas En las horas postoperatorias posteriores a las cirugías de inducción de la lesión de ONCF y de los tratamientos experimentales, los animales presentaron signos de cojera en la extremidad intervenida. No se observaron complicaciones quirúrgicas durante las intervenciones realizadas. Se estudió la evolución de la media de peso así como los porcentajes de variaciones de peso durante el periodo de tratamiento (6 semanas) y experimental global (12 semanas) entre los diferentes grupos de tratamiento. No se observaron diferencias estadísticamente significativas en los cambios de peso entre los grupos experimentales. En las analíticas sanguíneas realizadas con muestras de sangre basal (antes de cualquier tipo de intervención), antes del tratamiento seis semanas después de la inducción de la lesión de ONCF y al final del periodo de estudio después de las seis semanas de tratamiento, se valoraron los diferentes parámetros para estudiar la presencia de algún tipo de reacción de nivel sistémico. No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los diferentes parámetros analíticos ni bioquímicos que indicaran una respuesta inmunitaria, ni daño hepático ni cardiovascular en los animales de experimentación. Únicamente se observó 6

7 un incremento en el recuento plaquetario del grupo control a diferencia del resto de grupos con tratamientos experimentales. Evaluaciones radiológicas y micro-tc Se obtuvieron imágenes mediante radioscopia antes de la lesión de ONCF, a las seis semanas de la inducción de la lesión y a las seis semanas del tratamiento experimental. Observamos que este sistema es útil para determinar las proyecciones necesarias en el momento de la cirugía, pero no proporciona suficiente resolución para poder diferenciar cambios en el tejido óseo de la cabeza femoral. Una vez obtenidas las muestras de las cabezas femorales, se escanearon y evaluaron por micro-tc. Para la cuantificación ósea se definió un protocolo de cuantificación a partir de las imágenes obtenidas donde se establecieron diferentes zonas de interés de las cabezas femorales ovinas. Principalmente se compararon las zonas correspondientes al canal de descompresión central, las zonas de tejido óseo trabecular alejado de la lesión y la zona de tejido óseo trabecular adyacente al canal de descompresión central donde se indujo la lesión de osteonecrosis y posteriormente se aplicaron los tratamientos. Se ha visto que en las zonas correspondientes al canal de descompresión central se observa una gran variabilidad debido a la diferente disposición de los canales dentro de la cabeza femoral y a la presencia o no de restos de material de los tratamientos experimentales en diferentes grados de reabsorción. Las zonas de tejido trabecular alejadas de la lesión presentan valores similares entre los grupos en relación con la cantidad de hueso, pero valores variables en relación con la estructura de este, propia de cada individuo. Finalmente, en la zona de tejido óseo adyacente al canal de descompresión central en contacto con los tratamientos aplicados no se vieron diferencias en los parámetros estudiados que indicaran una mayor capacidad regenerativa de un tratamiento respecto a los otros. Análisis biomecánico El análisis biomecánico para determinar el módulo de compresión del tejido óseo de las cabezas femorales se realizó en cuatro zonas previamente establecidas en todas las muestras. 7

8 Los valores de la media calculados para el test biomecánico realizados en la zona inmediatamente adyacente a la aplicación del tratamiento son menores respecto a los valores de la zona de tejido óseo alejado de la lesión, zona considerada como tejido óseo control. Los resultados obtenidos del análisis biomecánico no muestran diferencias estadísticamente significativas entre los módulos de compresión del tejido óseo entre los diferentes tratamientos experimentales aplicados. Análisis histológico e inmunohistoquímico El análisis histológico de los grupos experimentales ha consistido en la evaluación del marcaje vital óseo de la tetraciclina mediante microscopia de fluorescencia y, por otro lado, en la evaluación de la tinción con azul de toluidina mediante microscopia óptica. En la evaluación de los marcajes con tetraciclina se observó que todos los grupos experimentales presentaban cúmulos de células con un mayor nivel de fluorescencia correspondientes a los depósitos de tetraciclina sobre el calcio del tejido óseo formado de novo. Esto indica que ha habido remodelación ósea y que esta es más evidente en las trabéculas óseas más cercanas a la zona adyacente al tratamiento, donde el marcaje es más intenso. No obstante, también aparecen otras zonas alejadas del canal de descompresión central con marcaje vital por tetraciclina en las trabéculas. Esto es debido al proceso autólogo de remodelación del tejido óseo, el cual ha continuado en función del metabolismo de cada animal y de la nueva distribución de cargas en la cabeza femoral que tiene que soportar. Por estos motivos se observa un engrosamiento del hueso cortical a nivel femoral y una densificación trabecular en la zona superior del canal de descompresión central. En la evaluación de las tinciones por azul de toluidina de las muestras procesadas de cada grupo experimental se puede observar que ha habido remodelación ósea sobre el tejido adyacente al canal de descompresión central donde se han implantado los tratamientos experimentales. Esta remodelación se puede observar cómo ha tenido lugar sobre las trabéculas óseas preexistentes del hueso huésped afectadas por la osteonecrosis inducida por la crioterapia. En los grupos A y B se observa, además, remodelación ósea en las trabéculas periféricas al canal de descompresión central y restos de gránulos de fosfato de calcio en diferentes grados de absorción por acción de células de apariencia osteoclástica. 8

9 En los grupos de tratamiento celular C, D, E y F, también se observa remodelación ósea en forma de aposición de hueso laminar sobre las trabéculas óseas cercanas al canal de descompresión central, así como en la matriz ósea combinada con las MSC autólogas y alogénicas. En todos los grupos experimentales se pueden observar las líneas de cementación típicas del tejido óseo que marcan la acción de los osteoclastos precedentes al depósito osteoblástico de la matriz extracelular que será seguido por la mineralización del tejido óseo. A continuación se pueden observar las imágenes representativas de cada grupo experimental. Las imágenes de la izquierda corresponden a una imagen sagital obtenida por micro-tc que se corresponde con el mismo plano que las imágenes de la derecha, que son una composición de imágenes obtenidas por microscopia de fluorescencia. Las flechas de las imágenes indican las zonas periféricas del canal de descompresión central donde se ha observado la remodelación ósea. 9

10 Conclusiones Una vez obtenidos y analizados los resultados del proyecto y puestos en común conjuntamente con todos los investigadores que han participado en el mismo, hemos dado respuesta a los objetivos planteados que se describen a continuación. Todos los tratamientos estudiados han estimulado la regeneración ósea en los animales de experimentación. En mayor o menor medida, se observa formación de hueso nuevo sobre las trabéculas preexistentes. Aun así, a partir de los datos experimentales no se observan diferencias significativas entre los tratamientos aplicados, ni desde el punto de vista biomecánico, ni a partir de los resultados de micro-tc o histología. Esto podría 10

11 deberse a un periodo de tratamiento corto, ya que aunque sí que se observa una estimulación de la formación ósea en todos los grupos experimentales, no se pueden detectar diferencias estadísticamente significativas entre ellos. En el caso de la verificación del origen celular y de la proliferación y diferenciación in vivo de las MSC marcadas con GFP, estamos a la espera de poder valorar las muestras experimentales de los grupos E y F. Para poder realizar los estudios inmunohistoquímicos de detección de las células marcadas con GFP es necesaria la descalcificación previa del tejido para poder manipularlo de forma adecuada, pero es un procedimiento lento que puede tardar meses en completarse. Esperamos que a medida que avancemos en el proceso de las muestras estos resultados puedan verse reflejados en una futura publicación. 3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas En el presente proyecto se ha realizado la reproducción lo más fiel posible de la situación clínica real de la enfermedad de osteonecrosis de cabeza femoral en un animal de experimentación. Los tratamientos obtenidos se han demostrado seguros gracias a los análisis clínicos y analíticos obtenidos en los animales de experimentación, ya que no se han observado alteraciones sistémicas ni analíticas que sugieran un daño para el organismo. Todos los tratamientos aplicados estimulan la regeneración ósea, en mayor o menor medida, ya que han inducido la formación de hueso de novo sobre trabéculas preexistentes en la zona de la lesión. Los resultados obtenidos en el estudio permiten el desarrollo de un ensayo clínico para evaluar la eficacia y seguridad de la aplicación de un producto de bioingeniería tisular compuesto por gránulos de trifosfato de calcio beta y BMP-2 o concentrado de médula ósea autóloga en pacientes afectados por osteonecrosis de cabeza femoral o en otros pacientes que requieran una estimulación de la regeneración ósea. Los resultados obtenidos permiten considerar la realización de una segunda fase del ensayo clínico en curso Terapia celular autóloga con células madre adultas en la osteonecrosis de cabeza femoral, realizado en el HUVH, con una nueva perspectiva de tratamiento con células madre mesenquimales adultas alogénicas. 11

12 4. Bibliografía científica generada Actualmente estamos en fase de preparación de publicaciones derivadas directamente del proyecto financiado donde se describan los resultados obtenidos. 12