INFORME DE VALIDACIÓN DEL MÉTODO DE DETERMINACIÓN DE HISTAMINA EN PRODUCTOS DE LA PESCA MEDIANTE KIT ENZIMÁTICO DESARROLLADO POR BioSystems S.A.

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1 INFORME DE VALIDACIÓN DEL MÉTODO DE DETERMINACIÓN DE HISTAMINA EN PRODUCTOS DE LA PESCA MEDIANTE KIT ENZIMÁTICO DESARROLLADO POR BioSystems S.A. ENERO 2017

2 INTRODUCCIÓN La validación de un método de ensayo consiste en un estudio sistemático que permite conocer si las características técnicas del mismo cumplen las especificaciones relativas al uso previsto. La validación de un método será poco exhaustiva, limitándola a la comprobación del cumplimiento de las características especificadas en aquellos métodos que se consideran de referencia, y mucho más completa y exhaustiva en las nuevas metodologías analíticas, en cuyo caso, si es posible la validación debe basarse en normas reconocidas. Existen algunas normas ISO para la validación de métodos microbiológicos, como es el caso de la ISO 16140:2003 Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Protocolo de validación de métodos alternativos, sin embargo no hay normas disponibles para la validación de ensayos físico-químicos alternativos, aunque sí guías ampliamente reconocidas con protocolos para la validación de métodos de ensayo, y que sirven de referencia a las entidades que acreditan el cumplimiento de la UNE-EN ISO/IEC 17025:2005 como son por ejemplo la guía Eurachem ( The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics ), o el documento del CODEX Guidelines on Establishing methods criteria for the identification of relevant analytical methods. Además, la DECISIÓN DE LA COMISIÓN 2002/657 de 12 de agosto de 2002, por la que se aplica la Directiva 96/23/CE del Consejo en cuanto al funcionamiento de los métodos analíticos y la interpretación de los resultados, establece normas relativas a los métodos analíticos de muestras oficiales, y fija criterios comunes de interpretación de los resultados analíticos por parte de los laboratorios oficiales de control. Concretamente, en su artículo 3, especifica que los Estados miembros garantizarán que los métodos analíticos hayan sido validados de acuerdo con los procedimientos que se especifican en dicha Decisión. ANFACO-CECOPESCA ha recopilado estas y otras referencias bibliográficas en el Procedimiento PG/0/06 para la validación de métodos de ensayo, integrado en el sistema de calidad según la norma UNE-EN ISO/IEC 17025:2005, y que tiene por objeto definir la operativa establecida por ANFACO-CECOPESCA para la validación de métodos o procedimientos de ensayo y la definición de los formatos aplicables, en base a los siguientes documentos: AOAC International (1998). AOAC Peer-verified methods program. Manual on policies and procedures. Maryland. USA.

3 DECISIÓN DE LA COMISIÓN (2002/657/CE) de 12 de agosto de 2002, por la que se aplica la Directiva 96/23/CE del Consejo en cuanto al funcionamiento de los métodos analíticos y la interpretación de los resultados. DIRECTIVA 98/53/CE, de la Comisión, de 16 de julio de 1998, por la que se fijan métodos de toma de muestras y de análisis para el control oficial del contenido máximo de algunos contaminantes en los productos alimenticios. Ellison, S L R, Rosslein, M and Williams A. (2000). Quantifying Uncertainty in Anaytical Measurement. 2ª edición. EURACHEM/CITAC Guide. EURACHEM-GUIDE (1998). The fitness for purpose of analytical methods: A laboratory guide to method validation and related topics. LGC, Teddington. Horwitz, W. (1998). A simple Method for Evaluating Data from an Interlaboratory Study. Journal of AOAC International Vol. 81, No. 6. Hotwitz, W. (2003). Validation: An invisible component of Measurament. AOAC International. Huber, L. (1998). Validation of Analytical Methods: Review and Strategy. LC-GC International,pp J.C. Miller, J.N. Miller. (1993). Estadística para química analítica Addison-Wesley Iberoamericana. 2ª edición. Statistical Subcommittee of the AMC. (2004). The amazing Horwitz function. Technical Brief No.17 July. Royal Society of Chemistry. Thompson, M. (2000). Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb concentrations in relation to fitness for purpose criteria in proficiency testing. Analyst, Thompson, M, Ellison, S. L.R. and Wood, R. (2002). Harmonized guidelines for singlelaboratory validation of methods of analysis. IUPAC Technical report. Pure Appl. Chem., vol 74, Nº 5, pp

4 IDENTIFICACIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO VALIDADO Nombre completo del método: Procedimiento para la determinación de histamina mediante la utilización de un kit enzimático y posterior medida en un analizador automático. Tipo de método: Cuantitativo Analito: Histamina Unidades: mg/kg Matriz: atún crudo, atún al natural, atún en aceite, sardina fresca, sardina en aceite, semiconserva de anchoa Rango: de 10 a 200 mg/kg Método de referencia utilizado: Analito, rango y unidades: Histamina, rango de 10 a 500 mg/kg. Acreditación: PEE/1/119, acreditado por ENAC según UNE-EN ISO/IEC (Anexo Técnico nº 96/LE230) Matriz: Productos de la pesca, de la acuicultura y sus derivados Método: HPLC- detector UV

5 PARÁMETROS DE VALIDACIÓN Selectividad y Especificidad Linealidad Exactitud Precisión Robustez Límites de detección y de cuantificación PRUEBAS REALIZADAS SELECTIVIDAD Y ESPECIFICIDAD Definición: La selectividad y especificidad es la capacidad de un método de distinguir entre el analito que se está midiendo y otras sustancias. Descripción: Se realizó la prueba de selectividad a partir de extractos de las matrices de estudio adicionados con 1000 mg/kg de posibles interferentes. En este caso se realizó con agua, tiramina, putrescina y agmatina. Para ello se prepararon extractos sin histamina y extractos con 25 mg/kg de histamina con los distintos interferentes de estudio. Se midieron las concentraciones obtenidas en el equipo. Los resultados obtenidos han sido los siguientes: HISTAMINA 0 25 ATUN CRUDO COMPUESTOS REACCIÓN CRUZADA (1000 ppm) S AGUA 3,4 Tyramine 3,4 Putrescine 5,2 Agmatine 65,8 AGUA 28,2 Tyramine 26,7 Putrescine 28,7 Agmatine 90,2 HISTAMINA 0 25 ATÚN AL NATURAL COMPUESTOS REACCIÓN CRUZADA S (1000 ppm) AGUA 1,6 Tyramine 1,8 Putrescine 3,3 Agmatine 60,2 AGUA 25,6 Tyramine 25,2 Putrescine 29,4 Agmatine 84,7 ATÚN EN ACEITE SARDINA FRESCA HISTAMINA COMPUESTOS REACCIÓN CRUZADA (1000 ppm) S HISTAMINA COMPUESTOS REACCIÓN CRUZADA (1000 ppm) S 0 25 AGUA 4,2 Tyramine 4,2 Putrescine 5,8 Agmatine 52,7 AGUA 28,9 Tyramine 28,2 Putrescine 29,8 Agmatine 77, AGUA 5,1 Tyramine 4,8 Putrescine 4,9 Agmatine 56,2 AGUA 28,3 Tyramine 29,7 Putrescine 29,0 Agmatine 79,6

6 HISTAMINA 0 25 SARDINA EN ACEITE COMPUESTOS REACCIÓN CRUZADA S (1000 ppm) AGUA 4,8 Tyramine 4,2 Putrescine 4,3 Agmatine 61,2 AGUA 30,1 Tyramine 30,5 Putrescine 30,8 Agmatine 85,9 HISTAMINA 0 25 SEMICONSERVA ANCHOA COMPUESTOS REACCIÓN CRUZADA (1000 ppm) S AGUA 3,6 Tyramine 4,0 Putrescine 4,8 Agmatine 51,6 AGUA 28,5 Tyramine 29,2 Putrescine 30,7 Agmatine 75,1 Los resultados obtenidos muestran que la agmatina causa interferencias con el kit y por tanto debe indicarse en las instrucciones del mismo que si las muestras contienen agmatina las medidas proporcionadas por el mismo no son adecuadas. LINEALIDAD Definición: Relación que existe entre la concentración de un determinado analito y la respuesta proporcionada por el método. Descripción: Se evalúa la linealidad en el rango de 10 a 200 mg/kg, comprobando el coeficiente de regresión r2 y el Factor Respuesta/Concentración:

7 Valor obtenido Criterio de aceptabilidad Se calcula el coeficiente de regresión lineal (r 2 ) y el factor respuesta/concentración en cada nivel de concentración entre 10 y 200 mg/kg. r 2 : 0,9999 Factor Respuesta / Concentración: Ver siguiente tabla r 2 0,99 Factor Respuesta / Concentración: % (Sólo un punto podrá desviarse de este criterio, y tendrá que cumplir el intervalo máximo de %) Concentración patrón de histamina Respuesta 10,03 10,03 9,86 9,80 50,89 50,61 50,67 50,67 99,50 99,15 99,50 99,55 150,85 150,33 150,33 150,91 199,16 198,30 199,62 198,59 Respuesta media 9,93 50,71 99,42 150,61 198,92 FR 0,99 1,01 0,99 1,00 0,99 % FR Conclusión: Se observó que la recta es lineal en el intervalo de 10 a 200 mg/kg presentando un r 2 de 0,9999 y que cumple los criterios factor respuesta/concentración establecidos.

8 EXACTITUD Definición: La exactitud es el grado de concordancia entre el resultado del ensayo y un valor de referencia aceptado. Descripción: Se obtiene mediante el estudio de recuperaciones, en todo el rango de trabajo, desde 10 hasta 200 mg/kg, de modo que en cada nivel de concentración se analizaron las matrices de estudio. Se considera el método exacto si la recuperación media en todos los niveles de concentración cumple los criterios establecidos por la AOAC. S EXACTITUD RECUPERACIÓN VALOR DE REFERENCIA MATRIZ Nº Réplicas % REC. MEDIO CRITERIO se acepta? 10 ATÚN FRESCO SI 50 ATÚN FRESCO SI 100 ATÚN FRESCO SI 150 ATÚN FRESCO SI 200 ATÚN FRESCO SI 10 ATÚN AL NATURAL SI 50 ATÚN AL NATURAL SI 100 ATÚN AL NATURAL SI 150 ATÚN AL NATURAL SI 200 ATÚN AL NATURAL SI 10 ATÚN EN ACEITE SI 50 ATÚN EN ACEITE SI 100 ATÚN EN ACEITE SI 150 ATÚN EN ACEITE SI 200 ATÚN EN ACEITE SI

9 VALOR DE REFERENCIA MATRIZ Nº Réplicas % REC. MEDIO CRITERIO se acepta? 10 SARDINA FRESCA SI 50 SARDINA FRESCA SI 100 SARDINA FRESCA SI 150 SARDINA FRESCA SI 200 SARDINA FRESCA SI 10 SARDINA EN ACEITE SI 50 SARDINA EN ACEITE SI 100 SARDINA EN ACEITE SI 150 SARDINA EN ACEITE SI 200 SARDINA EN ACEITE SI 10 SEMICONSERVA DE ANCHOA SI 50 SEMICONSERVA DE ANCHOA SI 100 SEMICONSERVA DE ANCHOA SI 150 SEMICONSERVA DE ANCHOA SI 200 SEMICONSERVA DE ANCHOA SI ORGANIZADOR MATRIZ REFERENCIA MATERIALES DE REFERENCIA VALOR ASIGNADO BIOSYSTEMS se acepta? FAPAS CANNED FISH TET040RM 16.6 ± SI FAPAS CANNED FISH ( ) 204 SI INTERLABORATORIO ORGANIZADOR MATRIZ REFERENCIA Z SCORE se acepta? FAPAS CANNED FISH FOOD CHEMISTRY PROFICIENCY TEST SI Conclusiones: El método se considera exacto en el rango de trabajo desde 10 a 200 mg/kg, en todas las matrices objeto de ensayo (atún fresco, atún al natural, atún en aceite, sardina fresca, sardina en aceite y semiconserva de anchoa), de acuerdo a los intervalos de recuperación aceptables establecidos por la AOAC. Asimismo, la participación en ejercicios intercomparativos y la medición de materiales de referencia arrojan resultados satisfactorios.

10 PRECISIÓN Definición: Grado de concordancia entre resultados de ensayos independientes obtenidos en condiciones predeterminadas. Descripción: La precisión se suele expresar como imprecisión mediante el cálculo de desviaciones estándar relativas calculadas y las desviaciones relativas estándar de Horwitz. VALOR DE REFERENCIA PLANIFICACIÓN Y S MATRIZ Nº Réplicas PRECISIÓN RDS RSD CALCULADA RSD Horwitz CRITERIO se acepta? 10 ATÚN FRESCO RSD CALC RSD HOR SI 50 ATÚN FRESCO RSD CALC RSD HOR SI 100 ATÚN FRESCO RSD CALC RSD HOR SI 150 ATÚN FRESCO RSD CALC RSD HOR SI 200 ATÚN FRESCO RSD CALC RSD HOR SI 10 ATÚN AL NATURAL RSD CALC RSD HOR SI 50 ATÚN AL NATURAL RSD CALC RSD HOR SI 100 ATÚN AL NATURAL RSD CALC RSD HOR SI 150 ATÚN AL NATURAL RSD CALC RSD HOR SI 200 ATÚN AL NATURAL RSD CALC RSD HOR SI 10 ATÚN EN ACEITE RSD CALC RSD HOR SI 50 ATÚN EN ACEITE RSD CALC RSD HOR SI 100 ATÚN EN ACEITE RSD CALC RSD HOR SI 150 ATÚN EN ACEITE RSD CALC RSD HOR SI 200 ATÚN EN ACEITE RSD CALC RSD HOR SI 10 SARDINA FRESCA RSD CALC RSD HOR SI 50 SARDINA FRESCA RSD CALC RSD HOR SI 100 SARDINA FRESCA RSD CALC RSD HOR SI 150 SARDINA FRESCA RSD CALC RSD HOR SI 200 SARDINA FRESCA RSD CALC RSD HOR SI

11 VALOR DE REFERENCIA MATRIZ Nº Réplicas RSD CALCULADA RSD Horwitz CRITERIO se acepta? 10 SARDINA EN ACEITE RSD CALC RSD HOR SI 50 SARDINA EN ACEITE RSD CALC RSD HOR SI 100 SARDINA EN ACEITE RSD CALC RSD HOR SI 150 SARDINA EN ACEITE RSD CALC RSD HOR SI 200 SARDINA EN ACEITE RSD CALC RSD HOR SI SEMICONSERVA DE ANCHOA SEMICONSERVA DE ANCHOA SEMICONSERVA DE ANCHOA SEMICONSERVA DE ANCHOA SEMICONSERVA DE ANCHOA RSD CALC RSD HOR SI RSD CALC RSD HOR SI RSD CALC RSD HOR SI RSD CALC RSD HOR SI RSD CALC RSD HOR SI Conclusiones: El método se considera preciso en todo el rango de trabajo, desde 10 a 200 mg/kg en todas las matrices evaluadas: atún fresco, atún al natural, atún en aceite, sardina fresca, sardina en aceite y semiconserva de anchoa.

12 ROBUSTEZ Definición: Susceptibilidad de un método analítico a los cambios de las condiciones experimentales, como puede ser el tipo de matriz que se analice y que pueden expresarse en forma de lista de los materiales de la muestra, los analitos, las condiciones de almacenamiento o las condiciones ambientales o de preparación de la muestra en las que puede aplicarse el método tal cual o con determinadas modificaciones menores. Descripción: La idea fundamental para la prueba de la robustez es introducir deliberadamente pequeñas variaciones en el método y observar los efectos. Si los resultados se alteran, los usuarios deben ser advertidos de no desviarse de las condiciones especificadas en el manual de instrucciones. Para esta determinación se aplica el Test de Youden y Steiner para la evaluación de la robustez de un método químico analítico. Para ello a una muestra de conserva de atún al natural adicionada con 50 mg/kg de histamina se le varió el volumen de extracción (20, 25 y 30 ml), el tiempo de medida tras la extracción (10, 20 y 30 minutos) así como el tiempo de almacenamiento de la muestra antes del análisis a temperatura ambiental (30 minutos, 1 hora y 2 horas). CONSERVA DE ATÚN AL NATURAL CON 50 PPM DE HISTAMINA PARÁMETROS DE LA ROBUSTEZ VALOR 1 VALOR 2 VALOR 3 A. VOLUMEN DE EXTRACCIÓN 20 ml 25 ml 30 ml B. TIEMPO DE EXTRACCIÓN 10 min 20 min 30 min C. TIEMPO ALMACENAMIENTO MUESTRA ANTES DEL ANÁLISIS A TEMPERATURA AMBIENTAL 30 min 1 hora 2 horas Valor del factor F Combinación de las determinaciones A: 20 ml a: 30 ml A A A A a a a a a a : 25 ml B: 10 min b: 20 min B B b b B B b b b b : 30 min C: 30 minutos c: 1 hora C c C c C c C c c c : 2 horas 47,5 46,6 47,2 48,8 50,3 51,5 47,8 48,2 48

13 Comparación de Variables (X-x) Diferencias promedio (D i ) SD de las diferencias (SD i ) SD del método en 50 mg/kg para atún al natural Criterio de aceptación Cumplimiento Δ A, a 2,1 1,1 SI Δ A, a 0,9 0,5 SI Δ a, a 1,6 0,8 SI Δ B, b 1,9 1,0 SI Δ b,b 0,5 0,3 1,6 SD i SD 50 SI Δ C, c 0,9 0,5 SI Δ B, b 2,0 1,0 SI Δ C, c 1,8 1,0 SI Δ c, c 1,5 0,8 SI Conclusión: El método se considera robusto, pues la desviación estándar de las diferencias es, en todas las combinaciones, menor que la desviación estándar del método a ese nivel de concentración en la matriz de atún al natural evaluada.

14 LÍMITE DE DETECCIÓN Y LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN Definición: Límite de detección: concentración más baja de analito que se puede detectar en la muestra pero no necesariamente cuantificar con las condiciones experimentalmente establecidas. Límite de cuantificación: menor concentración del analito que puede determinarse con precisión y exactitud aceptables en una muestra, bajo las condiciones del método utilizado (verificado experimentalmente). Descripción: Límite de detección: Para el cálculo de LOD se aplica la siguiente fórmula: LOD = Donde: X es el valor medio analítico de la matriz sin adicionar y s es la interjección de 0 la recta; y m es la pendiente de la recta. Límite de cuantificación: se estima mediante la fórmula 3xLOD. Se verifica posteriormente el límite de cuantificación realizando 10 réplicas en cada matriz. Los resultados obtenidos han sido los siguientes: SARDINA ACEITE SEMICONSERVA ANCHOA ATUN NATURAL ATUN ACEITE ATUN CRUDO SARDINA FRESCA LOD = 5,77 2,85 4,28 4,58 0,29 7,01 LOQ = 3 x LOD 17 8, ,9 21 Se verificaron los límites de cuantificación en todos los casos a 10 mg/kg obteniéndose los siguientes resultados: b

15 MATRIZ VALOR DE REFERENCIA MUESTRA SIN ADICIÓN FINAL MEDIA % RECUPERACIÓN BIAS Sr RSD 8,97 8,47 8,85 8,35 9,61 9,11 8,97 8,47 ATÚN FRESCO 10 9,35 8,85 0,50 9,35 8,85 8, ,10 8,60 9,86 9,36 8,85 8,35 9,10 8,60 MATRIZ VALOR DE REFERENCIA MUESTRA SIN ADICIÓN FINAL AVERAGE % RECUPERACIÓN BIAS Sr RSD 11,08 9,87 11,00 9,79 10,97 9,76 11,03 9,82 ATÚN AL NATURAL 10 11,30 10,09 1,21 10,78 9,57 9, ,16 1,65 10,94 9,73 11,19 9,98 10,82 9,61 10,89 9,68 MATRIZ VALOR DE REFERENCIA MUESTRA SIN ADICIÓN FINAL AVERAGE % RECUPERACIÓN BIAS Sr RSD 12,39 9,36 13,12 10,09 12,88 9,85 12,89 9,86 ATÚN EN ACEITE 10 12,71 9,68 3,03 13,14 10,11 9, ,64 9,61 11,91 8,88 12,64 9,61 12,28 9,25 MATRIZ VALOR DE REFERENCIA MUESTRA SIN ADICIÓN FINAL AVERAGE % RECUPERACIÓN BIAS Sr RSD 17,34 11,40 17,82 11,88 16,37 10,43 15,41 9,47 SARDINA FRESCA 10 15,89 9,95 5,94 15,41 9,47 10, ,82 7,97 15,65 9,71 16,62 10,68 16,13 10,19 15,65 9,71 MATRIZ VALOR DE REFERENCIA MUESTRA SIN ADICIÓN FINAL AVERAGE % RECUPERACIÓN BIAS Sr RSD 14,63 9,78 14,82 9,97 14,79 9,94 14,73 9,88 SARDINA EN ACEITE 10 14,53 9,68 4,85 14,79 9,94 9, ,59 9,74 14,29 9,44 14,63 9,78 14,22 9,37 MATRIZ SEMICONSERVA DE ANCHOA VALOR DE REFERENCIA MUESTRA SIN ADICIÓN FINAL 0,34 3,86 0,38 3,97 0,21 2,11 AVERAGE % RECUPERACIÓN BIAS Sr RSD 12,82 9,82 12,10 8,10 11,77 8,77 12,52 9, ,92 8,92 3,00 12,22 8,22 9, ,59 6,51 12,62 9,62 12,54 9,54 11,92 8,92 12,31 9,31

16 Conclusión: Los límites de detección obtenidos han sido los siguientes: Atún crudo: 0,29 mg/kg Atún al natural: 4,28 mg/kg Atún en aceite: 4,58 mg/kg Sardina fresca: 7,01 mg/kg Sardina en aceite: 5,77 mg/kg Semiconserva de anchoa: 2,85 mg/kg Se verificó que los límites de cuantificación obtenidos en todas las matrices de estudio han sido de 10 mg/kg y se observó que en todos los casos las RSD son menores del 10 %. EVALUACIÓN VALIDACIÓN: Fecha: 25/01/17 RESUMEN Parámetro Características del método Rango validado mg/kg Exactitud Aceptable en todo el rango Precisión RSD CALC RSD HOR Selectividad / Especificidad Confirmación de la selectividad y especificidad con la experiencia (interferencia con agmatina) Robustez Método robusto Linealidad Método lineal Límite de cuantificación 10 mg/kg Validado por: Validación Firma y Fecha Nombre: Vanesa Losada Iglesias Cargo: Técnico especialista área de Asistencia Técnica Aceptada Rechazada 25/01/2017

17 ANEXO I CRITERIOS DE ACEPTACIÓN (EXACTITUD Y PRECISIÓN)

18 CRITERIOS DE EXACTITUD: Tabla de intervalos de recuperación aceptables Intervalos de recuperaciones (%) (AOAC Peer Verified Methods) Analito (%) Analito ratio Unidades Media recomendada (%) % % % % ppm ppm ppm ppb ppb ppb

19 CRITERIOS DE PRECISIÓN: La precisión de un método se evalúa comparando el valor obtenido de RSD con el valor de referencia (RSD de Horwitz) que dependerá del nivel de concentración y se calcula según las ecuaciones descritas a continuación: RSD Horwitz Horwitz *100 ; para el cálculo de la Horwitz c Para concentraciones <120 ppb; 0,22c Horwitz mr Para concentraciones entre 120 ppb y 13.8%; Horwitz 0,02c mr 0,8495 Para concentraciones > 13.8%; Horwitz 0,01c mr 0,5

20 ANEXO II CÁLCULO DE INCERTIDUMBRE

21 INCERTIDUMBRE Determinación de histamina INCERTIDUMBRE COMBINADA Y EXPANDIDA CONTRIBUCIONES A LA INCERTIDUMBRE TOTAL Fuentes de incertidumbre Incertidumbre estándar (U) U (P) 0,026 U (R) 0,068 CÁLCULO DE LA INCERTIDUMBRE Contribución global U 2 2 U(P) U R I UK (Factor de cobertura K=2) INCERTIDUMBRE COMBINADA (Contribución global) U INCERTIDUMBRE EXPANDIDA (Contribución global) I INCERTIDUMBRE DEL VALOR OBTENIDO I 0,073 0,146 0,146 X C Siendo C el valor de la concentración obtenido en el ensayo EJEMPLOS DE APLICACIÓN CONCENTRACIÓN (g/100 g) INCERTIDUMBRE (contribución global) INCERTIDUMBRE EXPANDIDA INCERTIDUMBRE EXPANDIDA (%) 10 0,146 1, ,146 7, ,146 14, ,146 21, ,146 29,1 15 Contribuciones a la incertidumbre 0,1 0,1 0,1 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Precisión Exactitud