NUEVAS TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES DEL CAMARÓN

Transcripción

1 XI SIMPOSIO INTERNACIONAL DE CAMARON DE CULTIVO Y EXHIBICION COMERCIAL NUEVAS TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES DEL CAMARÓN NIMIADINA HERRERA T

2 LAS ENFERMEDADES EL MAYOR DESAFIO LA COSTOS DE PRODUCCION#1, ENFERMEDADES #2 EN ASIA LAS ENFERMEDADES SON #1

3 Cómo disminuimos el Identificación del agente causal de la enfermedad Técnicas no invasivas Alta especificidad y sensibilidad impacto? MANEJO - CONTROL The role of genomics in shrimp improvement. a.tassanakajon

4 TECNICAS DE DIAGNOSTICO ACTUALES Histopatología Hibridación in situ Ensayo de anticuerpos monoclonales, Inmunohistoquímica Cromatografía de flujo lateral Microscopía electrónica. Métodos moleculares (PCR, PCR de un paso, anidados, tiempo real, isotermal (aislada o loop mediated), digital.

5 Histórico

6

7 Frederick Sanger

8 ANALISIS DE LOS DATOS

9 DIAGNOSTICO MOLECULAR Incluye técnicas de biología molecular en beneficio de la salud humana y de las especies animales de interés económico, detectando y/o cuantificando secuencias genéticas específicas de ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN) o proteínas

10 Técnicas Moleculares Herramientas de la Biología Molecular Aloenzimas, Southern, Northern, Dot Blot RFLP s PCR- simples, multiples, cuantitativas Microsatélites AFLP s SECUENCIACION Sanger NGS MICROARREGLOS

11 PGH 3BILLONES DE PARES DE BASES ES DECIR 3GB GENOMA DEL CAMARON ES DE 2.5 GB

12 LOS OMA Genoma: Gen + cromosoma. Núcleo. Proteoma Metaboloma Microbioma La biología de sistemas se dedica a estudiar las interacciones que se están produciendo dentro de una célula en respuesta a cualquier cambio externo o interno y así establecer la red de interacciones (el interactoma).

13 Una hoja de ruta de la secuenciación

14 NGS Platforms Platform Template Preparation Chemistry Max Read length (bases) Run Times (days) Max Gb per Run Roche 454 Clonal-emPCR Pyrosequencing GS FLX Titanium Illumina MiSeq Illumina HiSeq Illumina Genome Analyzer IIX Life Technologies SOLiD4 Life Technologies Ion Proton Complete Genomics Helicos Biosciences Heliscope Pacific Biosciences SMRT Clonal-emPCR Pyrosequencing Clonal Bridge Amplification Clonal Bridge Amplification Clonal Bridge Amplification Clonal-emPCR Clonal-emPCR Gridded DNAnanoballs Single Molecule Single Molecule Reversible Dye Terminator Reversible Dye Terminator 2x x Reversible Dye Terminator [13][14] 2x Oligonucleotide 8- mer Chained Ligation Native dntps, proton detection Oligonucleotide 9- mer Unchained 7x Ligation [17][18][19] Reversible Dye Terminator Phospholinked Fluorescent Nucleotides ,000 (N50); 30, (max) [20]

15 15 DATOS

16 DIAGNOSTICO MOLECULAR 1. Especificidad (pueden detectar solo la molécula o microorganismo de interés), 2. Sensibilidad (son capaces de detectar la presencia de un solo microorganismo), VIH 3. Rapidez (se puede identificar un microorganismo en menos de 24 horas) y 4. Pueden ser automatizadas (permiten tener un diagnóstico en un menor tiempo y reducir los costos). 5. Identificar nuevos microorganismos, los cuales no había sido posible su cultivo e identificación por técnicas tradicionales 6. Permiten estudiar las poblaciones microbianas sin hacer aislamientos, de microorganismos altamente patógenos, los cuales pueden ser identificados muertos evitando así los riesgos de infección del analista 7. Nuevas variantes de enfermedades genéticas, cáncer, enfermedades infecciosas

17 Transportar la PCR desde la mesa de trabajo en el laboratorio a la Finca.

18 POCKIT Xpress Analizador de Acidos Nucleicos cubee mini centrifuga Pipetas 50ul 1000ul

19 Muestreo 1. Relacionado con las enfermedades de la lista de la OIE 2. Fines: a. vigilancia; b. certificación de existencias o de la instalación c. diagnóstico de la enfermedad.

20 Qué muestra tomar? dependen de la enfermedad o agente patógeno por detectar del tamaño de los animales el objetivo de los análisis, diagnóstico de una enfermedad manifiesta, una detección de portadores subclínicos del agente patógeno o una toma de muestras para la vigilancia dirigida con el fin de demostrar la ausencia de una determinada enfermedad. Guía de la OIE para la Vigilancia Sanitaria de los Animales Acuáticos (Corsin et al., 2009) y los capítulos sobre cada enfermedad en particular en este Manual Acuático.

21 Cómo preservo mis muestras? DNA ETANOL 95% GRADO MOLECULAR DNA Buffer de Lisis DNA Congelado RNA Muestras vivas RNA ETANOL 95% RNA Later o Trizol

22 Tipo y cantidad de muestra El número y tipo de muestras que deben tomarse para el análisis varían en función de cuál fin se persiga. Importante tomar el tejido adecuado donde se puede detectar el patógeno, la cantidad y la calidad de la muestra son importantes

23 una técnica 100% sensible y especifica, PCR.

24 Tamaño de la muestras De acuerdo al tamaño del espécimen

25 Tipo de muestra Estomago Tamaño de muestra 1 pieza Ems- IQ PLUS Intestino medio Muestra de heces 1 cm 1 cm < PL PLs PL PLs Agua del estanque 1.5 ml agua del estanque; Centrifugar la muestra a x g ( rpm, r = 5 ~ 8 cm) o en cubee durante 3 minutos. Desechar el sobrenadante y resuspender pellet en 100 μl de PBS. Ir al procedimiento de extracción paso 1

26 Muestra Plásmido de ADN de AHPND / EMS Cantidad de la prueba 50 copias / μl 100 <PL PLs 200 PL6 a PL 200 Estómago 1 pieza 200 Intestino medio 1 cm 200 Hepatopancreas 10-25% 200 Estanque de agua Organismo de alimentación (artemia, ostra, calamar y gusano de sangre) 1,5 ml de agua del estanque (véase la sección V, parte c) Límite de detección (Copias / reacción) mg 200 Muestra fecal 1 cm

27 Kit IQ PLUS un sólo formato todas las enfermedades

28 Procedimiento Muestreo Preparacion de la Muestra Extraccion de DNA/RNA 15~20 minutes Disolver la premezcla Agregar Acidos nucleicos 15~20 minutes Corrida en el POCKIT Resultados en la pantalla del POCKIT 57 minutes

29 1. IQ2000 Sistema para la Detección y Prevención del AHPND/EMS Toxina 1: Para detectar el factor de virulencia, toxina 1, y el plásmido asociado a la AHPND/EMS (la región más estable del plásmido del AHPND) 2. IQ REALTM Sistema Cuantitativo AHPND/EMS Toxina 1: Para detectar el factor de virulencia, de la toxina 1, y el marcador del plásmido asociado al AHPND/EMS- ( en la región más estable del plásmido del AHPND) 3. IQ Plus Kit para Detección de AHPND/EMS Toxina 1: Para detectar la IQ Plus la secuencia de la proteína Toxina 1 relacionada con la virulencia por AHPND/EMS en el plásmido en camarones de cultivos y en los ambientes de fincas, 4. IQ Plus kit para la detección del plásmido a AHPND/EMS: Para detectar y monitorear el plásmido asociado a Vibrio que puede o no contener el factor de virulencia la toxina 1.

30 IQ Plus AHPND/EMS Plásmido Multiplex iipcr para la detección cualitativa del plásmido o la toxina 1 en muestras de tejido de camarón (estómago, intestino medio), muestras fecales, PL, agua y alimentos vivos. Los fluorocromos o fluoróforos son VIC para Plásmido y NED para el IC en el kit de deteccion del plasmido. Para la deteccion de la Toxina 1 los flouroforos son FAM Y NED. Su uso es complementarios ya que cada Sistema tiene reactivos para la deteccion del control interno de las muestras. IQ Plus AHPND/EMS Toxina 1

31 Un laboratorio de PCR portátil En la granja En el laboratorio de diagnóstico

32 Resultados de la Prueba Mostrados en la pantalla Data almacenada en la tarjeta SD

33 Interpretar los Resultados 1-2 control positivo, 3 control negativo, 4 positivo ambos toxina 1 y plásmido; 5y7 negativo plásmido; 6 NTC;.

34 Formato IQ2000 IQ REAL IQ PLUS P IQ PLUS TOXIN 1 IQ2000 PLASMIDO 558 bp Ct 14< + <Ct TOXINA1 252bp Ct 14< + <Ct LIMITE DE DETECCION 100 copias 10 copias 10 copias 10 copias na

35 Detección de blanco: AHPND-asociado al plásmido Colección de muestras (intestino medio, estómago, heces, agua, alimentos vivos, u otra possible fuentes) Pruebas en el sitio Positiva Negativa Contiene el plásmido asociado al AHPND Debe hacer un confirmatorio con laboratorio central o local. Procedimiento de emergencia que pueda ser aplicada a la finca. No contiene plásmido asociado al AHPND. Debe continuar el monitoreo periódicamente.

36 Diagnóstico in situ (punto de atención): Eficaz para controlar / prevenir la enfermedad infecciosa mediante la detección temprana - Gestión de riesgos Genera resultados rápidos Mejorar el nivel de seguridad biológica Monitoreo en tiempo real Inicie el control de la epidemia temprano de forma oportuna Reducir las posibilidades de propagación de la enfermedad Minimizar las pérdidas económicas

37 Si todos avanzamos juntos, entonces el éxito se hace cargo de sí mismo. Henry Ford 37