Androstenedione ELISA

Transcripción

1 Instrucciones de Uso Androstenedione ELISA Inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa directa de androstenediona en suero humano. DB C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBLInternational.com D22335 Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 USO PROPUESTO Inmunoensayo enzimático para la determinación cuantitativa directa de androstenediona en suero humano. PRINCIPIO DEL ENSAYO El procedimiento del análisis sigue el principio básico de un análisis ELISA de la competencia. La competencia se produce entre un antígeno no marcado (presente en los estándares, controles y muestras de paciente) y un ntígeno marcado con enzima (conjugado) para un número limitado de sitios de enlace en la placa de micropocillos. Los procedimientos del lavado y de la decantación eliminan los materiales no ligados. Después del lavado, se añade el sustrato de enzima. La reacción enzimática se termina mediante la adición de la Solución de Paro. La absorbancia se mide en un lector de microplacas. La intensidad del color formado es inversamente proporcional a la concentración de androstenedione en la muestra. Un conjunto de normas se utiliza para trazar una curva estándar a partir de la cual se puede leer directamente la cantidad de androstenedione en las muestras de pacientes y controles. IMPLICACIONES CLÍNICAS Las glándulas suprarrenales y las gónadas producen androstenediona. Por ello, para evaluar el estado funcional de estas glándulas, es importante determinar el nivel de androstenediona en suero. La androstenediona es un precursor de la testosterona y la estrona. En hembras, se ha demostrado que además de las glándulas suprarrenales, los ovarios son una fuente importante de androstenediona. Se ha notificado que hay una fluctuación diaria de androstenediona durante el ciclo de ovulación. La principal producción de testosterona en hembras proviene de la conversión de otros andrógenos relacionados, especialmente la androstenediona. Un nivel anormal de testosterona en mujeres debe ir acompañado por la estimación de la androstenediona en el suero. El uso de la determinación de testosterona en suero junto con el inmunoensayo enzimático de la androstenediona puede utilizarse para determinar si el origen de la excesiva producción de andrógenos proviene de las glándulas suprarrenales o de los ovarios. ADVERTENCIAS O PRECAUCIONES 1. El personal que use el kit tiene que tener un entendimiento claro del protocolo de usot. Rendimiento fiable sólo podrán alcanzarse mediante la adhesión estricta y cuidadosa a las instruccionesproporcionadas 2. Controles o pools de sueros con alta y baja concentración deben ser incluidos en cada ensayo para asegurar la fiabilidad de los resultados. 3. Cuando se especifica el uso de agua para la dilución o reconstitución, utilizar agua desionizada o destilada. 4. Con el fin de reducir la exposición a sustancias potencialmente nocivas, se deben usar guantes al manipular los reactivos del kit y muestras humanas. 5. Deje que de los reactivos del kit y muestras alcancen la temperatura ambiente antes del uso y agitándolos suavemente hasta tener un buen homogenizado. Evita congelar y descongelar repetidamente. 6. La curva de calibración debe ser utilizada en cada ensayo. 7. Los controles deben ser incluídos en cada ensayo y debe hallarse dentro de los límites de aceptación. 8. Las técnicas inadecuadas en el procedimiento como: pipeteados imprecisos, lavados incompletos, así como el almacenamiento inadecuado de reactivos pueden causar que los valores de ensayo para el control no reflejen rangos establecidos. 9. La presencia de burbujas en los micropocillos afectará las densidades ópticas (DO). Retire con cuidado burbujas de los pozos antes de realizar la lectura. 10. La solución de sustrato (TMB) es sensible a la luz y debe mantenerse incolora cuando se almacena en. forma adecuada. La inestabilidad o contaminación pueden ser observadas por el cambio color a azul en cuyo caso no debe utilizarse. 11. Cuando dispense el sustrato y la solución de paro, no use pipetas cuando estos líquidos están en contacto con partes metálicas 12. Para evitar la contaminación de los reactivos, use una nueva punta de pipeta para dispensar cada reactivo, muestra, estándar y control. 13. Tome en cuenta el número de lote y la fecha de caducidad. No mezcle reactivos de diferentes lotes. No use reactivos vencidos. 14. Los reactivos químicos y los reactivos preparados o usados deben ser tratados como desechos peligrosos de acuerdo con las regulaciones nacionales sobre bioseguridad y pautas de seguridad. V6.2 / May 15, / 6

3 LIMITACIONES 1. Todos los reactivos del kit están calibrados para la determinación directa de la androstenedione suero humano. El kit no está calibrado para la determinación de androstenedione en saliva, plasma u otros especímenes de origen humano o animal. 2. No emplee muestras fuertemente hemolizadas, lipémicas, ictéricas ó sueros almacenados. 3. Las muestras o sueros que contienen azida o timerosal no son compatibles con este kit, ya que pueden dar lugar a falsos resultados. 4. Sólo el estándar A puede ser usado para diluír muestras altas. Sólo en diluyente de orina puede ser usado para diluír muestras de orinas altas. El uso de otro reactivo puede causar falsos resultados. 5. Los resultados obtenidos con este kit no deben utilizarse como base única para el diagnóstico clínico. Por ejemplo, la aparición de anticuerpos heterófilos en pacientes regularmente expuestos a animales o a productos de origen animal tiene el potencial de causar interferencias en las pruebas inmunológicas. En consecuencia, el diagnóstico clínico debe incluir todos los aspectos de los antecedentes de un paciente, incluyendo la frecuencia de exposición a productos de origen animal, si se sospecha que los resultados son falsos. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES DE SEGURIDAD MATERIAL POTENCIAL BIOPELIGROSO El suero humano usado en la preparación de los estándares y los controles ha sido probado y encontrado no reactivo para antígeno de superficie de hepatitis B y negativo a la prueba de anticuerpos contra el VHC y el virus de la inmunodeficiencia Humana (HIV). Sin embargo, no hay método de ensayo que puede garantizar totalmente la ausencia de HIV, VHC y el virus de la hepatitis B o de cualquier agente infeccioso. Los reactivos se debe considerar un posible riesgo biológico y manejarse con las mismas precauciones que se aplican a cualquier muestra de sangre. PELIGROS QUÍMICOS Evite el contacto con reactivos que contengan TMB, peróxido de hidrógeno y ácido sulfúrico. Si entra en contacto con cualquiera de estos u otros reactivos en este kit, lávese con abundante agua. TMB es un sospechoso agente cancerígeno. TOMA Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS Para la determinación se require aproximadamente 0.1 ml de suero por duplicado. Recolectar 45 ml de sangre en un tubo apropiado, etiquetar y dejar que se coagule. Centrifugar y retirar con cuidado la capa de suero. Almacenar a 4 C durante 24 horas como máximo o 10 C o inferior si el análisis se realiza en una fecha posterior. Considere todas las muestras humanas como materiales biopeligrosos y tomar las precauciones adecuadas para su manejo. PRETRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS Este es un ensayo de sistema directo. No es necesario pretramiento de la muestras. MATERIALES REQUIRIDOS PERO NO SUMINISTRADOS 1. Micropipetas Volúmenes: 25, 50, 100, 150, 300 μl (Multipette Eppendorf o dispositivos similares, < 3 % CV). 2. Vortex 3. Agitador orbital (600 rpm) (p. e. EAS 2/4, SLT) o agitador linear (200 rpm) 4. Micropipeta multicanal de 8 canales con reservorio de reactivo 5. Frasco lavador, sistema automatizado o semiautomatizado de lavado de placas de microtitración 6. Fotómetro para placas de microtitulación capaz de leer absorbancias a 450 nm (longitud de onda de referencia nm) 7. Agua bidestilada o desionizada 8. Toallas de papel, puntas para las micropipetas y cronómetro MATERIALES SUMINISTRADO 1. MTP Placa de Microtitulación revestido con conejo anticuerpos contra androstenediona. Tiras separables. Listo para usar. Contenidos: Una placa de 96 pozos (12x8) recubierto con anticuerpo polyclonal en una bolsa resellable con desecante. Almacenamiento: Refrigerar a 28 C V6.2 / May 15, / 6

4 2. ENZCONJ Conjugado androstenedionaperoxidasa de rábano (HRP) Listo para usar. Contenido: Un vial que contiene androstenedionahrp conjugado en un tampón basado en proteína con un conservante sin mercurio. Volumen: 15 ml/ botella Almacenamiento: Refrigerar a 28 C 3. CAL AF Estándar Androstenedione Listo para usar. Contenido: Seis viales que contienen la androstenediona en tampón basado en suero humano con un conservante sin mercurio. Preparado por adición de la solución buffer con una cantidad definida de androstenedione. *A continuación se mencionan concentraciones aproximadas, por favor, consulte las etiquetas de los viales para las concentraciones exactas. Estándar Concentración Volumen/ampolla Estándar A 0 ng/ml 2.0 ml Estándar B 0.1 ng/ml 1.0 ml Estándar C 0.3 ng/ml 1.0 ml Estándar D 1 ng/ml 1.0 ml Estándar E 3 ng/ml 1.0 ml Estándar F 10 ng/ml 1.0 ml Almacenamiento: Refrigerar a 28 C Estabilidad: 12 meses en viales cerrados o como se indica en la etiqueta. Una vez abierto, debe utilizarse dentro de 14 días o alicuotados e almacenados congelados. Evitar congelar y descongelar repetitivamente. 4. Controls CONTROL HIGH CONTROL LOW Listo para usar. Contenido: Dos viales que contienen la androstenediona en tampón basado en suero humano con un conservante sin mercurio. Consultar las etiquetas de los viales para conocer el rango aceptable. Volumen: 1.0 ml/vial Almacenamiento: Refrigerar a 28 C Estabilidad: 12 meses en ampollas cerradas o como se indica en la etiqueta. Una vez abierto, debe utilizarse dentro de 14 días o alicuotados e almacenados congelados. Evitar congelar y descongelar repetitivamente. 5. WASHBUF CONC Solución Buffer de Lavado, Concentrado Contenido: Dos botellas conteniendo una solución buffer proteica con un detergente nonionico y un preservante nonmercurio. Volumen: 50 ml/bottla Almacenamiento: Refrigerar a 28 C Preparación: Diluir 1:10 en agua destillada o deionizada antes de usar. Si toda la placa se va utilizar, diluir 50 ml de buffer de lavado concentrado en 450 ml de agua. 6. TMB SUBS Solución de Substrato TMB Listo para usar. Contenido: Una botella conteniendo tetrametilbenzidina y peróxido de hidrógeno en una solución buffer de nondmf que contiene DMSO. Volumen: 18 ml/ botella Almacenamiento: Refrigerar a 28 C 7. TMB STOP Solución de Parada TMB Listo para usar. Contenido: Una botella conteniendo 1M ácido sulfúrico. Volumen: 8 ml/ botella Almacenamiento: Refrigerar a 28 C V6.2 / May 15, / 6

5 PROCEDIMIENTO DE ENSAYO Todos los reactivos deben alcanzar la temperatura ambiente antes de su uso. Calibradores, controles y muestras de especímenes deben ser analizarse por duplicado. Todas las medidas deben estar completas sin interrupción al iniciarse el procedimiento. 1. Preparar las soluciones de Buffer de Lavado 2. Retirar el número necesario de tiras de la microplaca. Volver a sellar la bolsa y volver las tiras no utilizadas en el refrigerador. 3. Pipetee 25 µl de cada Calibrador, Control y muestra en los pocillos correspondienteso. 4. Pipetee 100 µl de Conjugado Enzimático en cada pocillo. (se recomienda usar pipetas multicanales) 5. Incube 60 min a TA (1825 C) sobre un agitador orbital (aprox. 600 rpm) o agitador linear (200 rpm). 6. Lave la placa 3 x con 300 µl de Solución Buffer de Lavado diluido. Remueva el exceso de solución golpeando cuidadosamente la placa invertida sobre una toalla de papel. 7. Para la adición de la Solución del Sustrato y de Paro utilice, de ser posible, una pipeta de 8 canales. La adición de sustrato y solución de paro debe llevarse a cabo en intervalos de tiempo iguales. Evite la formación de burbujas pipeteando con sobrevolumen. 8. Pipetee 150 µl de Solución de Substrato TMB en cada pocillo. 9. Incube 1015 min a TA (1825 C) sobre un agitador orbital (aprox. 600 rpm) o agitador linear (200 rpm) o hasta que el calibrador A alcance el color azul oscuro para la DO deseada. 10. Detenga la reacción del substrato añadiendo 50 μl de Solución de Paro TMB en cada pocillo. Mezcle el contenido brevemente agitando cuidadosamente la placa. 11. Mida la densidad óptica con un fotómetro a 450 nm* dentro de 20 min *) Si la DO excede el limite de detección superior o si un filtro de 450 nm no es disponible, se puede utilizar en lugar de eso un filtro de 405 o 415 nm. Las densidades ópticas estarán más bajas, pero eso no tiene efecto en los resultados de las muestras de paciente / de control. CÁLCULO DE RESULTADOS 1. Calcular la densidad óptica media de cada calibrador duplicado. 2. Plotear una curva de calibración en papel semilog con las DO medias en la ejey e las concentraciones de los calibradores en la ejex. Si un software para inmunoensayos es empleado, se recomiendar una curva de 4 o 5paramétros. 3. Calcular la densidad óptica media de cada muestra duplicada. 4. Leer las concentraciones de las muestras directamente de la curva de calibración. 5. Si alguna muestra contiene valores mayores a 10 ng/l diluya la muestra con calibrador A (dilución máxima 1:8). El resultado obtenido debe ser multiplicado por el factor de dilución. DATOS TABULADOS TÍPICOS Estándar Medio DO Valor (ng/ml) A B C D E F Desconocido CURVA DE CALIBRACIÓN TÍPICA Ejemplo. No usar para el cálculo!. V6.2 / May 15, / 6

6 CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO SENSIBILIDAD El límite de detección (LoD) se determinó a partir del análisis de 64 muestras en blanco y una muestra de bajo valor y se calculó como se explica a continuación: LoD = µb σB σS, donde σb y σs son las desviaciones estándar del blanco y de la muestra de bajo valor, y µb es el valor medio del blanco. LoD = 0.04 ng/ml de androstenedione ESPECIFICIDAD (REACTIVIDAD CRUZADA) Se ensayaron los compuestos siguientes para probar la reactividad cruzada utilizando el método de Abraham con reacción cruzada de androstenedion al 100%: Esteroide % Reactividad Cruzada Androstenedione 100 DHEA 1.8 Testosterone 0.2 Estrone <0.1 Estradiol <0.1 Progesterone <0.1 17OHProgesterone <0.1 5αDHT <0.1 Cortisol <0.01 DHEAS <0.01 PRECISIÓN INTRAENSAYO Se analizaron quarta muestras cada una 24 veces con la misma curva de calibración. Los resultados (en ng/ml) se muestran a continuación: Muestra Media DS CV% PRECISIÓN INTERENSAYO Se analizaron tres muestras diez veces en un período de cuatro semanas. Los resultados (en ng/ml) se muestran a continuación: Muestra Media DS CV% RECUPERACIÓN Se prepararon muestras enriquecidas añadiendo las cantidades definidas de androstenedione a tres muestras de suero. Los resultados (en ng/ml) se muestran a continuación: Muestra 1. Nativo Nativo Nativo Resultado observado Resultado esperado Recuperación % V6.2 / May 15, / 6

7 LINEARIDAD Tres muestras de suero se diluyeron con el calibrador A. Los resultados (en ng/l) se tabulan a continuación: Muestra 1 1:2 1:4 1:8 2 1:2 1:4 1:8 3 1:2 1:4 1:8 Resultado observado Resultado esperado Recuperación % VALORES ESPERADOS NORMALES En cuanto a todos los ensayos clínicos, cada laboratorio debe recopilar datos y establecer su propio rango de valores normales esperados. Grupo N Medio (ng/ml) Rango (ng/ml) Hombres Mujeres REFERENCIAS 1. Perel E, et al. The Conversion of Androstenedione to Estrone, Estradiol, and Testosterone in Breast Tissue. J Steroid Biochem. 1980; 13: Bermúdez JA, et al. Stereochemical Approach to Increase the Specificity of Steroid Antibodies. J Steroid Biochem. 1975; 6: Hampl R, et al. The Use of Iodinated Steroid as Radioligand for Testosterone Radioimmunoassay. J Steroid Biochem. 1978; 9: Hummer L, et al. An Easy and Reliable Radioimmunoassay of Serum Androstenedione: AgeRelated Normal Values in 252 Females Aged 2 to 70 Years. Scand J Clin Lab Invest. 1983; 43: Hennam JF, et al. A Cost Reductive Method for the Radioimmunoassay of Plasma Androstenedione. A Comparison of Antisera and the Effects of Chromatography. Acta Endocrinol. 1974; 76: Judd HL, et al. Serum Androstenedione and Testosterone Levels During the Menstrual Cycle. J Clin Endo Metabo. 1973; 36: LejeuneLenair C, et al. A Direct RadioImmunoassay for Plasma Delta 4Androstenedione. Application to Children. Clin Chem Acta. 1979; 94: Parker LN, et al. An Improved Radioimmunoassay for 4Androstene3, 17Dione. Steroids. 1977; 29: Pizarro MA, et al. Human Testicular Metabolism of Testosterone and Androstenedione in Normal and Infertile Men. J Steroid Biochem. 1980; 12: Rao PN, et al. Specific Antisera Suitable for SolidPhase Radioimmunoassay of 11Beta Hydroxyandrost4Ene3,17Dione. Steroids. 1974; 24: Putz Z, et al. A Selective Radioimmunoassay of Androstenedione in Plasma and Saliva. J Clin Chem Clin Biochem. 1982; 20: Schanbacher BD, et al. Simultaneous Determination of Testosterone, 5AlphaAndrostan17BetaOl3 One, 5AlphaAndrostane3Alpha, 17BetaDiol and 5AlphaAndrostane3Beta, 17BetaDiol in Plasma o f A dult M ale R abbits b y R adioimmunoassay(1). Endocrinology. 1975; 97: Slaats EH, et al. Interference of SexHormone Binding Globulin in the CoatACount Testosterone No Extraction Radioimmunoassay. Clin Chem. 1987; 33: Swinkles LM, et al. Salivary and Plasma Free Testosterone and Androstenedione Levels in Women Using Oral Contraceptives Containing Desogestrel or Levonorgestrel. Ann Clin Biochem. 1988; 23: Thorneycroft IH, et al. A Radioimmunoassay of Androstenedione. Steroids. 1973; 21: Check JH, et al. Falsely Elevated Steroidal Assay Levels Related to Heterophile Antibodies Against Various Animal Species. Gynecol Obstet Invest. 1995; 40(2): V6.2 / May 15, / 6

8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Cat.No.: / Kat.Nr.: / No. Cat.: / Cat.No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / ΑριθμόςΚατ.: LotNo.: / ChargenBez.: / No. Lot: / LotNo.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / InvitroDiagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για InVitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. COMPLAINTS: Complaints may be submitted initially written or vocal. Subsequently they need to be filed including the test performance and results in writing in case of analytical reasons. WARRANTY: The product is warranted to be free from material defects within the specific shelf life and to comply with product specifications delivered with the product. The product must be used according to the Intended use, all instructions given in the instructions for use and within the product specific shelf life. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. LIMITATION OF LIABILITY: IN ALL CIRCUMSTANCES THE EXTENT OF MANUFACTURER S LIABILITY IS LIMITED TO THE PURCHASE PRICE OF THE KIT(S) IN QUESTION. IN NO EVENT SHALL MANUFACTURER BE LIABLE FOR ANY INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL DAMAGES, INCLUDING DAMAGES FOR LOST PROFITS, LOST SALES, INJURY TO PERSON OR PROPERTY OR ANY OTHER INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL LOSS. IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany Tel.: + 49 (0) Fax: 11 IBL@IBLInternational.com WEB: Symbols Version 4.5 /