Influencia del riego en las células tánicas del hollejo de Vitis vinifera L. cv Tempranillo

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1 Influencia del riego en las células tánicas del hollejo de Vitis vinifera L. cv Tempranillo T. Ayuso 1, M.L. Urbano 1, E. Valdés 2, D. Uriarte 1, D. Moreno 2, E. Giraldo 2 y M.V. Alarcón 1* 1 Centro de Investigación Agraria La Orden-Valdesequera. Gobierno de Extremadura. Badajoz. *mariavictoria.alarcon@juntaextremadura.net 2 Instituto Tecnológico Agroalimentario (INTAEX). Gobierno de Extremadura. Badajoz. Resumen La localización y el estado de polimerización de los compuestos fenólicos en la piel de la uva está muy relacionado con las reacciones que se producen a lo largo de la maduración del fruto. El estudio de los cambios que ocurren en la uva a nivel celular es esencial para poder dirigir mejor el proceso de difusión de los pigmentos en la vinificación. El objetivo de este estudio es conocer la influencia del riego en la evolución y cuantificación de las células tánicas del hollejo de la uva Tempranillo durante de la maduración. El estudio se efectuó en un viñedo experimental situado en el Centro de Investigación Agraria La Orden-Valdesequera (GOBEX) durante la campaña Se estableció un ensayo con dos tratamientos: un secano (C) no regado y un riego máximo (R) aplicando el 100% de la Evapotranspiración del cultivo (ETc). Las secciones transversales de bayas recolectadas a lo largo del proceso de maduración (ocho muestreos) se fijaron en una solución de formalina, ácido acético y sulfato ferroso que proporciona una coloración oscura a los taninos. Posteriormente, las secciones se incluyeron en parafina y se obtuvieron cortes de (12 µm) que se tiñeron con floroglucinol-hcl. En los hollejos, se han diferenciado células sin compuestos fenólicos (sin coloración) y células que contienen compuestos fenólicos (células tánicas), las cuales se han clasificado en: (a) células con coloración uniforme, (b) con gránulos finos homogéneamente distribuidos, (c) con pequeñas inclusiones esféricas unidas al tonoplasto o libres en la vacuola y (d) con grandes inclusiones, estudiándose el efecto de la maduración y del riego en la evolución del número (%) de las distintas células. A medida que avanza la maduración se ha observado, en ambos tratamientos, una disminución en el número de células del tipo b y un aumento de las del tipo d. Respecto a la incidencia del riego, en vendimia (115 dpf) se observó un porcentaje significativamente menor tanto del número de células sin coloración como de células con grandes inclusiones (d) y un porcentaje mayor de células con coloración uniforme (a), lo que indica que el riego influye en la cantidad y distribución de las células del hollejo. Palabras clave: hollejo, histoquímica, polifenoles. Influence of irrigation on tannic cells from the skin of Vitis vinifera L. cv Tempranillo during maturation Abstract The localisation and shape of phenolic compounds in grape skin are influenced by reactions during grape maturation. The study of changes that occur in grape cells is essential to understand the pigment diffusion process in winemaking. The target of this study was to determine the influence of irrigation on the evolution of tannic cells in grape skins 'Tempranillo' during ripening. The study was carried out in an experimental vineyard located in the Research Centre La Orden-Valdesequera during campaign Treatments consisted of: non-irrigated vines (C) and a full irrigation treatment to cover 100% of crop water needs throughout the campaign (R). Cross-sections of berries collected at several stages of grape ripening were fixed in a solution of formalin, acetic acid and ferrous sulfate which provides a dark coloring to tannins. Samples were included on paraffin and sections of 12 µm were obtained. Then, sections were stained with phloroglucinol-hcl. In the grape skins, it has been distinguished two main kinds of cells: cells without phenolic compounds (without colour) and cells containing phenolic compounds (tannic cells). According to the polymerization degree of these tannic compounds cells have been classified into: (a) with uniform coloring; (b) cells with fine granules evenly distributed; (c) with small spherical inclusions united to the tonoplast or free in the vacuole, and (d) with large inclusions. We studied the effect of maturation and irrigation in the percentage of the different cells of the skin. During maturation it has been observed a decrease in the number of cells of the type b and an increase in the type d, in both treatments. Regarding the treatments, it was noted that at vintage (115 dpf), the irrigation produced a percentage significantly smaller of both cell types without coloration and with large inclusions, and a higher percentage of cells with uniform coloration. This indicates that irrigation influences the amount and distribution of the cells of the skin. Keywords: grape skin, histochemical, phenolic compounds.

2 Introducción y/o Justificación Existen numerosos factores que influyen sobre la productividad de un viñedo y la composición de la uva que son determinantes para obtener uvas y vinos de buena calidad. Las relaciones hídricas y las relaciones fuente-sumidero de las cepas juegan un papel fundamental. El riego del cultivo, no sólo actúa como regulador de la calidad del fruto y como consecuencia del vino, sino también como factor principal que limita la productividad (Williams y Mathews, 1990; Jackson y Lombard, 1993). Durante la maduración de las uvas, los factores ambientales y las reacciones enzimáticas promueven cambios que afectan a la composición y a la estructura de los azúcares y fenoles. La disponibilidad de agua altera la composición química del fruto activando rutas metabólicas especificas (Castellarín et al., 2007), y controlando el tamaño de la baya (Roby et al., 2004). La influencia del riego ha sido estudiada en el crecimiento y morfología del fruto, sobre su efecto en la evolución de los metabolitos y en la fisiología de la planta (Ribereau-Gayon y Stonestreet, 1975; Hardie y Considine, 1976; Mathews et al., 1987; Coombe, 1995; Considine y Knox, 1979; Ollat et al., 2002; Ojeda et al., 2002; Valdés et al., 2009; Sofo et al., 2012). Sin embargo, no se ha estudiado en profundidad el efecto del riego en la distribución celular de los compuestos fenólicos del hollejo. Los estudios histológicos permiten determinar la localización celular y cuantificación de estos compuestos en el hollejo, así como la evolución celular durante la maduración. El análisis de imagen como herramienta para la cuantificación de compuestos fenólicos en la baya se ha utilizado con éxito en diversos estudios (Amrani Joutei et al., 1994; Chevalier et al., 2003; Soukupová y Albrechtová, 2003; Cadot et al., 2011). La piel de la uva está constituida por tres capas superpuestas: la cutícula externa, es una fina y continua capa cubierta de ceras epicuticulares (Considine y Knox, 1979; Casado y Heredia, 2001); la epidermis formada por uno o dos estratos celulares y la hipodermis, la más cercana a la pulpa, y que se compone de varias capas de células cuyo número varía según el cultivar (Hardie y O brien, 1996; Lúquez y Fomento, 2002; Santesteban et al., 2011; Sofo et al., 2012) y que contienen la mayoría de los fenoles en la piel de la uva (Lecas y Brillouet, 1994; Chevalier et al., 2003). En el hollejo, estos compuestos pueden encontrarse como fenoles de la pared celular unidos a polisacáridos y como fenoles no situados en la pared celular, bien confinados en las vacuolas de las células vegetales y/o asociados al núcleo celular (Pinelo et al., 2006). Se han realizado pocos estudios sobre la localización de los compuestos fenólicos en el hollejo. Amrani Joutei et al. (1994) determinaron compuestos fenólicos libres en la solución vacuolar en forma de gránulos, unidos a proteínas de la cara interna del tonoplasto y unidos a polisacáridos de la pared celular. Recientemente, en los hollejos de Cabernet Franc (Cadot et al., 2011) y Tempranillo (Ayuso et al., 2012), se han caracterizado cinco tipos de células según la distribución, forma y tamaño de las granulaciones de los compuestos fenólicos: células sin ningún tipo de precipitados o granulaciones en la vacuola; células con densas granulaciones uniformes en la vacuola (tipo a); células con finas granulaciones distribuidas uniformemente en la vacuola (tipo b), células con pequeñas inclusiones esféricas (tipo c) y células con inclusiones grandes y redondeadas ocupando gran parte de la vacuola (tipo d). El objetivo de este estudio es conocer la influencia del riego en los tipos de células que forman el hollejo de Tempranillo, en su distribución y cuantificación, así como en su evolución durante la maduración del fruto. Material y Métodos El material vegetal Tempranillo procede de una parcela experimental situada en el Centro de Investigación Agraria La Orden-Valdesequera (Badajoz. Gobierno de Extremadura), plantada en 2001 sobre patrón R-110 y con un marco de plantación 2,5x1,2 m. El estudio se realizó en la campaña 2011 y el diseño experimental constó de dos tratamientos: un secano (C) no regado y un riego máximo (R) aplicando el 100% de la Evapotranspiración del cultivo (ETc), determinada mediante un lisímetro de pesada situado en la misma parcela experimental (Picón et al., 2012). Este tratamiento se mantuvo

3 durante toda la campaña con valores de potencial hídrico de tallo en torno a 0.5MPa (valor de inicio del riego), lo que garantizó ausencia de estrés para este tratamiento y por tanto, desarrollo sin limitaciones hídricas (Williams 2001). A lo largo del ciclo de maduración se muestrearon bayas de racimos con orientación Sur. En el laboratorio se seleccionaron bayas de tamaño medio por tratamiento. Los frutos se cortaron transversalmente con una cuchilla en tres secciones dejando las semillas en la zona central, de la cual se separaron secciones triangulares de aproximadamente 20 mm 2. Estas piezas se fijaron en una solución de fomalina, ácido acético y sulfato de hierro que proporciona una coloración azul oscura o verdosa a los taninos (Johansen, 1940; Reeve, 1958; Amrain-Joutei et al., 1994; Fontes et al., 2011). La penetración del fijador se facilitó por infiltración en vacío (1h, 4ºC) y, tras incluir las muestras en parafina /TBA, se obtuvieron secciones transversales (12 m) con un microtomo de rotación (Leica). Para la caracterización y cuantificación (%) de los tipos celulares del hollejo, se procedió a una tinción adicional con floroglucinol-hcl (Sigma). Las medidas (3 secciones en 5 frutos) se realizaron por observación directa de microfotografías obtenidas con un microscopio con cámara digital (E-50i, D.S. Nikon) mediante un software de análisis de imagen (NIS-Elements, Nikon). Los datos se analizaron con el programa SPSS v La comparación entre los diferentes tipos celulares se realizó mediante una ANOVA y Test HDS de Tukey (p<0,05). La comparación entre los tratamientos para una misma fecha se realizó mediante t de Student para muestras independientes (p<0.05). Resultados y Discusión Los datos climáticos relativos a 2011 muestran una campaña muy lluviosa y temperaturas primaverales elevadas que fueron suavizándose en el periodo post-envero. Durante el periodo vegetativo (Marzo-Septiembre) la precipitación registrada fue de más de 200 mm, lo que retrasó el inicio de los riegos cuando las uvas presentaban un estado fenológico de tamaño guisante. Esto supuso una campaña de riego más corta (112 días) con un total de 485 mm de agua de riego (Tabla 1). Tabla 1. Datos climáticos de la campaña 2011 Marzo - Septiembre 2011 Temperatura (ºC) Humedad Relativa (%) Radiación (W/m 2 ) Máx. Mín. Med. Máx. Mín. Med. Precipitación (mm) Eto (mm) 27,35 13,08 20,22 86,46 34,16 154,53 216, ,62 Las bayas se muestrearon a distintos días post-floración (dpf), efectuándose el primer muestreo el día 18 dpf, hasta sobremaduración (121 dpf). La vendimia se efectúo cuando las bayas alcanzaron los 24ºBrix, conforme al criterio seguido habitualmente en la zona, y tuvo lugar a los 115 dpf para ambos tratamientos. El estudio de secciones transversales del hollejo de Tempranillo (Figura 1) muestra que está formado por una capa de células epidérmicas pequeñas, parenquimáticas e isiodiamétricas, recubierta externamente por una fina cutícula. Estas células muestran su cara tangencial externa más gruesa y contienen vacuolas con precipitados fenólicos. La hipodermis está constituida por 8-10 estratos de células colenquimáticas, aplanadas y alargadas longitudinalmente. Las más próximas a la epidermis son más alargadas que las que se sitúan internamente, cerca del mesocarpo externo, que son más redondeadas. Las células que forman el hollejo contienen vacuolas con o sin granulaciones densas (Cadot et al., 2011; Ayuso et al 2012), observándose células sin estos compuestos entre células que si los contienen. Durante la maduración se producen pequeños cambios en el tamaño y forma de las

4 células del hollejo: las células epidérmicas se expanden radial y tangencialmente, mientras que las células hipodérmicas sólo se expanden radialmente (Figura 1). Las células que forman el hollejo se distribuyen en: las células con grandes inclusiones esféricas (tipo d), que, al microscopio, aparecen como gotitas refractivas, se localizan en la epidermis y en las dos o tres primeras capas de hipodermis. En las restantes capas interiores hipodérmicas se distribuyen las demás clases de células, de forma que en una misma capa pueden encontrarse células que contienen compuestos fenólicos (masas densas amorfas (tipo a), precipitados granulares finos (tipo b) y gránulos esféricos de mayor tamaño (tipo c) fuertemente enlazados al tonoplasto formando un depósito continuo o en forma de unidades granulares separadas) y células sin fenoles (Figura 1). C1 C2 C3 C4 R1 Figura 1. Microfotografías de secciones de hollejo en cuatro momentos del desarrollo y maduración de la uva del tratamiento C (no regado) y del tratamiento R (100% regado): C1:45; C2:87, C3:94 y C4:115 dpf; R1:45; R2:87, R3:94 y R4:115 dpf. (Barra: 100 m). En relación a la evolución y cuantificación (%) de los distintos tipos de células durante la maduración (Tabla 2) se observa que las células sin compuestos fenólicos, mayoritarias en ambos tratamientos (22-36%), disminuyen de forma significativa durante la maduración y en vendimia, el riego produce un menor porcentaje de estas células. Respecto a las células tánicas, las células con coloración uniforme (a) son las más abundantes (21-33%) y no varían significativamente durante la maduración, pero en vendimia el riego aumenta el porcentaje de estas células frente al secano (Figura 1, C4 vs R4). Las células con gránulos finos (b) (entre 5-13%) no muestran diferencias significativas entre tratamientos aunque el riego produce una disminución significativa entre los dpf (Figura 1, C1 y R1). Las células con inclusiones esféricas pequeñas (c) (15-32%), aumentan significativamente durante los dos primeros muestreos siendo menos abundantes significativamente en el tratamiento regado (R). Y por último, las células que contienen grandes inclusiones (3-18%), muestran una tendencia general a aumentar durante la maduración. En ambos tratamientos se observa que entre los 18 y 65 dpf el porcentaje de estas células es muy bajo para después incrementar significativamente. En vendimia, el riego produce menos células de este tipo que el secano. Conclusiones R2 Los resultados de este estudio indican que durante la maduración del hollejo de Tempranillo se ha observado una disminución en el número de células del tipo b y un aumento de las del tipo d, independientemente del tratamiento aplicado. En vendimia el riego produjo hollejos con menos células con grandes inclusiones y células sin coloración, pero aumentaron las células con coloración uniforme. Obtener hollejos con menos células de tipo d, localizadas en la epidermis y primeras capas de hipodermis, podría suponer que estas pieles aportarían a los vinos menos fenoles durante el proceso de R3 R4

5 vinificación, que podría influir en su calidad. Esta aproximación debería reforzarse combinando los análisis histoquímicos y bioquímicos. Tabla 2. Tipología de las células del hollejo (en %) por tratamiento (secano (C) y riego (R)) en los diferentes muestreos durante el desarrollo y maduración. Los valores representan la media de 100 células medidas en 15 secciones (n=5 frutos). Tipos de células (%) Tratamiento Fecha muestreo Días postfloración (dpf) Ausencia de coloración Coloración Uniforme (Tipo a) Gránulos Finos (Tipo b) Inclusiones esféricas pequeñas (Tipo c) Inclusiones grandes (Tipo d) C (no regado) R (100% regado) Agradecimientos Esta investigación ha sido financiada por la ayuda TEC09040, el proyecto IB10049 y la ayuda a grupos de investigación GR10130 del Gobierno de Extremadura y por el Fondo Social Europeo. Bibliografía 26-may 18 36,71 b 27,33 ab 12,06 b 19,54 a* 4,53 a 22-jun 45 32,37 ab 31,43 b 8,89 ab 24,21 ab* 2,98 a 12-jul 65 25,01 a* 32,79 b 8,06 ab 29,23 b 4,07 a 3-ago 87 30,64 ab 25,41 ab 8,89 ab 25,66 ab 10,21 b 10-ago 94 25,27 a 28,27 ab 5,64 a 32,29 b 11,73 b 18-ago ,20 a 26,64 ab 6,18 a 24,57 ab 16,40 c 31-ago ,53 ab* 21,49 a* 6,15 a 24,06 ab 19,88 c* 6-sep ,71 a 25,42 ab 6,07 a 26,56 ab 18,25 c 26-may 18 35,56 c 30,01 ab 13,86 b 15,94 a* 4,61 a 22-jun 45 34,61 bc 36,64 b 8,63 a 16,52 a* 3,58 a 12-jul 65 30,84 abc* 30,21 ab 6,84 a 29,36 bc 2,75 a 3-ago 87 25,28 abc 30,82 ab 8,29 a 27,29 bc 8,31 b 10-ago 94 25,04 ab 28,27 ab 5,64 a 32,29 c 8,73 b 18-ago ,08 abc 23,64 a 5,82 a 22,17 ab 16,27 c 31-ago ,16 a* 33,08 ab* 4,38 a 24,61 abc 15,75 c* 6-sep ,16 a 24,66 a 6,97 a 27,92 bc 16,25 c ANOVA. Test HDS de Tukey p<0,05. Por tratamiento, letras diferentes indican diferencias significativas. ( Vendimia). (* Diferencias significativas entre tratamientos en el mismo momento de muestreo, t de Student p<0,05). Amrani Joutei, K., Glories, Y., and Mercier, M. (1994). Localisation des tanins dans la pellicule de baie de raisin. Vitis 33, Ayuso, T., Moreno-Alías, I., Valdés, M. E., Uriarte, D., Moreno, D., Giraldo, E., Prieto, M. H., and Alarcón, M. V. (2012). Estudio histológico de la distribución de los compuestos fenólicos en la piel de Vitis vinifera cv Tempranillo. In "XIII Congreso Nacional de Ciencias Hortícolas", Almería (España). Cadot, Y., Chevalier, M., and Barbeau, G. (2011). Evolution of the localisation and composition of phenolics in grape skin between veraison andmaturity in relation to water availability and some climatic conditions. Journal of the Science of Food and Agriculture 54, Casado, C. G., and Heredia, A. (2001). Ultrastructure of the cuticle during growth of the grape berry (Vitis Vinifera). Physiologia Plantarum 111, Castellarín, S. D., Matthews, M. A., Gaspero, G., and Gambetta, G. A. (2007). Water deficits accelerate ripening and induce changes in gene expression regulating flavonoid biosynthesis in grape berries Planta 227,

6 Considine, J. A., and Knox, R. B. (1979). Development and Histochemistry of the Cells, Cell Walls, and Cuticle of the Dermal System of Fruit of the Grape, Vitis vinifera L. Protoplasma 99, Coombe, B. G. (1995). Adoption of a system for identifying grapevine growth stages. Australian journal of Grape and Wine Research 1, Chevalier, M., Perrochon, E., Clement, A., Dubot, A., Tellier, M., Cadot, Y., and Barbeau, G. (2003). Use of image analysis for the study of phenolic compounds of the grape berry skin (vitis vinifera l., cv cabernet franc) Journal International des Science de la Vigne et du Vin 37, Fontes, N., Gerós, H., and Delrot, S. (2011). Grape berry vacuole: acomplex and heterogeneous membrane system specialized in the accumulation of solutes. American Journal of Enology and Viticulture 62, 270. Hardie, W. J., and Considine, J. A. (1976). Response of grapes to water deficit stress in particular stages of development. American Journal of Enology and Viticulture 27, Hardie, W. J., and O brien, T. P. (1996). Morphology, anatomy and development of the pericarp after anthesis in grape, Vitis vinifera L. Australian Journal of Grape and Wine Research 2, Jackson, D. I., and Lombard, P. B. (1993). Enviromental and mangement practices affecting grape composition and wine quality. American Journal of Enology and Viticulture 44, Johansen, D. A. (1940). "Plant microtechnique," New York. Lecas, M., and Brillouet, J. M. (1994). Cell wall composition of grape berry skins. Phytochemistry 35, Lúquez, C. V., and Formento, J. C. (2002). Flor y fruto de vid (Vitis vinifera L.) Micrografía aplicada a Viticultura y Enología. Rev. FCA UNCuyo. Tomo XXXIV. N 1. (Revista de la Facultad de Ciencias Agrarias), Matthews, M. A., Anderson, M. M., and Schultz, H. R. (1987). Phenologic and growth responses to early and late season water deficits in Cabernet franc. Vitis 26, Ojeda, H., Andary, C., Kraeva, E., Carbonneau, A. and Deloire, A. (2002). Influence of Pre- and Postveraison Water Deficit on Synthesis and Concentration of Skin Phenolic Compounds during Berry Growth of Vitis vinifera cv. Shiraz. American Journal of Enology and Viticulture 53, Ollat, N., Verdin, D. P., Carde, J. P., Barrieu, F., Gaudillere, J. P., and Moing, A. (2002). Revue Bibliographique: Developpement de la Baie de Raisin Journal International des Science de la Vigne et du Vin 36, Picón, J., González, V., Uriarte, D., Mancha, L. A., and Testi, L. (2012). Effect of canopy size and water stress over the crop coefficient of a 'Tempranillo' vineyard in south-western Spain. Irrigation Science. Pinelo, M., Arnous, A., and Meyer, A. S. (2006). Upgrading of grape skins: Significance of plant cell-wall structural components and extraction techniques for phenol release. Trends in Food Science & Technology 17, Reeve, R. M. (1958). Histological and histochemical changes in developing a ripening peaches. I. the catechol tannins. American Journal Of Botany 46, Ribéreau-Gayon, J., and Stonestreet, E. (1975). Le dosage des anthocyanes dans le vins rouge. Bulletin de la Société Chimique de France 9, Roby, G., Harbertson, J. F., Adams, D. A., and Matthews, M. A. (2004). Berry size and wine water deficits as factors in winegrape compositions: anthocianins and tannins. Australian Journal of Grape and Wine Research 10, Santesteban, L. G., Miranda, C., and Royo, B. (2011). Thinning intensity and water regime affect the impact cluster thinning has on grape quality. Vitis 4, Sofo, A., Nuzzo, V., Tataranni, G., Manfra, M., Nisco, M., and Scopa, A. (2012). Berry morphology and composition in irrigated and non-irrigated grapevine. Journal of Plant Physiology 169, Soukupová, J., and Albrechtová, J. (2003). Image analysis tool for quantification of histochemical detections of phenolic compounds, lignin and peroxidases in needles of norway spruce. Biología Plantarum 46, Valdés, E., Moreno, D., Gamero, E., Uriarte, D., Prieto, M. H., Manzano, R., Picón, J., and Intrigliolo, D. S. (2009). Effects of cluster thinning and irrigation amount on water realations, growth, yield and fruit and wine composition of tempranillo grapes in Extremadura (Spain). Journal International des Science de la Vigne et du Vin 43, Williams, L. E. (2001). Irrigations of winegrapes in California. Practical Winery Nov-Dec, Williams, L. E., and Matthews, M. A. (1990). Grapevine. In "Irrigation of agricultural crops" (S. a. Nielsen, ed.), Vol. 30, pp