04/11/2009. Servei de Proteòmica SCT-UB-IDIBAPS

Transcripción

1 Análisis Proteómico del ciclo celular Josep M Estanyol Servei de Proteòmica SCT-UB-IDIBAPS RTICC-2009 Proyecto de investigación: Estudio de nuevas funciones de las proteínas inhibidoras de ciclo celular p21 cip1, p16 ink4a y p27 kip1. La proteómica como herramienta metodológica 1

2 Unión a otras proteínas. cica cdc2 Localización Fosforilaciones y acetilaciones activadoras cicb e inhibidoras CKI cdc2 cdk Síntesis / Degradación G2 M S G1 cdk2 cdk 4/6 cicd cica cdk2 cice ciclina cdk CKI CKI cdk CIP/KIP INK4 p21 CIP1 p16 INK4a p27 KIP1 p15 INK4b p57 KIP2 p18 INK4c p19 INK4d 2

3 varias funciones Proteína X relacionadas diferentes opuestas diferentes compartimentos altres funcions independents cdks Proteína Funciones conocidas Funciones desconocidas? X Proteína X Proteínas de unión con funciones conocidas Nueva función proteína X 3

4 Lisado celular (PC) Cromatografía de afinidad CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD Sepharose 4B PROTEÏNA Espectrometría ESPECTROMETRIA DE de MASSES (Maldi-TOF) masas 1-D gel 2-D gel Tripsina PC FT R E Electroforesis E Base de dades Estudios funcionales Identificación de la proteína Escoger proteína/s de interacciónn: estudios funcionales: Validar por WB su presencia en los eluidos de la columna de cromatografía. Demostrar la interacción in vivo. Inmunoprecipitación. Inmunofluorescencia. Plantear estudios de tipo funcional. 4

5 Identificación de nuevas proteínas de unión a p21 CIP1. Identificación de proteínas de unión a p21cip1. Lisado Molt4 CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD Sepharose 4B GST-p21 SET GST-p21 GST Std Pre FT E E R Pre FT GAPDH 31 Estanyol JM et al; J Biol Chem (1999). Carrascal M, Carujo S, et al; Proteomics (2002). 5

6 SET y la oncogénesis: (1992) Proteína de fusión SET-CAN (leucemia aguda mieloide indiferenciada). Se asocia a las proteínas de fusión leucémicas HRX (leucemia aguda humana). Sobre-expresada expresada en tumor de Wilm y hepatomas. Funciones de SET: SET es un inhibidor de la fosfatasa PP2A (1996) 6

7 Funciones de GAPDH: Enzima glucolítico NAD + NADH + H + Gliceraldehido-3-P 1-3 bisfosfoglicerato HPO 4 2- Otras funciones: -reparación DNA -apoptosis -transcripción -transporte mrna Validar por WB su presencia de SET y GAPDH en los eluidos de la columna de cromatografía. GST-p21 E SET PCNA GST-p21 PC FT E GAPDH GST PC FT E Demostrar la interacción in vivo. Carujo S, et al; Oncogene (2006). Estanyol JM, et al; J Biol Chem (1999). Carujo S, et al; Oncogene (2006). 7

8 Demostrar la interacción in vivo. Inmunoprecipitación. Estanyol JM, et al; J Biol Chem (1999). Carujo S, et al; Oncogene (2006). Demostrar la interacción in vivo. Inmunofluorescencia. Carujo S, et al; Oncogene (2006). Canela N, et al; J Biol Chem (2003). 8

9 Estanyol JM, et al; J Biol Chem (1999). Canela N, et al; J Biol Chem (2003). Plantejar estudis de tipus funcional. SET y GADPDH son proteínas reguladoras del ciclo celular. SET GAPDH cica cdc2 cicb cdc2 p21 G2 M S G1 cdk2 cdk 4/6 cicd cica cdk2 cice 9

10 ciclina cdk SET ciclina cdk CKI CKI cdk Otras CIP/KIP INK4 SET p21 CIP1 p16 INK4a p27 KIP1 p15 INK4b p57 KIP2 p18 INK4c p19 INK4d Identificación de nuevas proteínas de unión a SET. 10

11 Lisado de hígado de ratón adulto CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD Sepharose 4B GST-SET pi kda

12 Validar por WB la presencia de proteínas de los eluidos de la columna de cromatografía. Vera J, et al; Proteomics (2007). Lisado de hígado de ratón adulto CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD Sepharose 4B GST-SET st. Eluates mm KCl PC FT W Eluates mm KCl PC FT W st /5 6/ /11/ /15/ SET col. Control col. 12

13 Validar por WB la presencia de proteínas de los eluidos de la columna de cromatografía. 13

14 36 SET-BP. 20 son de alta afinidad (300 mm). 2 ya habían sido descritas como SET-BP (pp32 y B56 de la PP2A). 34 nuevas SET-BP. Signal Transduction (6) RNA Metabolism/ Transcription Others 16,7 11,1 Transport 2,8 Cell Cycle 2,8 11,1 5,6 11,1 Sugar Metabolism 5,6 33,3 Vesicular Trafficking DNA Metabolism Protein Metabolism 14

15 Estudio funcional de la interacción de SET con hnrnpa2. 15

16 hnrnpa2/b1 se encuentra sobre-expresada en diferentes tipos de cáncer: HnRNP A1 Lung IH/WB/mRNA HnRNP A1 Colon mrna HnRNP Breast IH A2/B1 HnRNP Pancreatic mrna A2/B1 HnRNP Stomach WB A2/B1 HnRNP Thyroid IH A2/B2 HnRNP B1 Lung IH HnRNP B1 Esophagus IH/WB HnRNP B1 Leukemia and IH/WB lymphoma HnRNP B1 Oral IH/WB HnRNP Lung IH/WB/mRNA C1/C2 HnRNP E1 Cervical IH HnRNP F Liver and Stomach IH HnRNP H Head and neck IH HnRNP H/H liver, pancreas and IH stomach HnRNP I Brain WB HnRNP K Lung IH/WB/mRNA Liver IH/WB/mRNA HnRNP M4 Lung IH hnrnpa2 es una proteína que interacciona con SET. WB A2 PC FT W E IP SN α-a2 NRS IP SN α-a2 NRS Columna SET PC FT W E WB SET WB A2 WB SET WB A2 WB A2 Células hepáticas. Células COS. Columna Control hnrnpa2 y SET interaccionan in vivo. A2 SET merge 16

17 ) 04/11/2009 La sobre-expressión de hnrnpa2 incrementa la proliferación celular. aca(x10 4 ) Nº de clos/pla Células COS-7 pmt2-a2fl pmt2 0h 12h 24h 36h 48h Clos transfectadas pmt2-a2 pmt2 WB HA Células HCT 116 Nº de clos/placa(x10 4 ) pmt2-a2fl pmt2 0h 12h 24h 36h 48h WB HA pmt2-a2 pmt2 Clos transfectadas hnrnpa2 inhibe la actividad de la fosfatasa PP2A in vitro. Histona H1 CDK2/ciclina A ATP-γP 32 Histona H1-P PP2A 1 2 Histona H1-P Defosforilació Histona H1-P. H1-P PP2A SET (μm) A2 (μm) H1-P H1-P PP2A A2 (nm) ssdna - - 1μg BSA(nM ) H1-P 17

18 Modelo de sobre-expresión de hnrnpa2: Condiciones normals PP2A cicb cdc2 Niveles de proliferación normal, ciclo celular regulado. Sobrexpresión de hnrnpa2 PP2A hnrnp A2 cicb cdc2 Niveles de proliferación anormales, ciclo celular desregulado. Identificación de nuevas proteínas de unión a p16 ink4a. 18

19 Molt NP29 31 CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD Sepharose 4B GST PC FT W E W E p16 col C col Molt4 31 Mouse liver nuclei PC FT W E W E 14 p16 col C col PC FT W E W E p16 col C col Las proteínas que interaccionan con p16 dependen del tipus celular. 31 nuevas proteínas que interaccionan con p16 PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) MCM6 19

20 Demostrar la interacción in vivo. Inmunoprecipitación. NP18 PCNA P16 merge detail DAPI control HeLa PCNA P16 merge detail DAPI DAPI control p16 inhibe la activitat DNA polimerasa δ dependiente de PCNA. 20

21 Identificación de nuevas proteínas de unión a p27 kip1. P27 tiene funciones oncogénicas en el citoplasma disminución de los niveles de p27 en tumores. localitzación citoplasmática de p27 en tumores. mal pronóstico 21

22 Hígado de ratón CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD Sepharose 4B GST-27 hnrnp R hnrnp K hnrnp H Lupus LA ribonucloprotein CARG binding factor A (CBF-A) hnrnp A2/B1 hnrnp A1 Histona H2B Small Nuclear Ribonucleoprotein SMD C GST-p27 PCAF SET 22

23 Degradation of cyclin A is regulated by acetylation 23

24 24

25 25

26 The transcriptional co-activator PCAF regulates cdk2 activity. Mateo F, Vidal-Laliena M, Canela N, Zecchin A, Martínez-Balbás M, Agell N, Giacca M, Pujol MJ, Bachs O. Nucleic Acids Res Sep 22. Degradation of cyclin A is regulated by acetylation. Mateo F, Vidal-Laliena M, Canela N, Busino L, Martinez-Balbas MA, Pagano M, Agell N, Bachs O.Oncogene Jul 23;28(29): Proteomic analysis of p16ink4a-binding proteins. Souza-Rodrígues E, Estanyol JM, Friedrich-Heineken E, Olmedo E, Vera J, Canela N, Brun S, Agell N, Hübscher U, Bachs O, Jaumot M. Proteomics Nov;7(22): Proteomic analysis of SET-binding proteins. Vera J, Estanyol JM, Canela N, Llorens F, Agell N, Itarte E, Bachs O, Jaumot M.Proteomics Feb;7(4): Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is a SET-binding protein and regulates cyclin B-cdk1 activity. Carujo S, Estanyol JM, Ejarque A, Agell N, Bachs O, Pujol MJ. Oncogene Jul 6;25(29): Epub 2006 Feb 13. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2 is a SET-binding protein and a PP2A inhibitor. Vera J, Jaumot M, Estanyol JM, Brun S, Agell N, Bachs O. Oncogene Jan 12;25(2): The SET protein regulates G2/M transition by modulating cyclin B-cyclin-dependent kinase 1 activity. Canela N, Rodriguez-Vilarrupla A, Estanyol JM, Diaz C, Pujol MJ, Agell N, Bachs O.J Biol Chem Jan 10;278(2): Epub 2002 Oct 28. Identification of p21cip1 binding proteins by gel electrophoresis and capillary liquid chromatography microelectrospray tandem mass spectrometry. Carrascal M, Carujo S, Bachs O, Abian J. Proteomics Apr;2(4): Differential association of p21cip1 and p27kip1 with cyclin E-CDK2 during rat liver regeneration. Pujol MJ, Jaime M, Serratosa J, Jaumot M, Agell N, Bachs O. J Hepatol Aug;33(2): The protein SET regulates the inhibitory effect of p21(cip1) on cyclin E-cyclin-dependent kinase 2 activity. Estanyol JM, Jaumot M, Casanovas O, Rodriguez-Vilarrupla A, Agell N, Bachs O. J Biol Chem Nov 12;274(46): Activation of cdk4 and cdk2 during rat liver regeneration is associated with intranuclear rearrangements of cyclin-cdk complexes. Jaumot M, Estanyol JM, Serratosa J, Agell N, Bachs O. Hepatology Feb;29(2): The cell cycle inhibitor p21cip is phosphorylated by cyclin A-CDK2 complexes. Jaumot M, Estañol JM, Casanovas O, Graña X, Agell N, Bachs O. Biochem Biophys Res Commun Dec 18;241(2): Putative nuclear cdk2 substrates in normal and transformed cells. Jaumot M, Agell N, Bachs O. Biochem Biophys Res Commun Feb 15;219(2): Grupo de ciclo celular y càncer Proliferación y señalización celular IDIBAPS-UB Oriol Bachs M. Jesus Pujol Montse Jaumot Servei de Proteòmica. Plataforma Mixta de Proteòmica IDIBAPS-SCT_PCB Josep M Estanyol M José Fidalgo Eva Olmedo Francisco Fernández Francesca Mateo Ignasi Salaet Míriam Vidal María Pérez Ana Domínguez Jorge Vera Sonia Carujo Elielson Sousa Núria Canela Marta Aguasca Servei de M. Confocal. Serveis Científico-tècnics Campus Casanova, UB Maria Calvo Anna Lladó Anna Bosch 26