Utilización de modelos celulares in vitro para la optimización de sistema de liberación controlada de antitumorales
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- Roberto Campos Maldonado
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1 Utilización de modelos celulares in vitro para la optimización de sistema de liberación controlada de antitumorales María Jesús Garrido Dpto. Farmacia y Tecnología Farmacéutica Universidad de Navarra
2 Por qué sistemas in vitro? Permiten explorar y cuantificar procesos propiamente celulares además, de procesos o mecanismos debidos a la acción del agente que se ensaye. Es posible medir la evolución temporal de una respuesta concreta. Posibilidad de evaluar combinaciones farmacológicas. Principal Limitación Se ignoran procesos de regulación o feed-back debidos a la propia fisiología o fisiopatología del individuo.
3 Principales Mecanismos: -Mecanismos Citostáticos -Mecanismos Citotóxicos Antitumorales Mecanismo de Acción Fármaco Células x Viabilidad celular basal > concentración fármaco > muerte celular Tiempo (h) > concentración fármaco >Inhibición crecimiento celular Citostático Citotóxico Tiempo de exposición al fármaco antitumoral
4 Ejemplo de ambos mecanismos Nº Células* Camptothecina C 1nM 1nM 4nM 5nM 1nM Nº Células* Topotecan C 1nM 5nM 1nM 15nM 2nM Tiempo (h) Tiempo (h) 1 Cisplatino C NºCélulas* mM 1mM 25mM 5mM 1mM 2mM Tiempo (h)
5 Cl CISPLATINO (CDDP) Cl Pt NH 3 NH 3 Cisplatino Agente alquilante uniones de tipo covalente ADN Capacidad antitumoral en gran variedad de tumores sólidos (testículo, ovario, vejiga, pulmón ) Eficacia limitada en cáncer de colon Alta toxicidad y fenómenos de resistencia Antecedentes: Administraciones continuas de niveles subterapéuticos causaban una activación mayor de apoptosis que una administración de dosis elevada. Nanopartículas de paclitaxel eran capaces de superar los fenómenos resistencia.
6 Objetivos Desarrollar formulaciones de liberación controlada para disminuir la toxicidad y/o aumentar la eficacia del cisplatino. La caracterización in vitro del efecto antiproliferativo de las distintas formas de liberación controlada de cisplatino. Combinando sistemas de cultivos celulares y técnicas de modelización matemática
7 Caracterización de los perfiles de liberación de cisplatino desde las distintas formulaciones Cumulative Fractional Release (F t) NP-A.4 NP-B MP Time (days)
8 Ecuación - Fase de difusión: A y k 1 - Fase de entrada de agua a la matriz: T 5 - Fase de degradación de la matriz: B y k 2 Mt ( k ) = A e 1 t + M + B 1 T ( 2( 5) ) 1 e k t where, A is the fraction of drug released during the phase I, k 1 is the release rate constant during this phase; B is the fraction of total drug released during the phase III, k 2 is the release rate constant during this phase and T 5 is the time taken to release 5% of entrapped drug
9 Descripción de los perfiles de liberación de cisplatino MP.7.1 NP-A Ft (Mt/M ).7.1 NP-B Time (days)
10 Aplicación de las diferentes formas farmacéuticas # $% &$% $ ' $()! )µ! "
11 Descripción del efecto antiproliferativo % & % ' # ) ) *+,-
12 Cisplatino Cl CISPLATINO (CDDP) Cl Pt NH 3 Agente alquilante uniones de tipo covalente ADN Mecanismo de acción ADUCTOS CDDP-ADN INHIBICIÓN PROCESOS TRANSDUCCIÓN Y REPLICACIÓN NH 3 PARO DEL CICLO CELULAR (Sistemas Control Celular: CHECKPOINT) ACUMULACIÓN CÉLULAS FASE G2/M ACTIVACIÓN CASCADA TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES APOPTÓTICAS PROTEASAS FAMILIA CASPASAS CASPASA-3 MUERTE CELULAR PROGRAMADA APOPTOSIS / MUERTE MITÓTICA (FRAGMENTACIÓN DEL ADN)
13 Mecanismo de acción in vitro Modelo de citotoxicidad Proliferación. N Muerte celular Cisplatino + + Señal. +
14 Modelización Cisplatino Mecanismo de Acción Citotóxico Cells x nm 2.5 nm 1 nm 18 nm 25 nm 5 nm 1 nm 2 nm Time (h)
15 Modelo de citotoxicidad Mecanismo de acción in vitro Proliferación Proliferación. N. % * - Muerte celular Cisplatino + + Señal. + - / + ' / 1 &%2 +. +
16 Descripción del efecto antiproliferativo % & % ' # ) ) *+,-
17 Mecanismo de acción Ciclo celular 1.5 Activación Caspasa ()µ.5 4 ' µ ' 5, * )µ * - # % & % ' * -
18 Aplicación in silico para optimizar las formulaciones k1 = 1 T5= ' 1 k1 =.5 ' 8 T5 = *+,- ' 8 4 k2 = ()µ µ )µ k2 = *+,- ' &:();:(") ) :);. :() &:();:("). :();. :() &:();:("). :(); ) :) *+,-. $. *+, - ) *+,-
19 Conclusiones Mediante esta estrategia fue posible identificar y cuantificar dos mecanismos de acción para el cisplatino: El primero: inhibición de la proliferación apoyado por el efecto observado en ciclo celular El segundo muerte celular por activación de la vía apoptótica debida a la caspasa-3. El modelo concentración-efecto propuesto tuvo características semi-mecanicista apoyadas por los resultados observados, y resultó una buena herramienta para explorar in sílico la optimización de las formulaciones para su posterior uso en sistemas in vivo
20 NANOPARTÍCULAS CISPLATINO FARMACOCINÉTICA FARMACODINAMIA EFICACIA TOXICIDAD
21 CDDP concentración (mg/l Pt) Perfiles temporales de las concentraciones plasmáticas de cisplatino Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo Tiempo (días) CDDP IV CDDP IP NP B IP
22 Evolución temporal del efecto antitumoral: cisplatino libre vs. encapsulado Tumor volume (mm 3 ) Control NP-empty Cisplatin iv Cisplatin ip NP-B ip Time (days)
23 Evolución temporal del efecto tóxico: cisplatino libre vs. encapsulado Relative change in body weight Control Cis I.V. Cis I.P. NP-B I.P Time (days)
24 Biodistribución del cisplatino y actividad apoptótica inducida en tumor Drug levels (µg cisplatin /g tissue) Caspase-3 (pg/ g tissue) Lung Liver Kidneys Spleen Tumor Tumor Control n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. 21.2± 12.3 a Cisplatin.4 ± ± ± ± ± ± 26. b Cisplatin- NP.4 ± ± ± ± 1.8*.12±.6 * 98.8±23.8* a,b NP: presentaron similar eficacia y menor toxicidad
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