INMUNOHISTOQUÍMICA AVANZADA

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1 INMUNOHISTOQUÍMICA AVANZADA

2 Título original: Inmunohistoquímica avanzada Autor: Francisco Delgado Cobalea Especialidad: T.S.S. de Anatomía Patológica y Citología Edita e imprime: FESITESS ANDALUCÍA C/ Armengual de la Mota 37 Oficina Málaga Teléfono/fax ISBN: Diseño y maquetación: Alfonso Cid Illescas Edición: mayo 2012

3 CONTENIDO UNIDAD DIDÁCTICA I PRESENTACIÓN Y METODOLOGÍA DEL CURSO Sistema de Cursos a Distancia Régimen de Enseñanza Características del Curso y del alumnado al que va dirigido Orientación de los Tutores Orientaciones para el estudio Estructura del Curso Contenidos del Curso Los Cursos Las Unidades Didácticas Sistema de Evaluación Fechas Aprendiendo a enfrentarse a preguntas tipo test Envío 16 UNIDAD DIDÁCTICA II ANTICUERPOS Inmunoglobulinas: IgG, IgM IgG IgM Anticuerpos policlonales y monoclonales Anticuerpos policlonales Anticuerpos monoclonales Afinidad del anticuerpo Reacción cruzada de anticuerpos Tasas de reacción de los anticuerpos Estabilidad del anticuerpo Manejo de anticuerpos: Recepción y condiciones de almacenamiento 29

4 UNIDAD DIDÁCTICA III CONCEPTOS DE INMUNOHISTOQUÍMICA Introducción Cómo preparar diluciones Incubación de anticuerpos: Tiempo Y Tª Tiempo Temperatura Controles Reactivos control Controles negativos Tejidos Control Indicador control de procesamiento Líneas celulares control 41 UNIDAD DIDÁCTICA IV ENZIMOLOGÍA Introducción Inhibidores específicos Inhibidores competitivos Inhibidores no competitivos Inhibición de las enzimas endógenas Inhibición de las uniones inespecíficas Enzimas más usadas en IHQ Peroxidasa y sus cromógenos Fosfatasa alcalina y sus cromógenos Preparación de Cromógenos AEC (recomendado para extensiones celulares o lesiones pigmentadas) DAB FAST RED (recomendado para extensiones celulares) NUEVA FUCSINA (recomendado para tejido) NUEVA FUCSINA (protocolo alternativo) 51

5 UNIDAD DIDÁCTICA V ESTANDARIZACIÓN EN EL PROCESO INMUNOHISTOQUÍMICO Introducción Consenso para la estandarización: Total Test Reactivos listos para usar Anticuerpos primarios Reactivos secundarios o de marcaje Desarrollo de protocolos estandarizados Controles Importancia de los reactivos listos para usar en el resto del TOTAL TEST 60 UNIDAD DIDÁCTICA VI DESENMASCARAMIENTO O RECUPERACIÓN ANTIGÉNICA Introducción Métodos Por calor: autoclave, olla, baño Por proteolisis R.A.Combinada 67 UNIDAD DIDÁCTICA VII MÉTODOS DE VISUALIZACIÓN Introducción Inmunohistoquímica: Principios Tipos: IHQ directa e IHQ indirecta Método Directo Métodos Indirectos Inmunofluorescencia Principios de fluorescencia Limitaciones de la Inmunofluorecencia Aplicaciones de la Inmunofluorescencia en Anatomía Patológica 83 UNIDAD DIDÁCTICA VIII TINCIONES MÚLTIPLES Introducción Ejemplos de tinción múltiple Pre-tratamiento Selección del método multifunción 89

6 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología Método de tinción secuencial: Método de tinción simultánea Método de pasos múltiples Selección de sustrato-cromógenos: cromogénicos, fluorescentes Colorantes cromogénicos Colorantes fluorescentes Análisis de imagen mulitinción automatizado 93 UNIDAD DIDÁCTICA IX OPTIMIZACIÓN DE REACCIONES INMUNOHISTOQUÍMICAS Digestión tisular con enzimas proteolíticas Bloqueantes enzimáticos endógenos Bloqueantes proteicos Diluyentes de anticuerpo Soluciones tampón de lavado: TBS Y PBS TBS o Tris(hidroximetil)aminometano PBS o Fosfato Buffer Salino: Comparativa de resultados variando la composición del buffer o solución de lavado Intensificadores de cromógeno (DAB) Tinciones de fondo Tinciones inespecíficas debido a la actividad Tinción inespecífica debido al uso de polímeros para el revelado Tinción inespecífica debida a la recuperación antigénica Tinción inespecífica debida a la difusión del antígeno Tinción inespecífica debida a anticuerpos Tinción inespecífica debida a reactividad cruzada Tinción inespecífica debida a los receptores de Fc Tinción inespecífica debida a interacciones hidrofóbicas, iónicas o electrostáticas Tinción inespecífica debida a proteínas tisulares Tinción inespecífica debida a la subclase de anticuerpo Tinción inespecífica debida a uniones mediadas por el complemento Tinción inespecífica debida a otras causas 109 6

7 UNIDAD DIDÁCTICA X PROBLEMAS EN LOS RESULTADOS Y ACCIONES CORRECTIVAS RECOMENDADAS Introducción No tinción o tinción subóptima en control positivo y muestras Tinción adecuada en control, pero subóptima en muestras Tinción inespecífica en control positivo y muestras 115 GLOSARIO 117 Glosario de términos 119 DIAGRAMA DE SÍMBOLOS 123 Diagrama de símbolos 125 CUESTIONARIO 127 Cuestionario 129

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9 UNIDAD DIDÁCTICA I PRESENTACIÓN Y METODOLOGÍA DEL CURSO

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11 Inmunohistoquímica avanzada Presentación, normas y procedimientos de trabajo. Introducción Antes de comenzar el Curso, es interesante conocer su estructura y el método que se ha de seguir. Este es el sentido de la presente introducción. Presentación 1. Sistema de Cursos a Distancia En este apartado aprenderá una serie de aspectos generales sobre las técnicas de formación que se van a seguir para el estudio. 2. Orientaciones para el estudio. Si usted no conoce la técnica empleada en los Cursos a Distancia, le recomendamos que lea atentamente los epígrafes siguientes, los cuales le ayudarán a realizar el Curso en las mejores condiciones. En caso contrario, sólo tiene que seguir los pasos que se indican en el siguiente índice: Se dan una serie de recomendaciones generales para el estudio y las fases del proceso de aprendizaje propuesto por el equipo docente. 3. Estructura del Curso Mostramos cómo es el Curso, las Unidades Temáticas de las que se compone, el sistema de evaluación y cómo enfrentarse al tipo test. 1.1 Sistema de Cursos a Distancia Régimen de Enseñanza La metodología de Enseñanza a Distancia, por su estructura y concepción, ofrece un ámbito de aprendizaje donde pueden acceder, de forma flexible en cuanto a ritmo individual de dedicación, estudio y aprendizaje, a los conocimientos que profesional y personalmente le interesen. Tiene la ventaja de estar diseñada para adaptarse a las disponibilidades de tiempo y/o situación geográfica de cada alumno. Además, es participativa y centrada en el desarrollo individual y orientado a la solución de problemas clínicos. La Formación a Distancia facilita el acceso a la enseñanza a todos los Técnicos Especialistas/Superiores Sanitarios Características del Curso y del alumnado al que va dirigido Todo Curso que pretenda ser eficaz, efectivo y eficiente en alcanzar sus objetivos, debe adaptarse a los conocimientos previos de las personas que lo estudiarán (lo que saben y lo que aún no han aprendido). Por tanto, la dificultad de los temas presentados se ajustará a sus intereses y capacidades. Un buen Curso producirá resultados deficientes si lo estudian personas muy diferentes de las inicialmente previstas. Los Cursos se diseñan ajustándose a las características del alumno al que se dirige. 11

12 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología Orientación de los Tutores Para cada Curso habrá, al menos, un tutor al que los alumnos podrán dirigir todas sus consultas y plantear las dificultades. Las tutorías están pensadas partiendo de la base de que el aprendizaje que se realiza en esta formación es totalmente individual y personalizado. El tutor responderá en un plazo mínimo las dudas planteadas a través de correo electrónico exclusivamente. Diferenciamos para nuestros Cursos dos tipos de tutores: Académicos. Serán aquellos que resuelvan las dudas del contenido del Curso, planteamientos sobre cuestiones test y casos clínicos. El tutor resuelve las dudas que se plantean por correo electrónico. Orientadores y de apoyo metodológico. Su labor se centrará fundamentalmente en cuestiones de carácter psicopedagógicas, ayudando al alumno en horarios, métodos de trabajo o cuestiones más particulares que puedan alterar el desarrollo normal del Curso. El tutor resuelve las dudas que se plantean por correo electrónico. 1.2 Orientaciones para el estudio Los resultados que un estudiante obtiene no están exclusivamente en función de las aptitudes que posee y del interés que pone en práctica, sino también de las técnicas de estudio que utiliza. Aunque resulta difícil establecer unas normas que sean aplicables de forma general, es más conveniente que cada alumno se marque su propio método de trabajo, les recomendamos las siguientes que pueden ser de mayor aprovechamiento. Por tanto, aún dando por supuestas la vocación y preparación de los alumnos y respetando su propia iniciativa y forma de plantear el estudio, parece conveniente exponer algunos patrones con los que se podrá guiar más fácilmente el desarrollo académico, aunque va a depender de la situación particular de cada alumno y de los conocimientos de la materia del Curso: Decidir una estrategia de trabajo, un calendario de estudio y mantenerlo con regularidad. Es recomendable tener al menos dos sesiones de trabajo por semana. Elegir el horario más favorable para cada alumno. Una sesión debe durar mínimo una hora y máximo tres. Menos de una hora es poco, debido al tiempo que se necesita de preparación, mientras que más de tres horas, incluidos los descansos, puede resultar demasiado y descendería el rendimiento. Utilizar un sitio tranquilo a horas silenciosas, con iluminación adecuada, espacio suficiente para extender apuntes, etc. Estudiar con atención, sin distraerse. Nada de radio, televisión o música de fondo. También es muy práctico subrayar los puntos más interesantes a modo de resumen o esquema. 12

13 Inmunohistoquímica avanzada a) Fase receptiva. Observar en primer lugar el esquema general del Curso. Hacer una composición de lo que se cree más interesante o importante. Leer atentamente todos los conceptos desarrollados. No pasar de uno a otro sin haberlo entendido. Recordar que en los Cursos nunca se incluyen cuestiones no útiles. Anotar las palabras o párrafos considerados más relevantes empleando un lápiz o rotulador transparente. No abusar de las anotaciones para que sean claras y significativas. Esquematizar en la medida de lo posible sin mirar el texto el contenido de la Unidad. Completar el esquema con el texto. Estudiar ajustándose al horario, pero sin imbuirse prisas o impacientarse. Deben aclararse las ideas y fijarse los conceptos. Resumir los puntos considerados primordiales de cada tema. Marcar los conceptos sobre los que se tengan dudas tras leerlos detenidamente. No insistir de momento más sobre ellos. b) Fase reflexiva. Reflexionar sobre los conocimientos adquiridos y sobre las dudas que hayan podido surgir, una vez finalizado el estudio del texto. Pensar que siempre se puede acudir al tutor y a la bibliografía recomendada y la utilizada en la elaboración del tema que puede ser de gran ayuda. Seguir paso a paso el desarrollo de los temas. Anotar los puntos que no se comprenden. Repasar los conceptos contenidos en el texto según va siguiendo la solución de los casos resueltos. c) Fase creativa. En esta fase se aplican los conocimientos adquiridos a la resolución de pruebas de autoevaluación y a los casos concretos de su vivencia profesional. Repasar despacio el enunciado y fijarse en lo que se pide antes de empezar a solucionarla. Consultar la exposición de conceptos del texto que hagan referencia a cada cuestión de la prueba. Solucionar la prueba de cada Unidad Temática utilizando el propio cuestionario del manual. 13

14 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología 1.3 Estructura del Curso Contenidos del Curso Guía del alumno. Temario del curso en PDF, con un cuestionario tipo test. FORMULARIO, para devolver las respuestas al cuestionario. ENCUESTA de satisfacción del Curso Los Cursos Los cursos se presentan en un archivo PDF cuidadosamente diseñado en Unidades Didácticas Las Unidades Didácticas Son unidades básicas de estos Cursos a distancia. Contienen diferentes tipos de material educativo distinto: Texto propiamente dicho, dividido en temas. Bibliografía utilizada y recomendada. Cuestionario tipo test. Los temas comienzan con un índice con las materias contenidas en ellos. Continúa con el texto propiamente dicho, donde se desarrollan las cuestiones del programa. En la redacción del mismo se evita todo aquello que no sea de utilidad práctica. El apartado de preguntas test serán con los que se trabajen, y con los que posteriormente se rellenará el FORMULARIO de respuestas a remitir. Los ejercicios de tipo test se adjuntan al final del temario. Cuando están presentes los ejercicios de autoevaluación, la realización de éstos resulta muy útil para el alumno, ya que: Tienen una función recapituladora, insistiendo en los conceptos y términos básicos del tema. Hacen participar al alumno de una manera más activa en el aprendizaje del tema. Sirven para que el alumno valore el estado de su aprendizaje, al comprobar posteriormente el resultado de las respuestas. Son garantía de que ha estudiado el tema, cuando el alumno los ha superado positivamente. En caso contrario se recomienda que lo estudie de nuevo. Dentro de las unidades hay distintos epígrafes, que son conjuntos homogéneos de conceptos que guardan relación entre sí. El tamaño y número de epígrafes dependerá de cada caso. 14

15 Inmunohistoquímica avanzada Sistema de Evaluación Cada Curso contiene una serie de pruebas de evaluación a distancia que se encuentran al final del temario. Deben ser realizadas por el alumno al finalizar el estudio del Curso, y enviada al tutor de la asignatura, con un plazo máximo de entrega para que pueda quedar incluido en la edición del Curso en la que se matriculó y siempre disponiendo de 15 días adicionales para su envío. Los tutores la corregirán y devolverán al alumno. Si no se supera el cuestionario con un mínimo del 80% correcto, se tendrá la posibilidad de recuperación. La elaboración y posterior corrección de los test ha sido diseñada por el personal docente seleccionado para el Curso con la intención de acercar el contenido de las preguntas al temario asimilado. Es IMPRESCINDIBLE haber rellenado el FORMULARIO y envío de las respuestas para recibir el certificado o Diploma de aptitud del Curso Fechas El plazo de entrega de las evaluaciones será de un mes y medio a partir de la recepción del material del curso, una vez pasado este plazo conllevará una serie de gestiones administrativas que el alumno tendrá que abonar. La entrega de los certificados del Curso estará en relación con la fecha de entrega de las evaluaciones y NUNCA antes de la fecha de finalización del Curso Aprendiendo a enfrentarse a preguntas tipo test La primera utilidad que se deriva de la resolución de preguntas tipo test es aprender cómo enfrentarnos a las mismas y evitar esa sensación que algunos alumnos tienen de se me dan los exámenes tipo test. Cuando se trata de preguntas con respuesta tipo verdadero / falso, la resolución de las mismas está más dirigida y el planteamiento es más específico. Las preguntas tipo test con varias posibles respuestas hacen referencia a conocimientos muy concretos y exigen un método de estudio diferente al que muchas personas han empleado hasta ahora. Básicamente todas las preguntas test tienen una característica común: exigen identificar una opción que se diferencia de las otras por uno o más datos de los recogidos en el enunciado. Las dos palabras en cursiva son expresión de dos hechos fundamentales con respecto a las preguntas tipo test: Como se trata de identificar algo que va a encontrar escrito, no va a ser necesario memorizar conocimientos hasta el punto de reproducir con exactitud lo que uno estudia. Por lo tanto, no debe agobiarse cuando no consiga recordad de memoria una serie de datos que aprendió hace tiempo; seguro que muchos de ellos los recordará al leerlos formando parte del enunciado o las opciones de una pregunta de test. El hecho de que haya que distinguir una opción de otras se traduce en muchas ocasiones en que hay que estudiar diferencias o similitudes. Habitualmente se les pide 15

16 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología recordar un dato que se diferencia de otros por ser el más frecuente, el más característico, etc. Por lo tanto, este tipo de datos o situaciones son los que hay que estudiar. Debe tenerse siempre en cuenta que las preguntas test hay que leerlas de forma completa y fijándose en determinadas palabras que puedan resultar clave para la resolución de la pregunta. La utilidad de las preguntas test es varia: Acostumbrarse a percibir errores de conceptos. Adaptarse a los exámenes de selección de personal. Ser capaces de aprender sobre la marcha nuevos conceptos que pueden ser planteados en estas preguntas, conceptos que se retienen con facilidad Envío Una vez estudiado el material docente, se contestará la encuesta de satisfacción, la cual nos ayudará para evaluar el Curso, corregir y mejorar posibles errores. Cuando haya cumplimentado la evaluación, envíe las respuestas a la dirección indicada. 16

17 UNIDAD DIDÁCTICA II ANTICUERPOS

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19 Inmunohistoquímica avanzada 2.1 Inmunoglobulinas: IgG, IgM El anticuerpo es el reactivo principal en immunohistoquímica. La disponibilidad de antisueros, fracciones de inmunoglobulinas y anticuerpos monoclonales, para un número cada vez mayor de antígenos de utilidad clínica, ha incrementado enormemente la cantidad y calidad del repertorio inmunohistológico. Como es lógico pensar, la elección del anticuerpo primario es fundamental para un buen resultado. Debemos utilizar un anticuerpo monoclonal o policlonal lo más específico posible, dependiendo del epítopo a poner de manifiesto. La dilución y el tiempo de incubación deben de ser los adecuados, para conseguir una reacción lo más intensa y sensible posible con el menor fondo. Para una mayor comprensión del potencial que tienen las técnicas inmunohistoquímicas, así como los problemas que se presentan en las mismas, es necesario tener un conocimiento básico de los anticuerpos, su potencial y sus limitaciones. Los anticuerpos pertenecen a un grupo de proteínas llamadas Inmunoglobulinas (comúnmente abreviado como Ig). Si las clasificamos en función de la cantidad que se encuentra en plasma o suero (en orden decreciente), las inmunoglobulinas se pueden dividir en 5 grupos principales: IgG, IgA, IgM, IgD y IgE. Cada inmunoglobulina está compuesta por dos cadenas pesadas (H) idénticas y dos cadenas ligeras (L) también idénticas. Las cadenas H difieren de las L en sus propiedades antigénicas y estructurales, y determinan los tipos y subtipos de inmunoglobulinas. A su vez, las dos cadenas L pueden ser de tipo kappa o lambda. La distribución de kappa y lambda es diferente en todos los tipos y subtipos de inmunoglobulinas, así como entre las distintas especies animales. El tipo de enlace covalente que une a las cadenas L y H y también a las H entre sí son los puentes bisulfuro. Estos enlaces participan en la estructura terciaria de la inmunoglobulina y le proporcionan una gran estabilidad. De los cinco tipos de inmunoglobulinas, prestaremos una mayor atención a IgG e IgM, debido a que son las que se utilizan más frecuentemente en inmunohistoquímica. L: Cadena ligera (light) de la inmunoglobulina H: Cadena pesada (heavy) de la inmunoglobulina Estructura de una Ig humana 19

20 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología IgG Está compuesta por dos cadenas pesadas gamma y por dos ligeras, que pueden ser kappa o lambda (peso molecular=150kd). Su fórmula se escribiría así: o. La estructura de Ig G ha sido estudiada mediante digestiones enzimáticas con papaína o bien con pepsina y también mediante disociación reductora de la molécula: Si la digestión se hace con papaína, obtenemos el fragmento constante de la inmunoglobulina (Fc) y 2 fragmentos de unión a antígeno monovalentes porque el punto de digestión está por encima del puente de unión (puente disulfuro) entre las dos cadenas pesadas. Si la digestión se hace con pepsina, la zona de ruptura será por debajo del puente de unión de las dos cadenas pesadas y el resultado será un fragmento constante de la inmunoglobulina (Fc) y 1 fragmento de unión a antígeno bivalente (F(ab )2. En este caso, los fragmentos constantes (Fc) son destruidos. La disociación reductora de una molécula IgG rompe los puentes disulfuro entre las cadenas pesadas g, y si los grupos sulfhidrilo se bloquean, da lugar a la formación de 2 cadenas pesadas H (de 50kDa cada una) y dos cadenas ligeras L (de 25kDa cada una). Además la molécula de IgG se puede dividir en dos dominios: dominios variables (V) y dominios constantes (C). Cada dominio consta de 110 a 120 aminoácidos y un puente disulfuro intracatenario. Las regiones variables de la cadena ligera (VL) junto con las regiones variables de la cadena pesada (VH) formas en dominio de unión al antígeno. Hay muchas regiones hipervariables (HV) dentro de los dominios VH y VL. Durante la reacción antígeno-anticuerpo, estas regiones HV de la inmunoglobulina entran en estrecho contacto con el epítopo (región del antígeno con la que se une al anticuerpo), aproximadamente a una distancia de 0.2 a 0.3nm. Es en esta región hipervariable donde se localizan los determinantes idiopáticos o características estructurales únicas. Cada clon de anticuerpos expresa su propio idiotipo. Cada cadena ligera (kappa o lambda) tiene un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL). Cada cadena pesada tiene un dominio variable y 3 dominios constantes (CH1, CH2 y CH3). Estos tres últimos conforman la parte CT de la inmunoglobulina. En el dominio CH2, es donde se localizan numerosos aminoácidos aromáticos neutros muy hidrofóbicos. Entre CH1 y CH2 se localiza la curvatura tan característica de esta molécula, donde se unen las cadenas ligeras. Variaciones en esta región de curvatura es lo que origina los diferentes subtipos de inmunoglobulina IgG: IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4. En humanos, en general la proporción de inmunoglobulinas con cadenas y con cadenas es de 2:1. En los ratones, el 95% de inmunoglobulinas tienen cadena ligera kappa, por tanto la mayoría de anticuerpos monoclonales de esta especie tendrá cadenas ligeras kappa. Partes de una inmunoglobulina humana A: Región de la curvatura del anticuerpo. B: Zona de digestión de la papaína.c: Zona de digestión de la pepsina. D:Región variable de la Inmunoglobulina. E: Región constante de la Inmunoglobulina. 20

21 Inmunohistoquímica avanzada IgM Es un pentámero (peso molecular aproximado = 900kDa) formado por 5 subunidades de 180kDa, formadas por 2 cadenas pesadas (µ) y dos cadenas ligeras de tipo y. La fórmula general de esta inmunoglobulina es o Las subunidades están unidas entre sí por un pequeño péptido rico en grupos sulfhidrilo, la cadena J (15 kda), que contribuye a la integridad y estabilidad del pentámero. Mientras que IgG es el anticuerpo más abundante en el individuo inmunizado, IgM es el primero que se detecta por su gran tamaño. La génesis de inmunoglobulinas pasa por varias etapas: se inyecta el inmunógeno o antígeno, que irá a parar a espacios intra y extravasculares. A continuación, el antígeno es catabolizado a fragmentos más pequeños y éstos eliminados por los anticuerpos recién formados. El período que comprende desde la inoculación del antígeno hasta la aparición de las primeras IgM se llama período de latencia y puede durar hasta una semana. A las dos semanas (o antes si hay una segunda inoculación) las inmunoglobulinas IgG ya predominan. Al igual que el resto de proteínas, los anticuerpos pueden ser catabolizados. Al igual que las IgG, las IgM también se pueden fragmentar por digestión enzimática o por disociación reductora, en fragmentos Fab, Fc y F (ab )2. El Fc de la IgM es una molécula cíclica pentamérica (PM: 340KDa). El tratamiento de esta molécula con 0.1% de -mercapetanol, rompe los puentes disulfuro entre las subunidades y da lugar a un 5 monómeros. Se han descrito 2 subclases de IgM: IgM1 e IgM2. Mientras que las IgM tienen una vida media corta (4-6 días). Los niveles en sangre de IgG suelen durar hasta 3 semanas. A menos que se hagan inoculaciones repetidas, al cabo de este tiempo, el nivel de inmunoglobulinas en sangre disminuye. Estructura de una IgM a: Estructura de una IgM. Las 5 subunidades de la IgM de ratón unidas por puentes disulfuro y por una cadena J que cierra el anillo pentamérico b: Estructura de una subunidad de IgM. Se compone de 2 cadenas pesadas mu (µ) y dos cadenas ligeras ( o ), cada una de ellas con sus regiones constantes (C) y sus regiones variables (V) 21

22 2.2. Anticuerpos policlonales y monoclonales Anticuerpos policlonales Es una mezcla heterogénea de anticuerpos dirigida contra varios epítopos del mismo antígeno. Son producidos por diferentes clones de células B, y por tanto, poseen una reacción inmune diferente, es decir, reaccionan con epítopos o regiones diferentes en el antígeno contra el que se han generado. El animal más utilizado con diferencia para la producción de anticuerpos policlonales es el conejo, seguido por la cabra, el cerdo, la oveja, el caballo, el conejillo de indias y otros en menor medida. Unido a su facilidad de mantenimiento, los conejos presentan como ventaja adicional, el hecho de que raramente se producen anticuerpos humanos contra proteínas de conejo, mientras que los anticuerpos humanos contra proteínas de rumiantes, como la cabra, si son frecuentes. Además, las características de la reacción entre anticuerpos de conejo y las proteínas humanas permiten una menor variación de lote a lote. Dependiendo de la inmunogenicidad del antígeno, normalmente dosis de mg de antígeno en volúmenes de 0,1 a 0,5mL, es suficiente para generar respuesta inmune en animales. La inmunización dura de 6-8 meses, pero conviene repetir la inmunización mensualmente para evitar una disminución de la concentración de anticuerpos en sangre. Para antígenos o péptidos pequeños o poco inmunogénicos se suelen acoplar a proteínas portadoras tipo: ovoalbúmina (OVA), albúmina de suero bovino (BSA) o hemocianina (KLH). El suero se separa de la sangre por centrifugación, este suero contiene la mezcla de todos los tipos de anticuerpos policlonales. Para eliminar las proteínas y purificar las inmunoglobulinas se puede hacer por precipitación con sulfato amónico y cromatografía de intercambio iónico o aislamiento por afinidad. Esquema anticuerpos policlonales Diagrama esquemático de anticuerpos policlonales uniéndose a varios epítopos de un antígeno

23 Inmunohistoquímica avanzada Anticuerpos monoclonales Los anticuerpos monoclonales son una población homogénea de inmunoglobulinas, el producto de un clon individual de células plasmáticas. Los anticuerpos de un clon determinado son idénticos y reaccionan con un epítopo específico del antígeno contra el que se han producido, se producen principalmente en ratones y algunos utilizados en investigación se producen en rata o en camello. Los animales se inmunizan usando inyecciones peritoneales del inmunógeno cada dos semanas, durante 2 meses en el caso de los ratones o cada 4 meses en el caso de los conejos. La respuesta inmune del animal es monitorizada periódicamente. Cuando el animal alcanza una respuesta inmune óptima, es decir, con suficiente concentración de anticuerpos en sangre, el animal es sacrificado, se aíslan los linfocitos B del bazo y se realiza una fusión celular entre el linfocito B productor de inmunoglobulinas contra ese antígeno y una línea celular inmortalizada (línea celular de mieloma). Los linfocitos B aportan la capacidad de producir una inmunoglobulina específica, mientras que la célula de mieloma, aporta la capacidad de inmortalidad, de crecer indefinidamente en cultivo. Esta fusión de células se denomina HIBRIDOMA. Dicha línea celular se cultiva y se selecciona hasta dar con un clon estable con alta capacidad de producir anticuerpos. Los biorreactores son sistemas para generar anticuerpos y crecimiento de hibridomas a gran escala. En ocasiones también se ha usado líquido ascítico para aislar anticuerpos, pues se obtiene una mayor concentración que los sobrenadantes de cultivos celulares, aunque puede haber anticuerpos contaminantes. Se inyectan las células de hibridoma en la cavidad abdominal del animal (ratón habitualmente), las cuales forman un tumor y luego se extrae el líquido ascítico de la cavidad abdominal. Debido a las consideraciones éticas, este método ha caído en desuso a favor de otros protocolos alternativos. Los anticuerpos monoclonales se puede usar como solución de sobrenadante de un cultivo o como líquido ascítico. Esquema anticuerpos monoclonales Esquema de un varias moléculas un anticuerpo monoclonal uniéndose todas al mismo epítopo del antígeno. 23

24 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología Si bien la gran mayoría de los anticuerpos monoclonales se producen en ratones, un número creciente de anticuerpos monoclonales se fabrican en conejo. El uso de anticuerpos policlonales de conejo confiere algunas ventajas sobre anticuerpos monoclonales de ratón. Estas ventajas también se dan en los anticuerpos policlonales de conejo. Los anticuerpos de conejo tienen un reconocimiento del epítopo más diverso que los anticuerpos de ratón, hay menos inmunodominancia y por tanto una mejor respuesta ante un epítopo muy pequeño. Hay una tendencia a usar conejos para generar anticuerpos con mayor afinidad y avidez en general. Los anticuerpos resultantes tienen mejor capacidad de unión debido a un alto grado de glicosilación de la molécula. Los hibridomas de ratón tienden a generar una mayor producción de inmunoglobulinas y las líneas celulares de hibridoma de ratón son más estables que los hibridomas de conejo. Dependiendo del uso que se quiera dar al anticuerpo, ambos tipos policlonales y monoclonales tienen unas ventajas concretas. Ventajas de los anticuerpos monoclonales respecto a los policlonales: Alta homogeneidad Producción independiente del estado inmunológico del animal ni de la vida del animal ya que el uso del hibridoma permite una producción mantenida. Ausencia de anticuerpos no específicos Fácil caracterización Ausencia de variabilidad entre lotes Ausencia de reacciones cruzadas con otras proteínas Ausencia de variabilidad inherente, típica de los policlonales, dependiente del estado inmunológico del animal. Protocolo de producción de un anticuerpo monoclonal A: Inmunización y estimulación B: Aislamiento de linfocitos B C: Células mieloma D: Se escogen las clonas positivas E: Se hace cultivo celular de las clonas para enriquecerlas F: Se recoge sobrenadante del cultivo para aislar la población homogénea de anticuerpos 24

25 A pesar de estas ventajas, los anticuerpos monoclonales también presentan inconvenientes: Los métodos de selección de los clones útiles y el control de calidad deben ser idénticos a los métodos o técnicas para los que se van a utilizar estos clones. Ej: con frecuencia, los anticuerpos monoclonales se caracterizan usando tejido congelado, a pesar de que se utilizarán fundamentalmente sobre tejido fijado en formol. Por ello, es necesario que el epítopo resista el proceso de la fijación. En algunos casos, se ha demostrado que algunos antígenos sobreviven a la fijación y se detectan usando anticuerpos policlonales, porque se ha perdido la inmunorreactividad contra el epítopo contra el que estaba dirigido el anticuerpo monoclonal. La reactividad de un epítopo después de una fijación óptima no implica que esta reactividad se mantenga bajo condiciones subóptimas. El epítopo diana debe ser exclusivo del antígeno que se quiere localizar. La característica principal de los anticuerpos monoclonales, la especificidad, se pierde si el anticuerpo se dirige contra un epítopo compartido por diferentes antígenos. El método de búsqueda debe tener en consideración que los anticuerpos monoclonales, comparados con los policlonales, dependen más de factores ambientales, como el ph y la dilución, a la hora de conseguir una tinción óptima. Ventajas de los anticuerpos policlonales respecto a los monoclonales: Debido a la multiclonalidad son más robustos, tienen mayor sensibilidad Debido a su capacidad de reconocer diversos epítopos en una sola molécula, no es susceptible del efecto deletéreo del procesamiento del tejido, como si ocurre con los monoclonales que reconocen un solo epítopo. Protocolo de producción de un anticuerpo policlonal A: Inmunización y estimulación B: Recolección de sangre C: Se asila el suero, ahí tendremos la mezcla heterogénea de anticuerpos

26 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología Afinidad del anticuerpo Los anticuerpos de animales inmunizados no sólo son diferentes en los epítopos a los que reconocen, sino que también difieren en las afinidades por éstos. El término afinidad se ha utilizado para definir tanto la afinidad intrínseca como la funcional. La afinidad intrínseca de un anticuerpo reside en la región que determina la especificidad (regiones HV) y por las interacciones moleculares entre el antígeno y el anticuerpo (interacciones iónicas, puentes de hidrógeno y fuerzas de van der Waals fundamentalmente). Sin embargo, no es cierto que una mayor especificidad implique necesariamente una mayor afinidad. Hay que considerar también un factor como la hidrofobicidad, la cual confiere estabilidad a la unión antígeno-anticuerpo o inmunocomplejo. No se dan uniones covalentes entre antígeno y anticuerpo. A mayor afinidad del antígeno por el anticuerpo, se necesita una menor concentración de anticuerpo libre para llegar a la saturación de los centros de unión, es decir, a alcanzar el equilibrio. De la misma manera que la concentración de anticuerpo en sangre aumenta con el tiempo durante la inmunización, también aumenta su afinidad, es decir, su calidad. A este fenómeno se le denomina MADUREZ DE LA AFINIDAD. En inmunohistoquímica, la afinidad funcional puede definirse como el tiempo requerido por el anticuerpo para llegar al equilibrio (saturación) con el antígeno. A una mayor afinidad, se requerirá un tiempo más corto para alcanzar el equilibrio, por ello a la afinidad funcional se la conoce también como avidez. El término avidez también se utiliza para definir la fuerza de la unión entre antígeno y anticuerpo, o incluso para describir la suma total de todas las afinidades intrínsecas de anticuerpo policlonal. La unión antígeno-anticuerpo es reversible, por eso los complejos que se formen en los tejidos pueden romperse durante los ciclos de lavado de la técnica inmunohistoquímica. La tendencia y grado de la disociación dependen del anticuerpo, aunque también puede influir la concentración de sales en el medio o la temperatura. Se ha demostrado que una baja concentración de sales y las bajas temperaturas disminuyen la probabilidad de un marcaje inmunohistoquímico debido a la disociación de los complejos antígeno-anticuerpo. Por todo esto son deseables anticuerpos de gran afinidad, que minimicen el riesgo de disociación durante el proceso de la inmunohistoquímica. En las poblaciones de anticuerpos policlonales encontramos poblaciones de todo tipo, de afinidades altas y bajas contra diferentes epítopos, lo que disminuye la probabilidad de pérdida de marcaje por disociación de la unión antígeno-anticuerpo. Al contrario que los policlonales, los anticuerpos monoclonales, al contener un único clon, presentan una afinidad uniforme y, por ello, la probabilidad de un marcaje débil por disociación de la unión antígeno al lavar el anticuerpo es mayor. La afinidad de los anticuerpos también está relacionada con su capacidad para formar complejos insolubles. Generalmente, cuanto mayor es la afinidad del anticuerpo, mayor es su tendencia a formar precipitados. La formación de precipitados pasa por un estado soluble, muy rápido, en el cual se forman los complejos antígeno-anticuerpo, seguido por una agregación lenta de estos inmunocomplejos hasta terminar precipitando. Los anticuerpos monoclonales, independientemente de si son de alta o baja afinidad, no forman estos agregados con el antígeno y, por tanto, raramente producen precipitados. Sin 26

27 Inmunohistoquímica avanzada embargo, en inmunohistoquímica, la capacidad de un anticuerpo primario para formar complejos insolubles no es tan importante, porque se pretende la inmovilización del anticuerpo en el tejido, más que su precipitación. El efecto PROZONA se observó por primera vez en aglutinaciones de anticuerpos. Lo que ocurre es que algunos anticuerpos, cuando no se diluyen lo suficiente, no son capaces de unirse a las células. Esto es un fenómeno más frecuente en reacciones de inmunoprecipitación, sin embargo, en reacciones inmunohistoquímicas es más raro de ver. Un exceso de anticuerpo puede resultar en tinción negativa por aglutinación de las inmunoglobulinas. Casi todos los anticuerpos tienen una carga electrostática neta positiva, de modo que la fuerza de la unión de anticuerpo al tejido dependerá de la abundancia y disponibilidad de carga neta negativa del antígeno. Un exceso de fijación altera esta disponibilidad de cargas y por tanto que la inmunoreactividad del anticuerpo no sea siempre la misma ante el mismo tejido. Esta pérdida de afinidad por alteración de cargas en el antígeno puede recuperarse mediante el uso de una recuperación antigénica a base de calor. Aunque en condiciones ideales la reacción de unión antígeno-anticuerpo es muy rápida, en inmunohistoquímica, no ocurre así, pues el tiempo de la fijación del tejido, la concentración del anticuerpo, la temperatura ambiente, etc... influyen tanto que puede llegar a alargar el tiempo de incubación hasta 48h para conseguir una reactividad máxima. Dado que la inmunohistoquímica se ha convertido en un instrumento vital del diagnóstico patológico, es necesario acortar estos procesos todo lo posible. La manera de acortarlos en incrementando la tasa de reacción antígeno-anticuerpo con altas concentraciones de anticuerpo y usando anticuerpos de alta afinidad. El tamaño y la forma de la molécula de anticuerpo, así como los conjugados que se añaden después para el revelado determinan el resultado de la inmunohistoquímica, pues cuando hay una sobrefijación del tejido, se hace más difícil la penetración de la molécula de anticuerpo o del complejo en el tejido Reacción cruzada de anticuerpos La reactividad o reacción cruzada (del inglés, cross-reactivity) ocurre cuando un mismo anticuerpo puede reaccionar con diferentes antígenos o viceversa, cuando un antígeno puede ser reconocido por diferentes anticuerpos. El clásico ejemplo es cuando los anticuerpos contra las cadenas Lambda o Kappa reaccionan con las otras 5 clases de Igs. El denominador común en ambos casos es la compartición de al menos un epítopo común entre varios antígenos. Otra causa por la cual se puede encontrar reactividad cruzada es la modificación de epítopos de manera accidental o experimental, por ejemplo, a través de la fijación o de la recuperación antigénica; lo que conduce a una pérdida de especificidad del anticuerpo por ese epítopo en particular. También podemos encontrar reactividad cruzada por interacción de un anticuerpo con epítopos parecidos o diferentes en antígenos no relacionados. Este fenómeno se observa en 27

28 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología mayor medida con anticuerpos de baja afinidad y suelen variar debido al fenómeno de maduración durante la inmunización. La reactividad de anticuerpos contra antígenos humanos con antígenos similares o idénticos de otras especies animales recibe el nombre de reactividad cruzada interespecífica. Esta característica puede ser de utilidad en el campo de la investigación con modelos animales. Se ha visto que la mayoría de los antígenos animales reaccionan con anticuerpos antihumanos Tasas de reacción de los anticuerpos Aunque bajo condiciones ideales el anticuerpo reacciona con el antígeno, en inmunohistoquímica rara vez se dan esas condiciones ideales. Para alcanzar un máximo de reactividad a veces hace falta tiempos de incubación muy largos (hasta 48h), dependiendo del tiempo de fijación, de la concentración del anticuerpo, temperatura y humedad del ambiente, etc Sin embargo, la necesidad de acortar tiempos de diagnóstico impera en la patología. Esto se logra aumentando la tasa de reacción, es decir, mediante el uso de anticuerpos de alta afinidad. Aumentar la concentración del anticuerpo no siempre es la solución para obtener más reactividad, puesto que corremos el riesgo de tener tinción de fondo. Sólo una pequeña proporción de las moléculas de anticuerpo se unen al tejido. Una vez encontrado el tiempo óptimo de incubación, éste no debe variarse. El tamaño y la conformación del anticuerpo influyen en el resultado del proceso inmunohistoquímico, si el tejido está bien fijado el tamaño del anticuerpo no supone un problema, pero una sobrefijación del tejido provoca que la penetración del anticuerpo y los complejos de visualización sea muy difícil Estabilidad del anticuerpo Los anticuerpos policlonales cuando se conservan sin congelar y se usan para inmunohistoquímica, de alguna manera la fracción inmunoglobulínica es menos estable que el suero entero. Se ha visto que esta disminución en la estabilidad se debe al método de purificación del anticuerpo y almacenamiento. La exposición del anticuerpo a ph extremos y concentraciones de sales muy altas o muy bajas afecta a la estabilidad mucho más que las condiciones suaves bajo las que se da la cromatografía de intercambio iónico. Cuando el tiempo de almacenamiento se prolonga más allá de la fechas de caducidad, en ocasiones aparecen agregados solubles en la solución del anticuerpo. Estos agregados se deben a las interacciones hidrofóbicas entre las IgG y provocan un aumento en las uniones inespecíficas. Si se conservan purificados, puede aumentar su hidrofobicidad y por tanto su conjugación con otras moléculas (como el glutaraldehído). 28

29 Inmunohistoquímica avanzada En las IgG hay muchos sitios que reaccionan con el glutaraldehído, la hidrofobicidad de los anticuerpos conjugados aumenta mucho, dando lugar a una atracción por los sitios hidrofóbicos del tejido fijado y aumentando la tinción de fondo. La reactividad de anticuerpos monoclonales también se ve influenciada por el método de purificación. Los anticuerpos de la clase IgM y subclase IgG2b, eran especialmente sensibles a las condiciones de aislamiento, puede alterar su afinidad, especificidad o reacción cruzada con otros antígenos. Cada proveedor hace pruebas de estabilidad del anticuerpo bajo diversas condiciones de tiempo y temperatura de almacenaje para poder ofrecer dicha información al usuario final del laboratorio. Lo habitual es que las condiciones de almacenamiento del proveedor sean más favorables que las del usuario. Previendo la posibilidad, se acorta la vida media útil del reactivo para que no se aprecien cambios en su calidad Manejo de anticuerpos: Recepción y condiciones de almacenamiento Los contenedores más apropiados para la conservación de anticuerpos es aquel que tiene un índice mínimo de adsorción proteica, por ejemplo: recipientes de propileno, borosilicato o policarbonato. En las soluciones con un bajo contenido en proteínas (menos de mg/mL) convendría añadir una proteína inmunohistoquímicamente inerte, para evitar la adsorción del anticuerpo al contenedor. Generalmente se suele añadir 0.1-1% BSA. En cuanto a la temperatura de conservación, lo ideal es conservar los anticuerpos prediluídos y las soluciones de conjugados a 2-8ºC, porque la congelación y descongelación tiene un mal efecto sobre los anticuerpos. Las soluciones proteicas, como antisueros o fracciones de inmunoglobulina se recomienda alicuotar y congelar a -20ºC. Cuando se vayan a usar, atemperar a temperatura ambiente y evitar temperaturas superiores a 25ºC. No usar nunca reactivos fuera de la fecha de caducidad, o al menos comprobar su fincionalidad. Depende de la aplicación última, nos será más útil un anticuerpo monoclonal o policlonal. Es fundamental seguir las instrucciones de mantenimiento proporcionadas por el proveedor. Una vez optimizadas las condiciones de uso de un anticuerpo para un material concreto (tejido fijado, tejido congelado, citología ) no deben variarse nunca. 29

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31 UNIDAD DIDÁCTICA III CONCEPTOS DE INMUNOHISTOQUÍMICA

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33 Inmunohistoquímica avanzada 3.1 Introducción En este apartado discutiremos las variables que hay que tener en cuenta para conseguir en la inmunohistoquímica un resultado óptimo además de una tinción inespecífica de fondo mínima o inexistente. La dilución óptima de un anticuerpo se puede definir como aquella solución más diluida o dilución más alta de anticuerpo monoclonal (o antisuero) que otorga al tejido una tinción máxima, con la mínima tinción inespecífica de fondo, en unas determinadas condiciones. La dilución más alta se determina por la cantidad absoluta de un anticuerpo concreto. Con sueros de anticuerpos policlonales, la cantidad de anticuerpo se expresa en mg de antígeno precipitado por ml de suero. Aunque es de interés, esta medida no es de gran utilidad en inmunohistoquímica. Una manera de aumentar la concentración de los antisueros policlonales es aislando la fracción inmunoglobulinica del suero, pero no se consigue grandes beneficios para la inmunohistoquímica. La razón es simple: incrementar el título de anticuerpo, aislando y enriqueciendo la fracción de inmunoglobulinas de un antisuero policlonal, no produce todo el beneficio que se podría esperar, ya que los anticuerpos no específicos y los agregados solubles presentes en el antisuero también resultan enriquecidos en el mismo proceso y son una fuente importante de tinción de fondo inespecífica. La concentración de una solución de un determinado anticuerpo monoclonal, puede ser fácilmente determinada de manera absoluta por espectrofotometría, lo que nos permite hacer un banco de diluciones y testar cual es la que rinde mejores resultados en la inmunohistoquímica. La dilución óptima más alta de un anticuerpo también depende de la afinidad intrínseca del anticuerpo, es decir, para una misma concentración de anticuerpo y un mismo tiempo de incubación, aquel que tenga una afinidad mayor reaccionará antes y dará una señal más intensa que un anticuerpo de más baja afinidad. En términos generales: Para un antisuero policlonal: se recomendaría diluciones 1:100-1: Para un anticuerpo monoclonal obtenido de cultivos celulares: 1:10-1:1.000 Para un anticuerpo monoclonal obtenido de fluído ascítico: se puede diluir hasta 1: Estas diluciones son sólo orientativas, pues seguramente con un buen método de recuperación antigénica y sistemas de detección más sensibles, podrán diluirse mucho más. Una dilución adecuada contribuye en gran medida a una buena calidad en la tinción, si es preparada de manera exacta y consistente. En ocasiones, los proveedores de anticuerpos ofrecen reactivos listos para usarse, o recomienda un intervalo de dilución compatible con otras variables como: método de revelado, tiempo de incubación del anticuerpo, temperatura, etc Si no se dispone de esta información, se 33

34 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología ha de probar un banco de diluciones tanto del anticuerpo primario, como del resto de reactivos implicados en el protocolo. Para ello deberemos fijar primero un tiempo de incubación concreto, con él hacer un banco de diluciones con pequeño volumen y ver cuál se ajusta más. Según el tamaño del tejido a teñir, deberemos dispensar más o menos cantidad para cubrir toda la sección de reactivo, lo habitual es mL No solo es importante tener una buena intensidad de señal, igual de importante es eliminar la tinción inespecífica de fondo para que no nos enmascare la verdadera. Debido a la conformación molecular de los anticuerpos monoclonales y a su pi (punto isoeléctrico), estos anticuerpos son más sensibles a cambios de ph y concentración iónica del buffer diluyente. De hecho, se ha demostrado que todos los anticuerpos monoclonales (a excepción del isotipo IgG3) se pueden diluir más y tiñen más intensamente cuando se diluyen en una solución de ph 6.0, especialmente después de hacer una recuperación antigénica con calor. El isotipo IgG3 reacciona mejor a ph alcalinos, antes y después de la recuperación o desenmascaramiento antigénico. Casi todos los anticuerpos monoclonales tiñen más intensamente en ausencia de NaCl. De los diversos diluyentes de anticuerpos usados, parece ser que el PBS (fosfato buffer salino) es el que más reduce la reactividad del anticuerpo monoclonal, pues neutraliza la carga neta negativa del antígeno del tejido y como consecuencia se disminuyen las uniones electrostáticas entre antígeno y anticuerpo. El hecho de delimitar la relación señal/fondo óptima en función del anticuerpo primario influye de forma diferente según el sistema de visualización utilizado. Así, se ha visto que es más crítico cuando se utilizan de complejos enzima-antienzima (PAP, APAAP), que con métodos basados en el sistema (estrepto)avidinabiotina. Esto está en concordancia con el hecho que, al contrario que con el método PAP, el sistema ABC no puede distinguir entre concentraciones altas o bajas de antígeno en tejido. 3.2 Cómo preparar diluciones Conviene tener bien claro las diferentes expresiones usadas en laboratorio para diluir un reactivo y su diferente significado, para no cometer errores. Por ejemplo: Diluir un buffer cuya solución madre está al 50x hasta la dilución de trabajo (1x) NO es lo mismo que diluirlo al 50%. 1.-Si tengo que diluir un buffer que está al 50x, hasta la solución de trabajo, significa que lo tengo que diluir 50 veces, para que esté a la concentración adecuada de trabajo, que siempre será 1x. Ej: Quiero preparar 250 ml a partir de una solución madre que está hecha al 50x. Divido el volumen total que necesito preparar (250mL) entre la concentración de la solución madre (50x). Así: 250mL / 50 = 5mL. Significa que para preparar mi solución de trabajo usaré 5mL de buffer 50x y 245mL (250mL-5mL) de diluyente (normalmente agua destilada). 34

35 Inmunohistoquímica avanzada 2.-Ahora quiero preparar una solución que esté diluída al 50% a partir de otra. Diluir al 50% significa que del volumen total de la solución que prepare, el 50% debe ser solución madre y el otro 50% diluyente. Volviendo al ejemplo anterior: quiero preparar un volumen final de 250mL a partir de una solución madre: 250mL x 50% (0,5)= 125mL. Significa que para preparar mi solución de trabajo usaré 125mL de solución madre y 125mL (250mL-125mL) de diluyente. 35

36 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología 3.- Ahora quiero preparar una dilución a partir de otra dilución. Es decir tengo un anticuerpo a una dilución 1:100 y como sale la tinción muy fuerte quiero diluirlo a 1:500. 1:100/1:500 = 1/5. Tengo que diluir 1/5 la solución que tengo. Significa que de la dilución que prepare 1 parte será la solución madre (es decir la solución original de 1:100) y 4 partes serán el diluyente. Si quiero preparar 250mL 250mL x 1/5 = 50 ml de solución madre (nuestra dilución 1:100) 250mL x 4/5 = 200 ml de diluyente. (*O lo que es lo mismo 250ml (volumen final) 50 ml de solución madre = 200mL de diluyente). 3.3 Incubación de anticuerpos: Tiempo Y Tª Una dilución errónea del anticuerpo primario llevará a la obtención de resultados erróneos. Si hay un exceso de anticuerpo (la dilución es insuficiente), puede producirse una unión reducida del anticuerpo al antígeno por aglutinación de las inmunoglobulinas, lo que nos daría un falso negativo, como ocurre en el efecto prozona. Si por el contrario, la dilución del anticuerpo es excesiva, también tendremos una unión reducida del anticuerpo al antígeno, pero en este caso será por falta de inmunoglobulinas, no por aglutinación del anticuerpo. Tal y como se ha mencionado anteriormente, el tiempo de incubación, la temperatura y el título del anticuerpo son factores interdependientes, de manera que un cambio en uno de ellos afectará a los demás. Vamos ahora a considerar el tiempo de incubación y la temperatura, ya que son las variables más susceptibles de ser modificadas durante la técnica Tiempo Existe una relación inversa entre el tiempo de incubación de un anticuerpo y la concentración del mismo: cuanto más concentrado está menos tiempo de incubación necesita para obtener unos resultados óptimos. Lo habitual es determinar primero el tiempo de incubación y luego determinar la concentración óptima de trabajo con un banco de diluciones. El tiempo de incubación puede variar desde min hasta casi 24h. Para que un anticuerpo reaccione lo suficientemente fuerte con el antígeno en un período corto de tiempo, 36

37 Inmunohistoquímica avanzada debe tener alta afinidad y alta concentración, así como tener un equilibrio iónico y de ph con el diluyente. Una incubación de 24h permite diluir mucho más el anticuerpo y economizarlo más. Concentraciones altas de anticuerpos específicos (y altas afinidades) permiten acortar los tiempos de incubación. Anticuerpos de baja afinidad o baja concentración deben incubarse por períodos largos de tiempo para llegar a alcanzar el equilibrio (saturación del antígeno por parte del anticuerpo). Una vez conseguida la saturación del antígeno en el tejido, no merece la pena seguir incubando porque no vamos a obtener más señal. Lo habitual es que como mínimo se necesiten 20min de incubación de anticuerpo para llegar a la saturación del antígeno. Es de vital importancia que se los tiempos de incubación del primario sean escrupulosamente respetados. De lo contrario, se generarán variaciones en la calidad y la intensidad de la tinción. Estas variaciones influirán negativamente cuando se quiera relacionar la intensidad de tinción con el grado de desarrollo de un tumor. De ahí se deriva la necesidad de una estandarización de toda la técnica Temperatura Debido a que la saturación de los complejos antígeno-anticuerpo se consigue más rápidamente a 37ºC que a temperatura ambiente, algunos técnicos prefieren incubar el primario a altas temperaturas. Un incremento en la temperatura permite una mayor dilución del anticuerpo o una disminución del tiempo de incubación. De todos modos, se desconoce si el incremento de temperatura facilita de forma selectiva la reacción antígeno-anticuerpo o también incrementa el fondo inespecífico. La temperatura de 4ºC se usa frecuentemente en combinación con incubaciones largas que duran incluso toda una noche. Los portaobjetos incubados a 37ºC durante largo tiempo o en ambientes secos se deben colocar en una cámara húmeda, para evitar la evaporación del reactivo y el secado de las muestras Controles Hay numerosos factores que provocan variaciones en la inmunohistoquímica: el fijador, el tiempo de fijación, variaciones ambientales (temperatura y humedad), la pericia del técnico, las condiciones del reactivo en el momento del uso. La mayoría de los proveedores han implementado medida para salvaguardar la calidad de los reactivos. Es importante incluir reactivos y tejidos control para verificar que la calidad del resultado de la tinción es suficiente para su uso diagnóstico Reactivos control El reactivo más importante de la inmunohistoquímica podría decirse que es el anticuerpo primario. Aparte de las garantías de los proveedores, es importante que el usuario pueda asegurar la calidad del reactivo antes de usarlo. Durante el desarrollo y producción de un anticuerpo, el proveedor comprueba la especificidad utilizando varias técnicas diferentes: Western Blot, Inmunoelectroforesis, doble difusión, ELISA, inmunohistoquímica. Además se evalúa en células transgénicas, si hay reactividad cruzada con otras proteínas parecidas. Lo primero que se hace es probar un banco de diluciones en un tejido que exprese la proteína en 37

38 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología cuestión, así como diferentes protocolos de tinción. Después se prueba un panel de tejidos diversos que pueden o no tener el antígeno. Cuando se produce un lote nuevo, el proveedor realiza un control de calidad para asegurar sensibilidad y especificidad. El usuario debe acostumbrarse a hacer controles rutinarios de la calidad de sus reactivos, anotando todas las condiciones: diluciones, reactivos, diluyentes, tiempos de incubación, si se introdujo cambios en los pasos de protocolo Controles negativos Al igual que en las tinciones especiales, debemos utilizar controles positivos para monitorizar la técnica, así como un control negativo para asegurar que no se han producido reacciones inespecíficas ni contaminación de reactivos. Como control positivo debemos utilizar un tejido en donde previamente sabemos que existe el antígeno a detectar, este tejido lo debemos incubar de forma paralela al caso problema o en la misma preparación si colocamos en control junto al caso a estudiar. Los controles positivos deben de guardarse en nevera para evitar la pérdida de reactividad antigénica. Como la detección del antígeno depende de varios factores (fijación, recuperación antigénica) el mejor control positivo es el control interno, es decir, células o componentes del tejido normal/no patológico, en las que exista el antígeno a estudiar. Para anticuerpos monoclonales, lo más adecuado es usar un anticuerpo del mismo isotipo, a la misma concentración y con el mismo diluyente. Otra opción es usar una mezcla de anticuerpos representando la mayoría de los subtipos de las IgG. La última y menos recomendada es usar sólo el diluyente. Como control negativo, se utiliza el caso problema, el cual en lugar de incubarse con el anticuerpo primario se incuba con suero no inmunizado o tampón de lavado. En caso de producirse tinción en el control negativo, no se debe considerar la técnica como buena ya que indica que han existido reacciones cruzadas o contaminación de reactivos. En ocasiones, un área negativa del tejido sirve de control negativo. Para anticuerpos policlonales, el control negativo debe ser una dilución de fracciones de inmunoglobulinas o suero total y no inmunizado de la misma especie animal. También debe usarse a la misma concentración que el anticuerpo problema y con el mismo diluyente. En los casos donde es necesario evaluar tinción no específica causada por otras fuentes que no sean el anticuerpo primario, se probarán el resto de reactivos sobre secciones adicionales de pacientes que ya se analizaron previamente. Si se sospecha que la tinción inespecífica puede venir de enzimas endógenas del propio tejido, se comprobará aplicando el sustrato sobre el tejido y observando si hace reacción. 38

39 Inmunohistoquímica avanzada Tejidos Control Los tejidos control pueden ser positivos, negativos o internos. Cada uno con un propósito diferente Tejido control positivo Es tejido indicativo de una tinción óptima, nos informa de: si la recuperación antigénica se ha llevado a cabo correctamente, de lo adecuada que es la fijación del tejido, que todos los reactivos y pasos del protocolo (recuperación antigénica, bloqueo, incubación del anticuerpo primario y visualización) han funcionado correctamente bajo unas condiciones de tiempo y temperatura fijadas. Los tejidos control deben ser procesados bajo las mismas condiciones que las muestras quirúrgicas. Para una buena conservación de los antígenos, se recomienda que la fijación y procesado del tejido sea inmediata. Debe incluirse un control positivo por cada tanda de pruebas y lo ideal es que ese tejido control contenga todo el abanico de intensidades del marcador en cuestión. Si no disponemos de este tejido otra opción es escoger un tejido que tenga una señal débil, así nos aseguraremos que incluso a bajas concentraciones estamos detectando el antígeno y que la intensidad es la adecuada. También podemos construir un array de tejidos o líneas celulares con diferentes intensidades de tinción. Si el control positivo no sale con el resultado esperado, toda la tanda hecha en paralelo deberá considerarse inválida. En ocasiones, se construyen arrays con varios tejidos que sirven de control positivo para varios marcadores, de manera que siempre podemos usar el mismo array para controlar diferentes anticuerpos en la misma carrera Control interno del tejido o control intrínseco Son tejidos que en condiciones normales expresan el antígeno en elementos tisulares aparte de la zona a evaluar. Si esta situación se da, no necesitamos añadir un control positivo adicional. Esta situación es la idónea porque control y los elementos tisulares a analizar han sido procesados exactamente bajo las mismas condiciones. Un ejemplo es la expresión de la proteína S100: se expresa en melanoma y en tejido normal (células reticulares dendríticas y nervios periféricos) Tejido control negativo Son tejidos en los que no se debe expresar el antígeno. Una positividad en éstos, indica una falta de especificidad del anticuerpo primario o tinción de fondo inespecífica y debe considerarse inválida la prueba. 39

40 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología Ejemplo: Melanoma maligno positivo para S100. Las células neoplásicas tiñen núcleo y citoplasma difusamente. Ejemplo: Colon normal positivo para S100. Las células nerviosas de Schwann de los nervios periféricos tiñen núcleo y citoplasma intensamente Indicador control de procesamiento Se ha sugerido que se use la vimentina como indicador de un buen procesamiento/fijación del tejido por varias razones: está presente en casi todos los tejidos, el clon V9 de la vimentina reconoce un epítopo que es muy sensible a la fijación con formaldehido así que nos sirve de control de calidad de fijación. Un tinción buena y uniforme indica una adecuada fijación, mientras que una tinción heterogénea indica fijación no óptima. Ganglio positivo para Vimentina 40

41 Inmunohistoquímica avanzada Líneas celulares control Al igual que los tejidos control positivos y negativos, las líneas celulares pueden ser positivas o negativas. La línea positiva comprobará la calidad de la recuperación antigénica, el bloqueo, la incubación del anticuerpo, el revelado, etc La línea celular negativa, debe contener una pequeña cantidad del antígeno. Tal cantidad que en condiciones óptimas no de positividad, pero en condiciones que provocan exceso de tinción si de un resultado positivo. Línea celular tumoral utilizada como control positivo para expresión de Her-2 neu 41

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43 UNIDAD DIDÁCTICA IV ENZIMOLOGÍA

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45 Inmunohistoquímica avanzada 4.1 Introducción La técnica inmunohistoquímica se basa en la utilización de la unión específica entre un antígeno y un anticuerpo, la cual podemos poner de manifiesto mediante una tinción cromogénica. Las primeras técnicas inmunohistoquímicas se realizaron en los años 40, para la detección de antígenos en la cápsula de bacterias, utilizando una sustancia fluorescente (fluoresceína), lo que dió inicio y nombre a las técnicas de inmunofluorescencia. La inmunohistoquímica enzimática surge en los años 60, utilizando como enzima la peroxidasa de rábano picante. Dicha técnica ofrecía ventajas sobre la inmunofluorescencia, ya que se podía realizar en material fijado en formol y en material parafinado. A partir de este momento y dada la importancia que toma esta técnica, se empiezan a mejorar los métodos para simplificarlos y mejorar el resultado (método de peroxidasa antiperoxidasa, método de avidina biotina peroxidasa, streptavidina biotina peroxidasa, dextrano peroxidasa, etc), así como en la metodología de recuperación antigénica. La fórmula general que describe una reacción enzimática se expresa de la siguiente manera: Enzima (E) + Substrato (S) = Complejo ES ES E + Producto (P) El producto de la reacción será un precipitado cuya coloración dependerá del cromógeno elegido. Previo a la formación del producto, se forma un complejo intermedio Sustrato-Enzima, en el sitio activo (el grupo prostético) del enzima. 4.2 Inhibidores específicos Hay sustancias que interfieren específicamente en la unión del sustrato al grupo prostético del enzima y se llaman inhibidores específicos. Difieren de los agentes porque éstos causan una desnaturalización inespecífica del enzima. Básicamente se identifican 2 tipos de inhibidores: competitivos y no competitivos Inhibidores competitivos En la inhibición competitiva ocurre una unión reversible entre el enzima y el inhibidor: Enzima (E) + Inhibidor (I) + Substrato (S) = Complejo EI + S La unión Enzima-Inhibidor se puede revertir con un cambio en la concentración del sustrato o del inhibidor, a menos que la afinidad de la unión IE sea mayor que la de la unión SE. Un claro ejemplo de este tipo de unión es el de la unión del CO o azidas a los metales pesados de los enzimas respiratorios. Esquema de inhibición competitiva 45

46 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología Inhibidores no competitivos En la inhibición no-competitiva, la inhibición depende solo de la concentración del inhibidor y habitualmente no es reversible. Puede o no estar implicado el grupo prostético y se manifiesta porque disminuye la velocidad de reacción del enzima sobre el sustrato. La inhibición no competitiva (o alostérica) es un tipo de inhibición que reduce la tasa máxima de una reacción química (Vmax) sin cambiar la afinidad aparente de unión del catalizador por el sustrato. La inhibición no competitiva normalmente se aplica a enzimas y difiere de la inhibición competitiva en que el inhibidor siempre se une a la enzima por un sitio diferente al centro activo de la enzima (este otro sitio se denomina sitio alostérico). Esto afecta a la tasa de la reacción catalizada por el enzima ya que la presencia del inhibidor produce un cambio en la estructura y la forma de la enzima. Este cambio en la forma implica que la enzima deja de ser capaz de unirse correctamente al sustrato. Ésto reduce la concentración de enzima "activa" resultando en una disminución de la Vmax. En este tipo de inhibición, no hay competición entre en inhibidor y el sustrato, así que incrementar la concentración del sustrato no produce un aumento de la tasa de actividad enzimática. Cabe destacar que aunque la inhibición no competitiva generalmente implica que el inhibidor no se une al sitio activo de la enzima, el inverso no es cierto: la inhibición competitiva puede ser debida a una competición por el sitio activo, o por inhibición competitiva alostérica: E + I + S E I Esquema de inhibición no competitiva La selección del enzima más adecuado para una aplicación inmunohistoquímica concreta depende de: El enzima debe estar disponible en una forma altamente purificada y no ser excesivamente cara. La conjugación o la unión no covalente del enzima al anticuerpo o a la biotina no debe alterar la actividad enzimática. El enzima unida al anticuerpo debe ser estable en solución. La actividad enzimática endógena o propia del tejido debe interferir lo mínimo con la tinción específica del antígeno. Los productos de la reacción deben ser estables y rápidamente detectables. 46

47 Inmunohistoquímica avanzada Los enzimas que mejor cumplen estos requisitos son: la peroxidasa de rábano picante (HRP) y la fosfatasa alcalina intestinal (AP). La eficiencia catalítica de estos enzimas es extremadamente alta. Un mol de enzima puro puede catalizar la transformación de entre y de moles de substrato por minuto Inhibición de las enzimas endógenas La utilización de enzimas para la detección de la unión antígeno anticuerpo, obliga a conocer su inhibición, en el caso de que éstas existan en el tejido, ya que de no inhibirse tendremos falsos positivos o tinción de fondo. Dado que los enzimas más utilizados son la peroxidasa y la fosfatasa alcalina y éstos se encuentran normalmente en los tejidos, deberemos inhibirlas (agua oxigenada para la peroxidasa, levamisol para la fosfatasa). La inhibición debe realizarse siempre antes de la incubación con el anticuerpo conjugado con la enzima detectora Inhibición de las uniones inespecíficas A pesar de que la unión antígeno-anticuerpo es muy específica, la utilización en la técnica de otros anticuerpos (secundarios), obliga a la inhibición de posibles receptores Fc y antígenos que puedan reaccionar inespecíficamente con estos anticuerpos secundarios. Para ello debemos incubar antes de la unión con el anticuerpo primario, con un antisuero no inmunizado del mismo animal del cual proviene el anticuerpo secundario que utilicemos, también pueden usarse otros métodos como la incubación con proteínas lácteas o la utilización de otros antisueros no inmunizados. 4.3 Enzimas más usadas en IHQ Peroxidasa y sus cromógenos La peroxidasa (HRP) es una proteína de 40 kda aislada de la raíz del rábano picante. Presenta un grupo hemo que contiene hierro como lugar activo. Este grupo hemo o hematina forma un complejo ES y la HRP oxida al donante de electrones o sustrato. Esta reacción de oxidación proporciona al energía para continuar con la catálisis del peróxido de hidrógeno (H2O2), lo descompone, resultando como productos agua y Oxígeno. La HRP puede oxidar varios sustratos: polifenoles y nitratos. Al oxidarlos se vuelven insolubles y colorados, propiedad que es usada en inmunohistoquímica. Por eso se llaman cromógenos. Su actividad puede inhibirse con un exceso de sustrato o en ausencia de un donante de electrones. El complejo formado por HRP- H2O2 es inactivo si no hay donante de electrones y en ausencia de un donante de electrones (el cromógeno) es inactivado de manera reversible. El cianuro y la azida son dos potentes inhibidores reversibles de la peroxidasa. La HRP puede unirse a otras proteínas de manera covalente (con glutaraldehído) o no covalente. Dicha reacción de conjugación enzima-anticuerpo se desarrolla en dos pasos, para aumentar el rendimiento de la reacción y que no se conjuguen moléculas de anticuerpo entre sí. Se hace reaccionar los grupos amino de la lisina con el extremo N-terminal de ambas proteínas. El conjugado resultante tendrá un tamaño de kda. 47

48 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología La HRP también se conjuga con Streptavidina usando el mismo protocolo de dos pasos y con glutaraldehído en el segundo. Y se usa así en el protocolo LSAB (Labeled Streptavidin Biotin). La Biotina debe ser transformada a Biotinil-N-hidroxisucciniato ester o biotin hidrazida antes de reaccionar con el enzima. Otra manera de acoplar el enzima HRP al anticuerpo es a través del método descrito por Sternberger. En lugar de usar reactivos bifuncionales (como en la unión covalente), los anticuerpos de clase IgG forman complejos inmunes solubles semicirculares con la HRP: formados por 2 anticuerpos y 3 moléculas de enzima. El peso molecular de este complejo peroxidasa antiperoxidasa (PAP) es de KDa. Varios son los donantes de electrones que cuando se oxidan catalizan el peróxido de hidrógeno dando lugar a productos coloreados y, por eso, son llamados cromógenos Diaminobenzidina (DAB) Da un producto final marrón altamente insoluble en alcohol y en otras soluciones orgánicas. La oxidación de la DAB provoca su polimerización y en presencia de diversas soluciones metálicas, como el tetraóxido de osmio o el sulfato de plata o el cloruro de oro, aumentan la intensidad y la electrodensidad de la tinción. Es el más ampliamente usado. Es un potente carcinogénico así que debe manipularse con extremo cuidado. Revelado con DAB. Células dendríticas de un ganglio marcado con CD Amino-9-Etilcarbazol (AEC) Cuando se oxida forma un producto final de color rosa-rojo, el cual es soluble en alcohol. Esto implica que las preparaciones NO pueden ser inmersas en soluciones alcohólicas (como la Hematoxilina de Harris) ni ser deshidratadas. Además, con la exposición a la luz intensa el AEC es susceptible de más oxidación con lo cual va perdiendo la intensidad de coloración. Deben usarse medios de montaje acuosos. Revelado con AEC. Tejido mamario. Tinción nuclear de receptores de estrógenos revelado con AEC. 48

49 Inmunohistoquímica avanzada Cloro-11-Naftol (CN) El producto final de la oxidación es de color azul. Es soluble en alcohol y disolventes orgánicos, de modo que no se puede deshidratar el tejido ni contrateñir con reactivos alcohólicos ni montar con medios de montaje no acuoso P-Fenilendiamina Dihidrocloruro/Pirocatecol (REACTIVO DE HANKE YATES) Da un producto de oxidación final azul oscuro, insoluble en alcohol y solventes orgánicos. Al igual que la DAB, su oxidación provoca su polimerización y en presencia de diversas soluciones metálicas, como el tetraóxido de osmio o el sulfato de plata o el cloruro de oro, aumentan la intensidad y la electrodensidad de la tinción Fosfatasa alcalina y sus cromógenos La fosfatasa alcalina se extrae del intestino del ternero. Presenta un peso molecular de 100 kda. Mediante la hidrólisis del sustrato (esteres de naftol fosfatos) obtiene grupos fosfato de ésteres orgánicos. La principal ventaja del uso de la fosfatasa alcalina respecto la peroxidasa es la falta de interferencia con la actividad de la peroxidasa endógena, presente en extensiones de sangre y de médula ósea. Determinados tejidos como el hueso, el riñón y el hígado presentan actividad endógena de fosfatasa alcalina que puede ser inhibida añadiendo 1mM levamisol al sustrato, salvo la fosfatasa alcalina intestinal que no se inhibe bien con levamisol. En el revelado con fosfatasa alcalina, el enzima que hidroliza los ésteres de fosfato produce componentes fenólicos. Estos fenoles en presencia de sales cromogénicas produce colorantes azo coloreados. Los principales cofactores de la fosfatasa alcalina son: Mg++, Mn++ y Ca++ No se usaba mucho en inmunohistoquímica hasta que se describió el protocolo de APAAP (fosfatasa alcalina-anitfosfatasa alcalina). Los complejos inmunes solubles formados aquí tienen un peso molecular de 560KDa. Los cromógenos habituales de la fosfatasa alcalina son: Naftol As-Mx Fosfato Se puede usar en su forma acídica o como sal sódica. Los cromógenos Fast Red TR o Fast Blue BB producen un producto final rojo o azul, respectivamente. Ambos son solubles en alcohol y otras soluciones orgánicas, con lo que las preparaciones deben ser montadas en medios acuosos. Para extensiones celulares se prefiere usar el Fast Red TR Nueva Fucsina También da un producto final de color rojo. A diferencia de los anteriores, este producto es insoluble en alcohol y otras soluciones orgánicas, permitiendo que las preparaciones puedan ser deshidratadas y montadas en medio permanente. Además la intensidad de la tinción es mayor que en el caso anterior Rojo permanente Modificación del Fast Red que permite el montaje en medio permanente así como la visualización tanto en microscopía óptica como en microscopio de fluorescencia utilizando los filtros del Texas Red o Rodamina. Muy recomendable para biopsias de piel; permite distinguir fácilmente el cromógeno Rojo Permanente del pigmento de los melanocitos. 49

50 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología Otros cromógenos de la fosfatasa alcalina son: NAFTOL AS-BI FOSFATO, NAFTOL AS-TR FOSFATO, Y 5-BROMO-4 CLORO- 3INDOXIL FOSFATO (BCIP), FAST RED LB, FAST GARNET GBC, NITRO BLUE TETRAZOLIUM (NBT) y IODONITROTETRAZOLIUM VIOLET (INT). 4.4 Preparación de Cromógenos AEC (recomendado para extensiones celulares o lesiones pigmentadas) DAB Disolver 4 mg AEC en 1 ml de N, N dimetilformamida. Añadir 14 ml 0.1 M de acetato, ph 5,2 y 0,15 ml de 3% peróxido de hidrógeno. Mezclar y filtrar si se forman precipitados. Añadir la solución a los tejidos e incubar durante 5-15 minutos a temperatura ambiente. Enjuague con agua destilada. Contratinción y montar con un medio acuoso. Disolver 6 mg DA B en 10 ml de tampón Tris 0,05 M, ph 7,6. Añadir 0,1 ml de peróxido de hidrógeno al 3%. Mezclar y filtrar se forman precipitados. Añadir la solución a los tejidos e incubar durante 3-10 minutos a temperatura ambiente Enjuague con agua destilada. Contratinción y montar con cualquier medio de montaje: acuoso u orgánico FAST RED (recomendado para extensiones celulares) Disolver 2 mg naftol AS-MX fosfato, libre de ácido en 0,2 ml de N, N-dimetilformamida en un tubo de vidrio. Añadir 9,8 ml 0.1 M Tris, ph 8.2. Añadir 0,01mL de levamisol 1M para bloquear la fosfatasa alcalina endógena (conservar a 4ºC en nevera por algunas semanas o a -20ºC si es más tiempo). Inmediatamente antes de la tinción, disolver 10 mg de la sal Fast RedTR en la solución anterior y filtrar. Incubar durante minutos a temperatura ambiente. Enjuague con agua destilada. Contratinción y montar con medio acuoso 50

51 Inmunohistoquímica avanzada NUEVA FUCSINA (recomendado para tejido) Solución A: Mezclar 18mL de 0,2 M de 2-amino-2-metil-1,3-propanodiol con 50 ml de tampón Tris 0,05 M, ph 9.7 y 600 mg de cloruro de sodio. Añadir 28 mg de levamisol. Solución B: disolver 35 mg de fosfato de naftol AS-BI en 0,42 ml de N, N- dimetilformamida. Solución C: Bajo un acampana extractora, mezclar 0,14mL Nueva fucsina 5% (5 g en 100 ml de HCl 2 N) ml de solución de 4% de nitrito de sodio 4% recién preparada (40 mg en 1 ml de agua destilada). Agitar durante 60 segundos. Mezclar las soluciones A y B, a continuación, añadir la solución C. Ajustar el ph a 8.7 con HCI. Mezclar bien y filtrar. Incubar durante minutos a temperatura ambiente. Enjuague con agua destilada. Contratinción y montar con medio de montaje acuoso o no acuoso NUEVA FUCSINA (protocolo alternativo) Solución A: En la campana de humos: mezclar: 0,2mL de 5% Nueva fucsina 5% (en 2 N HCI) + 0.5mL de nitrito de sodio al 4%. Agitar para segundos. Añadir 100mL de tampón Tris 0,05 M, ph 8.7, y 100mL de levamisol 1M para bloquear la fosfatasa alcalina endógena. Solución B: disolver 50 mg de fosfato de naftol AS-BI en 0,6 ml de N, N-dimetilformamida. Mezclar bien solución A y B. Filtrar y aplicar sobre las secciones de tejido. Incubar durante minutos a temperatura ambiente. Enjuague con agua destilada. Contrateñir y montar con medio de montaje acuoso o no acuoso. 51

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53 UNIDAD DIDÁCTICA V ESTANDARIZACIÓN EN EL PROCESO INMUNOHISTOQUÍMICO

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55 Inmunohistoquímica avanzada 5.1 Introducción Consenso para la estandarización: Total Test Desde los inicios de la inmunohistoquímica, se ha hecho patente lo difícil que es la reproductibilidad de la IHQ en secciones de tejido parafinado y fijado con formol. La falta de estandarización es el mayor impedimento para la investigación básica, los análisis clínicos, y el diagnóstico y cuidado del paciente. La falta de consistencia entre laboratorios en el uso del formol para la fijación, particularmente, de las variaciones en la concentración, el ph y el tiempo de exposición, contribuye de manera muy notable a la complejidad en la estandarización de la tinción inmunohistoquímica. La comisión de tinciones biológicas y la FDA ha elaborado un protocolo llamado Total Test donde contempla con rigurosidad todos los factores que hay que controlar en un laboratorio clínico para conseguir una estandarización. PREANALITICO ANALÍTICO POST - ANALÍTICO Selección de pruebas Protocolo de Recuperación Antigénica Revisión de controles Tipo de muestra Selección de Anticuerpo Primario Descripción resultados Adquisión / Prefijación / Transporte Protocolo de revelado Interpretación / Informe AP Fijación: tipo y tiempo Validación de reactivos Patólogo: formación / experiencia Procesamiento del tejido Selección de controles Formación / Certificación personal Certificación calidad laboratorio Un congreso reciente donde participó la FDA y el NIST (National Institute of Standards and Technology) elaboraron un protocolo para la estandarización en los tests de Her2 y además establecieron la necesidad del uso de controles universales. Hay dos factores principales que dificultan una buena estandarización en la rutina del laboratorio de anatomía patológica: La creciente disponibilidad de diversos reactivos para inmunohistoquímica, la enorme variedad de métodos de tinción que proporcionan y por tanto con sus consiguientes métodos de interpretación diferentes. De ahí la necesidad de usar unos controles universales, algo análogo a los controles de calibración de los tests de ELISA 55

56 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología El clásico método de fijación en formalina y conservación en parafina. Muy útil para una buena conservación morfológica del tejido, pero afecta muy negativamente a la antigenicidad de las moléculas del tejido.la enorme variación en protocolos (incluidos los tiempos de fijación) de fijación en parafina entre los distintos laboratorios y, dentro del mismo laboratorio, entre un tipo de pieza quirúrgica u otra, constituyen un problema porque contribuyen a una baja reproducibilidad de los análisis inmunohistoquímicos inter e intralaboratorio. Para afrontar este problema de la alta variabilidad de protocolos y baja reproducibilidad, los proveedores han trabajado en ofrecer diferentes soluciones: mejor fijación, mejora en los métodos de recuperación antigénica, mejora en los reactivos, métodos de detección y revelado más sensibles, desarrollo de controles o referencias estándar. Con todo ésto, lo que se pretende es asegurar una calidad buena y uniforme, con un buen nivel de reproducibilidad y confianza suficiente para permitir comparaciones de resultados entre laboratorios, especialmente en análisis semi-cuantitativos (Her-2, ER, PR). Una falta de estandarización lleva a que el análisis de una biopsia de un mismo paciente tenga resultados diferentes según el laboratorio donde se analice y eso es algo inaceptable. La sustitución de la fijación con formol por otros fijadores es casi inviable, por el amplio uso que tiene en todos los laboratorios. Se pueden abordar otros aspectos como la mejora de la calidad de los reactivos y su uso en condiciones controladas y constantes. Uso de controles estándar (tejidos control), similares a las curvas que se usan en análisis cuantitativos de un laboratorio clínico (ELISA). Para conseguir una máxima standarización todos los laboratorios deberían seguir estrictamente cada uno de los pasos del Total Test: mismas condiciones de fijación (tiempo y reactivos), misma recuperación antigénica, mismos anticuerpos y sistema de visualización, mismos controles 5.2 Reactivos listos para usar También se denominan reactivos prediluídos o kits de Inmunohistoquímica o ready-to-use (RTU). Su gran utilidad se debe a que contribuyen a una buena estandarización, siempre se usan en condiciones y concentraciones controladas. Incluyen reactivos y tejidos control. Todas aquellas áreas agrupadas bajo el epígrafe ANALITICO, son los responsables del resultado final de test inmunohistoquímico. Los reactivos listos para usar no resuelven los problemas antes mencionados (preparación de la biopsia distinta en cada laboratorio, falta de reactivos o controles estándar, validación inadecuada de reactivos, ausencia de curvas standard), pero puede aumentar la reproducibilidad y la consistencia de los resultados interlaboratorio, obligando al usuario a usar controles externos y a una validación externa de reactivos. La mayoría de los protocolos de inmunohistoquímica implican varios pasos, cada uno con su reactivo y todos ellos deben optimizarse juntos para garantizar una buena reproducibilidad. 56

57 Inmunohistoquímica avanzada 5.3 Anticuerpos primarios La gran mayoría de los protocolos actualmente en uso para el diagnóstico patológico implican varios pasos. El anticuerpo primario es el reactivo responsable de otorgar especificidad a la reacción inmunohistoquímica, ya sea en su forma concentrada o prediluida. Es una molécula que de manera natural no está marcada, de modo que su localización en la sección de tejido se detecta indirectamente, mediante la aplicación de reactivos secundarios marcados. Estos reactivos secundarios se han optimizado todos juntos, así se garantiza un control y una reproducibilidad. Se deben seguir las especificaciones del reactivo, aún así es responsabilidad del técnico de laboratorio/investigador usar los controles positivo y negativo apropiados, su optimización a las muestras específicas del centro y comprobar la especificidad y funcionalidad de cada uno de los reactivos del protocolo (fase analítica del Total Test), así como todos y cada uno de los anticuerpos. En general, es más sencillo validar la especificidad de los reactivos listos para usar (o RTU) que los concentrados. La enorme oferta de reactivos disponibles para inmunohistoquímica de los múltiples proveedores, en cierta manera contribuye a una falta de estandarización. Las soluciones de anticuerpos policlonales o el antisuero contienen muchos clones de anticuerpos con diferentes especificidades por los diferentes antígenos, pero se suelen enriquecer los anticuerpos de más afinidad y eliminar selectivamente los de baja afinidad por columnas de absorción). Las soluciones de los anticuerpos monoclonales, preparados a partir de un hibridoma, contienen una sola especie de anticuerpos y una única afinidad y especificidad. La concentración necesaria de un anticuerpo monoclonal puede ser fácilmente medible. Se expresará en términos de mg/ml o mg/l y las diluciones de trabajo sugeridas por el proveedor vendrán dadas por mg/l o fraccionales 1/50-1/200. Sin embargo, en un antisuero policlonal, la concentración sólo puede estimarse por la enorme variedad de moléculas que hay. Y el proveedor suele proporcionar fracciones de dilución óptimas 1/50-1/200. La especificidad del anticuerpo monoclonal o policlonal varía mucho de un proveedor a otro, así como la concentración óptima de trabajo. De modo que la dilución óptima de un mismo anticuerpo será muy distinta de un laboratorio a otro, entendiendo por concentración óptima aquella que proporciona la intensidad/especificidad más alta con la mínima tinción de fondo inespecífica. En el caso de los reactivos RTU o listos para usar (monoclonales o policlonales), son reactivos prediluídos por el proveedor y testados bajo rigurosas condiciones y controles de 57

58 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología calidad, usando un mismo sistema de detección, un protocolo definido y unos controles positivos y negativos (tejido y línea celular). En estos reactivos no se proporciona la dilución de trabajo porque se entiende que ya vienen a la concentración adecuada, no deben diluirse más, ni introducir variaciones en los pasos del protocolo. Cualquier modificación obliga al laboratorio en cuestión a re-testar todos los reactivos del sistema entero, probar diferentes concentraciones de anticuerpo primario con diferentes concentraciones del reactivo marcado o secundario. Si el laboratorio no dispone de un método muy exacto de cuantificación proteica, pequeños errores en diluciones se traducen en grandes cambios en los resultados y una inconsistencia de los mismos. Por todo esto, si el laboratorio en cuestión no cuenta con la metodología adecuada para realizar complejos bancos de diluciones, los reactivos listos para usar proporcionan una alternativa viable, permitiendo conseguir así una consistencia en los resultados todos los días. 5.4 Reactivos secundarios o de marcaje Desarrollo de protocolos estandarizados El siguiente reto consiste en desarrollar sistemas de visualización o de revelado del anticuerpo primario cada vez más sensibles, que sean capaces de detectar una pequeña cantidad de antígeno que ha sobrevivido al procesado del tejido parafinado o bien detectar el antígeno con buena intensidad y especificidad incluso usando los reactivos con mayores diluciones. En términos generales, cuanto más sensible o cuanto más amplifica la señal un método de detección dado, más complicado se vuelve el protocolo y más pasos hay implicados. La optimización de la concentración de los reactivos secundarios depende de la concentración usada en el anticuerpo primario y viceversa. Cada laboratorio debe llevar a cabo un banco de diluciones para todos los reactivos implicados. El uso de los anticuerpos listos para usar, va acompañado de un sistema de detección ya testado que evita todo éste esfuerzo y lo más importante, evita la variación entre laboratorios. Si cualquier reactivo RTU se usa con otra combinación de reactivos, es obligatorio llevar a cabo de nuevo los estudios de optimización. Los reactivos mencionados son los más relevantes, no obstante, no debe olvidarse otros aspectos que también son críticos para conseguir una consistencia de resultados: selección y validación del protocolo de recuperación antigénica, precisión en la cantidad de volumen de reactivo aplicado al portaobjetos, elección del ph de los tampones de dilución, tiempos/temperaturas de incubación, número de ciclos de lavado, concentración y tiempo de exposición del cromógeno 58

59 Inmunohistoquímica avanzada Hay aproximadamente unos 25 pasos en un protocolo clásico de inmunohistoquímica y todos deben ser optimizados y realizados de manera idéntica, carrera tras carrera, día tras día y de laboratorio a laboratorio. En este sentido, el uso de un sistema automatizado puede facilitar enormemente la reproducibilidad dentro de un laboratorio y si le juntamos el uso de reactivo RTU, tiene el beneficio añadido que obliga a una standarización de reactivos, diluciones, sistemas detección, en todos los laboratorios que usan el mismo sistema. Para conseguir el máximo grado de standarización de la IHQ, todos los laboratorios deberían ceñirse a los principios del Total Test con reactivos comunes y protocolos idénticos, o en su defecto adoptar los mismos controles universales de referencia (curvas de calibración), con las que cualquier laboratorio pueda comparar sus resultados de IHQ y validarlos cada día. Aunque esto no se cumpla, si todos los laboratorios adoptan la misma consistencia interna (a pesar de usar reactivos y protocolos distintos), entonces la standarización entre laboratorios mejorará notablemente. Esta consistencia interna se consigue mejor con reactivos RTU que con reactivos concentrados, por la variabilidad inherente en la optimización de los reactivos concentrados entre diferentes laboratorios. Además si todos los laboratorios adoptan los mismos protocolos y reactivos, mejorará el grado de homogeneización de resultados a pesar de la variabilidad inherente e inevitable del procesado de la biopsia. 5.5 Controles En teoría, como mínimo cada carrera de inmunohistoquímica debe incluir un control positivo y un control negativo. En la práctica, el control positivo es una muestra procesada de igual manera que el tejido problema y a la que se le supone expresa la proteína en cuestión. El control positivo debe escogerse no sólo porque expresa la proteína sino también porque la expresa en diferentes cantidades, de esta manera podemos saber si la IHQ es lo suficientemente sutil como para detectar esas diferencias. El control negativo sirve para dos cosas: estar seguros que no se marca ninguna célula que no expresa la molécula en cuestión (reacción cruzada) y además para estar seguros que los reactivos no están contaminados (se omite el paso de incubación con el anticuerpo primario). En la mayoría de los casos se puede ver en la misma sección del tejido porque se identifican células negativas. Los laboratorios en los que utilizan anticuerpos concentrados como anticuerpo primario, lo recomendable es que usen controles positivos y negativos durante todas las pruebas de optimización. En los que se ha optado por los reactivos listos para usar, la optimización es más simple: se probaría sobre un tejido control y si no da un patrón de tinción satisfactorio, puede optar por 59

60 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología reoptimizar el método de recuperación antigénica o el tiempo de incubación del anticuerpo primario. El conjunto anticuerpo primario - sistema de revelado es puesto a punto por el proveedor en una amplia variedad de muestras (normalmente parafinadas) y valida su reproducibilidad en varias carreras y una variedad de tejidos que contienen diferentes cantidades de antígeno. El objetivo de estos tests es comprobar que el anticuerpo prediluído, junto con su sistema de visualización, da un resultado óptimo en las diferentes muestras parafinadas de distintos laboratorios. 5.6 Importancia de los reactivos listos para usar en el resto del TOTAL TEST Test. Los reactivos prediluídos donde tienen su mayor impacto es en la fase analítica del Total Aunque la elección y validación de reactivos son los puntos clave de la fase pre-analítica. Mucho más importante es la total falta de consistencia que hay en los protocolos de fijación y manipulación de las piezas quirúrgicas. El formol es el reactivo más ampliamente usado pero no hay consenso en lo que se refiere a su preparación, tiempo de exposición de la pieza al mismo. Casi siempre el tiempo de prefijación (tiempo de isquemia o post-resección antes de su inmersión en formol) no está muy documentado su duración e impacto en los antígenos el tiempo de incubación en el mismo. De la misma manera, el resto de pasos de: procesamiento, deshidratación, coeficiente de impregnación, almacenado, desparafinación y rehidratación no están adecuadamente documentados, se puede decir que todos los procesos que se agrupan bajo el nombre de preparación de la pieza quirúrgica los que obstaculizan una buena estandarización. Es en este aspecto donde los reactivos prediluídos, si bien no solucionan el problema de raíz, sí que contribuyen a mejorar la homogeneización de resultados y solventar la falta de standarización de los procesos de fijación y procesamiento. En el paso post-analítico, la interpretación de resultados no está muy estandarizada entre los patólogos, sobre todo en valoración semicuantitativa de marcadores. La interpretación de un marcador de IHQ en un tejido debe ir siempre acompañada de la revisión de su control positivo correspondiente. Por último, la cuantificación asistida por imagen o análisis de imagen eventualmente se convertirá en un método esencial para valorar cuantitativamente la IHQ. No obstante, para ello es necesario contar con un método inmunohistoquímico estandarizado, lo que implica control e integración de todos los componentes posibles del Total Test. 60

61 UNIDAD DIDÁCTICA VI DESENMASCARAMIENTO O RECUPERACIÓN ANTIGÉNICA

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63 Inmunohistoquímica avanzada 6.1 Introducción Las primeras tentativas para realizar la recuperación de la inmunoreactividad en secciones de tejido fijadas con formol fue mediante digestión con tripsina previo a la inmunofluorescencia. Después fueron con diferentes soluciones que contenían metales que calentaban en microondas. Más adelante se introdujo la utilización de tampón citrato a ph 6.0 para la inmunotinción del marcador de proliferación Ki-67. Diferentes modificaciones se fueron aplicando y permitieron la exposición de antígenos que hasta entonces habían resultado no-reactivos.para asegurar la preservación de la arquitectura del tejido y la morfología celular es esencial una rápida y adecuada fijación. No existe un fijador universal ideal para la preservación de todos los antígenos. Pese a ello, la fijación del tejido con formol tamponado al 10% y posteriormente, ser embebido en parafina, es aún hoy el método elegido en la mayoría de departamentos de Anatomía Patológica y centros de investigación, por ser el que mejor preserva la morfología celular y el que proporciona los resultados más satisfactorios. A pesar de ésto, pueden existir ciertos antígenos tisulares que no sobrevivan a la rutina de la fijación con formol. Para ellos queda la alternativa de la congelación en fresco con nitrógeno líquido y, el posterior corte con el criostato, ya que en estas condiciones no se requiere la aplicación de la recuperación antigénica. El formol fija no por coagulación sino formando puentes metil cruzados con los aminoácidos básicos de las proteínas, entre ellos, los que forman los epítopos antigénicos. Para la accesibilidad de estos antígenos se hace necesario el pretratamiento de las secciones histológicas, con métodos y soluciones de recuperación antigénica que destruyan dichos puentes. La recuperación antigénica es un proceso reversible y consiste en eliminar los enlaces covalentes que forman los fijadores como el formol. 63

64 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología La reducción de la carga neta negativa de los antígenos reduce la avidez o fuerza de unión del antígeno al anticuerpo, se puede compensar aumentando el tiempo de incubación del anticuerpo primario o usando diluyentes de anticuerpo. El desarrollo de anticuerpos primarios capaces de reaccionar con epítopos resistentes a la fijación ha mejorado esta situación. Sin embargo, la introducción de pretratamientos enzimáticos (en particular los métodos de recuperación antigénica por calor) consigue restaurar la afinidad y avidez de la reacción inmune. Conviene clarificar una serie de términos: HIER: Heat Induced Epitope Retrieval: Demasking Epitopes: Recuperación del epítopo inducida por calor: hace referencia a la zona de la proteína y a su carga electrostática que reacciona con el anticuerpo. HITR: Heat Induced Target Retrieval: Recuperación de la diana celular, inducida por calor: hace referencia a los ácidos nucléicos, al pretratamiento que se hace previo a la hibridación para que la región de ADN esté más accesible a la sonda que luego se unirá. HIAR: Heat Induced Antigen Retrieval: Recuperación de la antigenicidad perdida durante la fijación en formol. En general, usaremos el término HIER (incluyendo recuperación de epítopos y de cargas electrostáticas de las proteínas) porque es el más ampliamente usado en la IHQ. Molécula de antígeno con sus diferentes epítopos 6.2 Métodos Antígeno vs Epítopo Antígeno= Molécula entera Epítopo= región específica El uso de la recuperación antigénica (R.A.) inducida por calor minimiza las variaciones en IHQ debidas a diferentes tiempos de fijación, permitiendo una homogeneización de resultados. Se recomienda también usar tamaños uniformes de bloques de tejido de manera que la fijación sea lo más parecida posible en todas las piezas. Ambos factores contribuyen en gran medida a una buena estandarización en la IHQ. Debido a la gran variedad de métodos de recuperación antigénica que se han desarrollado en los últimos 15 años (por calor, proteolítica ) se hace más complicada la estandarización. 64

65 Inmunohistoquímica avanzada Cuando se hace recuperación antigénica por calor, la adherencia del tejido al portaobjetos debe ser muy superior a cuando se hace sólo la tinción primaria de Hematoxilina-Eosina. Hay diversos protocolos de recuperación antigénica que disponibles en la actualidad y cada uno de ellos presenta variables a considerar: Por calor: Tipo de fuente de calor: baño termostático, olla, autoclave, microondas Tiempo de aplicación del calor ph solución recuperadora de antígeno: se pueden usar diferentes soluciones recuperadoras de antígeno: Ácido hidroclórico (ph 1), Ácido fórmico (ph 2), Tampón citrato (ph 6), Tampón citrato-edta (ph 6.2), EDTA (ph 8), Tris-EDTA (ph 9), TBS (ph 9), Tampón Tris (ph 10). Temperatura Por proteólisis: Las variables que debemos considerar en este tipo de recuperación son el enzima utilizado, por ejemplo: Pepsina Tripsina Proteinasa K Pronasa Neuradaminidasa Ficina Quimotripsina Además debemos tener en cuenta, la concentración del enzima, el tiempo de incubación y la temperatura óptima de actuación del enzima. R.A. Combinada Hoy día los proveedores proporcionan métodos combinados de recuperación antigénica. Podemos combinar varios métodos de recuperación antigénica, por ejemplo, recuperación proteolítica y calor o desparafinar, recuperar e hidratar en un solo paso. Variables de la recuperación antigénica A: Dilución 1:200 - RA con tampón ph 9 B: Dilución 1:50 - RA con tampón ph6 C: Dilución 1:200 - RA con tampón ph6 65

66 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología Por calor: autoclave, olla, baño Solución recuperadora Una vez desparafinadas y rehidratadas, los cortes se introducen en la solución recuperadora de antígeno y son expuestas a la fuente de calor. Este paso es muy crítico, ya que la recuperación de la inmunoreactividad está directamente relacionada con el tiempo de incubación y con la temperatura alcanzada. Son pues diversos los factores que intervienen en este método y que será necesario seleccionar y ajustar en función de las necesidades y posibilidades de cada laboratorio. Las fuentes de calor más utilizadas son baño de vapor, autoclave y baño termostático. Las características del anticuerpo primario (clon, dilución, sensibilidad, expresión antigénica, tipo de marcaje) y también del sistema de visualización serán las que condicionarán el uso de una solución de recuperación antigénica u otra para obtener los resultados más óptimos. Aunque los buffer ph 6 son los más ampliamente usados, los de ph alto (8-9), también dan muy buenos resultados. Es responsabilidad del técnico de laboratorio saber optimizar para cada anticuerpo cuál da mejores resultados inmunohistoquímicos y usar ese buffer siempre La temperatura Aunque la temperatura óptima para la recuperación antigénica no ha sido exactamente establecida, la mayoría de los métodos aplican temperaturas próximas al punto de ebullición del agua. En lugares de altitudes elevadas (por encima de los 1200 metros), donde la ebullición del agua puede tener lugar antes de alcanzarse la temperatura recomendada, se puede usar un sistema de presión cerrado, como un autoclave o una olla a presión y así asegurarse alcanzar mínimo los 95ºC El tiempo Un factor que condiciona el tiempo de aplicación de calor es la duración de la fijación. Cuanto más largo haya sido el tiempo de fijación de las biopsias, más tiempo de aplicación de calor se necesitará para recuperar los antígenos. Además, la duración de la incubación de las muestras dentro de la solución recuperadora dependerá del tipo de fuente de calor utilizado. En el caso de utilizarse un baño termostático, el tiempo medio para la mayoría de antígenos y para una fijación estándar (6-18 horas) suele ser de unos 20 minutos a 95-99ºC. El microondas requiere de dos o más ciclos de 5-10 minutos cada uno. La olla a presión es el método más rápido, ya que con 1-3 minutos es suficiente (intervalo válido 30seg-5min). Se alcanzan presiones máximas de 103 kpa/15psi y temperaturas de 120ºC. Se recomienda usar ollas a presión de acero inoxidable ya que las soluciones de recuperación pueden llegar a corroer el aluminio. Se esperan 20min antes de abrir la olla. Por último, se atemperan los portaobjetos en buffer TBS. Si se usa un autoclave, se configurará la presión igual que en la olla a presión, 15psi, ésto nos permitirá alcanzar una temperatura de 120ºC, durante 10-20min. Al acabar el proceso, se atemperan los portas en buffer TBS. No hay que olvidar que, en todos los casos, hay que añadirle el tiempo de enfriamiento que será de mínimo 20 minutos. Es muy importante respetar este tiempo para evitar la 66

67 Inmunohistoquímica avanzada manipulación de las secciones muy calientes y el posible secado de las mismas, que pprovocaría tinciones heterogéneas de las muestras. Además un cambio brusco de temperatura podría alterar la morfología tisular. También es importante tener en cuenta el tipo de muestra que se está procesando. Como regla general: (siempre hay excepciones) las citologías fijadas en alcohol o acetona no necesitan procesos de recuperación tan agresivos como los tejidos fijados en formol. Por ello lo habitual, es reducir el tiempo y la temperatura de la solución recuperación antigénica (65ºC, 10min) o incluso ni hacer recuperación antigénica (tejidos congelados) Por proteolisis Variables: Concentración, temperatura y tiempo de incubación La digestión con tripsina previa a la tinción inmunofluorescente fue el primer método de recuperación de los antígenos tisulares fijados con formol que se utilizó. Los protocolos de pretratamiento proteolítico varían según las condiciones específicas de fijación en formol de cada laboratorio. Las condiciones a tener en cuenta para este tratamiento proteolítico son: tiempo, concentración del enzima, temperatura de incubación. Algunos ejemplos de antígenos que requieren recuperación proteolítica son las citoqueratinas y las inmunoglobulinas. En algunos libros, se cita la aplicación de diferentes enzimas proteolíticos que incluyen: Tripsina, Pepsina (10-15min), Pronasa, Proteasa, Proteinasa K (6-15min), Neuraminidasa, Quimotripsina... El uso de enzima puede comportar la destrucción de algunos epítopos (en especial los de membrana) y de la morfología del tejido. Es por ello que, la concentración óptima de enzima, así como el tiempo y la temperaturade incubación, serán factores clave para la optimización de los resultados. La concentración del enzima suele estar entre el %, mientras que el tiempo de incubación suele fluctuar entre los 5-30 minutos, siendo 5-10 minutos el tiempo más habitual para la Proteinasa K (enzima más utilizado). Para parar la reacción, basta con lavar el portaobjetos con agua destilada, TBS o Tris-EDTA. La temperatura de incubación puede ser, o bien a temperatura ambiente, como es en el caso de la Proteinasa K, o bien a 37ºC como se suele aplicar para la tripsina. Para determinados antígenos de membrana como el CD31, el Factor Von Willebrand o diversas integrinas, la aplicación de Proteinasa K, combinado con el tratamiento con calor, es el método más efectivo R.A.Combinada En ocasiones, la combinación de calor y, posteriormente, enzima proteolítico es una buena alternativa al desenmascaramiento antigénico cuando otros métodos no funcionan. Esta combinación es especialmente útil cuando se desea un marcaje doble o triple de dos o tres antígenos que colocalizan.además, hay que añadir los cambios fisiológicos y patológicos que se pueden dar en la composición del tejido, así como, las particularidades conformacionales de los diferentes epítopos de un antígeno y de su composición en aminoácidos. 67

68 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología Todo ésto contribuye a que, si bien se pueden dar unas recomendaciones generalizadas en cuanto a los protocolos recuperación antigénica, será cada laboratorio el que deberá ajustar el protocolo final que le permita conseguir una óptima tinción inmunohistoquímica. 68

69 UNIDAD DIDÁCTICA VII MÉTODOS DE VISUALIZACIÓN

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71 Inmunohistoquímica avanzada 7.1 Introducción La inmunohistoquímica surgió como herramienta de los investigadores que proporcionaba información adicional al estudio morfológico que realizaba el patólogo. Consiste en la identificación de antígenos proteicos sobre cortes de tejido mediante la aplicación de anticuerpos que, para poder ser visualizados, deben ir marcados con una molécula fluorescente, enzima, elemento radiactivo u oro coloidal. Se entiende por tinción óptima aquella que obtiene la máxima intensidad de tinción, con el mayor número de células marcadas específicamente y sin tinción de fondo. La obtención de unos resultados óptimos en inmunohistoquímica depende en gran medida del uso que se haga de los anticuerpos. Así, es de vital importancia tener en cuenta el título del anticuerpo, la dilución óptima de trabajo, así como el tiempo y la temperatura de incubación. Estos factores pueden variarse de manera independiente o complementaria, para lograr una tinción específica óptima y reducir al mínimo la tinción inespecífica (fondo). Ahora, los marcadores celulares que detectamos con la IHQ, proporcionan información muy válida sobre la biología y el estado de la enfermedad, además de información sobre el pronóstico de la misma. La utilización de anticuerpos para el estudio de la patología tisular ha necesitado de un gran trabajo de adaptación y mejora continua de los protocolos de inmunohistoquímica, especialmente cuando se usan especímenes fijados en formol. Al contrario de los inmunoensayos que se hacen sobre soluciones en los que está la proteína nativa y en una concentración abundante, en las muestras fijadas la preservación de la zona antigénica de la proteína es variable e impredecible. De modo, que históricamente los procesos de inmunohistoquímica siempre han estado en constante cambio y evolución para mejorar la sensibilidad de detección de antígenos en muy baja concentración o en un estado de conservación no óptimo. 7.2 Inmunohistoquímica: Principios La preservación de la morfología tisular en muestras incluidas en formol-parafina es tan buena, que este método se ha convertido en el método preferido por investigadores y clínicos. En 1968, los anticuerpos acoplados a una molécula de peroxidasa, fueron los primeros que se usaron en tejidos fijados con formol-parafina. Sus resultados superaron las limitaciones que había con los anticuerpos marcados con fluorescencia. La idea de acoplar los anticuerpos a un enzima en lugar de un fluoróforo fue el inicio de la inmunohistoquímica moderna, tal y como la conocemos hoy. Después del método de la inmunoperoxidasa le siguió el método del complejo Peroxidasaantiperoxidasa. 71

72 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología Método indirecto Peroxidasa-Antiperoxidasa (PAP) A: Anticuerpo primario B: Complejo Peroxidasa-Antiperoxidasa C: Anticuerpo secundario D: Antígeno tisular Básicamente podemos hablar de dos métodos de revelado o visualización: Inmunohistoquímica Directa: el propio anticuerpo va marcado/acoplado con un enzima que hacemos reaccionar con un sustrato y así visualizar la posición del anticuerpo. Inmunohistoquímica Indirecta: requiere de varios pasos intermedios antes de hacer reaccionar el enzima con el sustrato. Para la detección de la unión antígeno-anticuerpo podemos utilizar varios métodos (PAP, Avidina biotina, moleculas de dextrano) así como distintas enzimas (peroxidasa y fosfatasa alcalina, principalmente). La utilización de unas u otras dependerá del antígeno a estudiar, el tejido y de la técnica que se quiera aplicar. Como ya comentamos en capítulos anteriores, los cromógenos que se utilizarán para la visualización del resultado dependerán de la enzima utilizada: Peroxidasa: DAB=Tetrahidrocloruro 3-3 diaminobencidina, AEC= 3-amino 9 etilcarbazol. Fosfatasa alcalina: 4 cloruro 1 naftol. 7.3 Tipos: IHQ directa e IHQ indirecta Método Directo El método directo es el procedimiento más sencillo y también el más antiguo. El anticuerpo primario se encuentra conjugado directamente con la molécula fluorescente, o bien con el enzima y, se aplica en un solo paso a la sección de tejido. Posteriormente puede ser necesario aplicar la sustancia cromogénica, si el anticuerpo está conjugado con un enzima. La técnica es muy rápida pero poco sensible porque no existe una amplificación de señal, aunque sea mínima, como la que se puede conseguir con los métodos indirectos actuales. Inmunohistoquímica Directa 72

73 Inmunohistoquímica avanzada Métodos Indirectos Los métodos indirectos se basan en la aplicación de un anticuerpo primario sobre el tejido que es reconocido por un segundo anticuerpo unido a un marcador y dirigido contra la especie del primer anticuerpo. Es un método más versátil que el método directo, ya que permite disponer de una gran variedad de anticuerpos primarios que pueden usarse con el mismo anticuerpo secundario. También es un método más sensible que el anterior debido a la amplificación de señal que se produce en cada uno de los pasos de unión antígeno-anticuerpo. Ejemplos: Sistema ABC/LSAB Sistema Polímero de Dextrano Sistema CSA Complejo PAP Inmunohistoquímica Indirecta Sistema ABC: Avidina-Biotina La avidina es una glucoproteína tetramérica de alto peso molecular presente en la clara de huevo, que presenta en su superficie regiones hidrofóbicas a las que se une con gran afinidad la vitamina Biotina (en una proporción de 1:4). La Biotina es una proteína de bajo peso molecular perteneciente al complejo B de la vitamina H, que se encuentra en la yema de huevo. Tiene la particularidad de conjugarse fácilmente con anticuerpos y enzimas. Se considera que pueden unirse hasta 150 moléculas de biotina a una sola molécula de anticuerpo. 73

74 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología La estreptavidina, derivada de la bacteria Streptomices avidinii es un substituto de la Avidina. Sus características moleculares favorecen la disminución de la tinción de fondo que puede aparecer con el uso de la avidina. El sistema ABC (avidina-biotina) o LSAB (estreptoavidina-biotina) están considerados como el standard de la inmunohistoquímica, constituían uno de los métodos más utilizados. Estos sistemas implican la formación de 3 capas: la primera incluye el anticuerpo primario sin marcar. La segunda, el anticuerpo secundario biotinilado. Y la tercera es un complejo de avidina o estreptoavidina que lleva unido el enzima (peroxidasa (HRP) o fosfatasa alcalina (AP)). La reacción finalmente se visualizará adicionando un cromógeno. En el caso del método ABC, el anticuerpo secundario están acoplados a biotina; y sirve de puente entre el anticuerpo primario unido a tejido y el complejo avidina-biotina-peroxidasa. Complejo Avidina Biotina (ABC) A: Anticuerpo secundario biotiniado B: Anticuerpo primario C: Complejo Avidina-Biotina (*preparar 30min antes de usar) D: Antígeno tisular Sistema LSAB Por otra parte, en el método LSAB (labeled streptavidin-biotin) se utiliza un anticuerpo secundario biotinilado que se acopla a un complejo streptavidina-peroxidasa. En ambos casos un único anticuerpo primario se asocia a varias moléculas de peroxidasa, de esta manera hay un considerable aumento en sensibilidad comparado con el método directo 1anticuerpo-1molécula de enzima. La avidina es una glicoproteína con un punto isoeléctrico de 10, tiene tendencia de a unirse a componentes del tejido cargados negativamente (ej.lectinas) a ph fisiológico. Al contrario que la avidina, la streptavidina tiene un punto isoeléctrico más neutro y carece de dominios carbohidrato. Estas diferencias hacen que tenga una unión más específica al tejido. 74

75 Inmunohistoquímica avanzada Complejo Streptavidina-Biotina (LSAB) A: Anticuerpo secundario biotiniado Ratón/Conejo B: Anticuerpo primario C: Complejo Streptavidina-enzima D: Antígeno tisular Sistema CSA (Amplificación con Tiramida) Es un sistema basado en la estreptoavidina/biotina que incorpora una amplificación de señal mediante tiramida-biotinilada. Se basa en la capacidad de algunos compuestos fenólicos de oxidarse dando lugar a intermedios reactivos inestables (ocurre una dimerización de compuestos aromáticos). La energía de esta reacción se aprovecha en inmunohistoquímica para generar metabolitos intermedios de Biotinil - Tiramida altamente reactivos, los cuáles se unirán a proteínas próximas a moléculas de peroxidasa. El resultado es el depósito de un montón de señales de biotina. En el protocolo clásico de IHQ, las moléculas de peroxidasa se asocian a anticuerpos primarios, vía LSAB o ABC. La biotinil tiramida y el H2O2 se aplican como sustratos para generar numerosas señales de biotina (Biotinil-tiramida). Estas moléculas de biotina se pueden usar para capturar moléculas de Streptavidina-Peroxidasa, que se convierten en una señal cromogénica, vía DAB u otro cromógeno similar. Es un sistema altamente sensible apto para anticuerpos mono y policlonales. El protocolo se basa en: Aplicación del anticuerpo primario. Aplicación del anticuerpo secundario biotinilado. Aplicación de la estreptoavidina biotinilada unida a la peroxidasa. Aplicación de la tiramida biotinilada. Aplicación de estreptoavidina conjugada con peroxidasa. Se consigue de esta manera una amplificación de señal muy elevada basada en la deposición catalizada de la tiramida, un componente fenólico que se encuentra biotinilado, al cual se unirá la estreptoavidina conjugada con la peroxidasa. Está especialmente indicado para el estudio de antígenos de muy baja expresión celular, anticuerpos de investigación o anticuerpos de muy baja afinidad, o para el uso de anticuerpos a diluciones muy elevadas. 75

76 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología Sistemas basados en la aplicación de polímeros de dextrano libres de biotina Aunque el sistema avidina-biotina se usa mucho, tiene también ciertas limitaciones: la presencia de biotina endógena en el tejido puede dar lugar a cierta tinción inespecífica de fondo. La fijación en parafina reduce mucho la expresión de biotina endógena, no obstante, siempre se observa algo de actividad residual en los tejidos (hígado y riñón). Además con el extendido uso de HIER, parece que se recupera la actividad de la biotina endógena. Se podría añadir un paso para bloquear la biotina endógena, pero añadiría un grado más de complejidad a un protocolo ya de por si complejo. Por otro lado, el uso de este método en tejido congelado, tiene el riesgo de que en este tipo de muestras hay incluso mayor actividad de biotina endógena. Debido a todo ésto, los métodos de revelado basado en anticuerpos primarios que no incorporan biotina han ganado popularidad. Estos métodos utilizan un polímero al cual se le conjugan varias moléculas de anticuerpo secundario más enzimas. Ej: en el método EPOS (Enhanced Polymer One Step), se conjugan 70 moléculas de enzima y 10 anticuerpos a una cadena polimérica. Así pues, el protocolo es simple: Aplicación del anticuerpo primario. Aplicación del polímero marcado con el enzima. Aplicación del cromógeno. Esto permite intensificar la señal, reducir la complejidad de todo el proceso porque se reducen pasos y reducir el efecto de las biotinas endógenas. La única limitación es que los anticuerpos secundarios acoplados al esqueleto deben ser compatibles con el anticuerpo primario que se quiera usar. El otro método consiste en acoplar anticuerpos secundarios al polímero de dextrano anti- Ig de ratón o anti-ig de conejo. Este sistema permitiría sería mucho más útil porque permitiría detectar cualquier anticuerpo unido al tejido que se hubiese originado en ratón o en conejo. La sensibilidad de este método comparada con los métodos LSAB y ABC es bastante superior e incluso deja menos fondo. El único inconveniente es que al tener un tamaño molecular grande, la accesibilidad a algunos epítopos es limitada. Existen dos ventajas añadidas como son la reducción en el número de pasos de incubación respecto a los protocolos más convencionales, la posibilidad de usar diluciones más altas de los anticuerpos primarios debido a la mayor sensibilidad del sistema de detección y la eliminación de la interferencia con la biotina endógena. 76

77 Inmunohistoquímica avanzada Sistema de revelado basado en polímero de dextrano A: Enzimas (AP o HRP) B: Polímero de dextrano C: Anticuerpo secundario D: Anticuerpo primario E: Antígeno tisular Sistema de amplificación con Fluorescein-Tiramida (FT-CSA) En esta modalidad de amplificación de señal, la peroxidasa se asocia a un anticuerpo secundario de ratón. La peroxidasa cataliza la conversión y depósito de la Fluorescein-Tiramida en el tejido. A continuación se puede ver el resultado en un microscopio de fluorescencia. También se puede hacer una conversión de la señal fluorescente a cromogénica: se añadiría un anticuerpo antifluoresceína acoplado a una molécula de peroxidasa. El revelado se haría con DAB. En relación con los procesos habituales de IHQ, la amplificación con Tiramida se consigue un aumento de intensidad señal de hasta 50 veces o más. Al igual que cualquier otra técnica, a medida que aumenta la señal también aumenta algo la tinción inespecífica de fondo. De modo que se hace necesario el uso de controles Sistema de amplificación en círculo (RCA) Es un sistema de amplificación de señal que genera la señal mediante extensión y amplificación de una cola de oligonucleotidos. Aunque inicialmente se diseñó para la detección de ácidos nucléicos, también se puede aplicar a la IHQ. Este método se ha utilizado para detección de antígenos ce la membrana celular y moléculas intracelulares. Utiliza una cola corta de nucelotidos acoplada a un anticuerpo primario o secundario. Tras unirse el anticuerpo al tejido, se hibrida una sonda circular complementaria al nucelotido. Esta sonda actuará como cebador de una DNA polimerasa que lo prolongará. Posteriormente ese oligonucelotido prolongado es hibridado con sondas marcadas con biotina. Y una vez más, se puede revelar con Avidina-biotina. El incremento de sensibilidad se debe a la síntesis de ácidos nucleicos, se consigue hasta un aumento de 105 veces. 77

78 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología 7.4 Inmunofluorescencia La inmunofluorescencia es una técnica de uso común en el laboratorio. Fue usada por primera vez en laboratorio por Coons y Kaplan y después por Mary Osborne para investigación y diagnóstico clínico. Dentro de sus aplicaciones en laboratorio se incluyen: evaluación de células en suspensión, cultivos celulares, tejidos, microarrays para detección de proteínas. Se puede usar en tejidos frescos y fijados. Los anticuerpos se conjugan a un colorante fluorescente, tal como isotiocianato (FITC) o tetrametil rodamina isotiocianato (TRITC). Estos anticuerpos marcados se unen directa o indirectamente al antígeno de interés y eso permite su detección por inmunofluorescencia, la cual se puede cuantificar por citometría de flujo, microscopía confocal o un sistema automatizado de imagen. La inmunofluorescencia permite el uso de un número variable de anticuerpos primarios marcados con fluorocromos distintos. Tantos fluorocromos diferentes como filtros discriminantes se tengan en el microscopio de fluorescencia. Un fluoróforo es el componente que hace que una molécula (fluorocromo) emita fluorescencia. La principal característica de los fluoróforos es su capacidad de absorber un color determinado de la luz (una longitud de onda determinada. Espectro de absorción) y emitir un color diferente (otra longitud de onda diferente. Espectro de emisión). Los fluorocromos que se usan más frecuentemente son: DAPI (azul), Texas Red (rojo), FITC (verde), Cy3 (rojo), Cy4 y Rhodamina (naranja). La inmunofluorescencia puede ser también directa o indirecta. La ventaja de la IF directa es que los tiempos de incubación son cortos y los protocolos de tinción doble o triple más sencillos. Inconvenientes: la señal es menor, más caro, protocolo menos flexible. En la IF indirecta las ventajas son: Mayor sensibilidad que la IF directa puesto que más de un anticuerpo secundario puede unirse a un primario. Los anticuerpos secundarios son relativamente más baratos, suelen ir acoplados a una gran variedad de fluorocromos de diversos colores y tienen una buena calidad. Inconvenientes: posibilidad de reacción cruzada, cuando se hacen tinciones múltiples, los anticuerpos primarios usados no pueden tener el mismo origen (ratón, conejo, cabra ); los tejidos con Ig endógena quizás puedan tener bastante fondo. 78

79 Inmunohistoquímica avanzada Principales fluorocromos usados en Inmunofluorescencia para Anatomía Patológica A: Anticuerpo secundario biotiniado Ratón/Conejo B: Anticuerpo primario C: Complejo Streptavidina-enzima D: Antígeno tisular Principios de fluorescencia La fluoroscencia y fosforescencia son dos tipos de luminescencia. Cuando las moléculas con propiedades luminescentes absorben la luz, emiten luz a diferente longitud de onda. Hay que distinguir entre la fluorescencia y la fosforescencia: Fluorescencia: la emisión de luz es inmediata y rápida, justo después de la absorción de luz. Fosforescencia: la emisión continúa unos milisegundos-minutos después de que ha cesado la fuente de energía de excitación. Los materiales son fluorescentes por su estructura atómica. Los electrones se distribuyen en unas zonas de probabilidad entorno al núcleo, organizados según su energía. Cuando un electrón absorbe energía de un fotón de luz, el electrón se excita y pasa a otra zona de mayor energía y menos estable. Este estado de excitación no dura mucho (generalmente menos de 10 segundos). Al cabo de ese tiempo el electrón pierde energía, algo en forma de calor y el resto de energía en forma de fotón de energía. 79

80 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología Esquema IF Directa e Indirecta A: Anticuerpo primario B: IF DIRECTA C: Fluorocromo D: IF INDIRECTA E: Anticuerpo secundario Células endoteliales de la arteria pulmonar. En rojo, la tubulina; en verde, la actina y en azul el ADN. La fluorescencia emitida tiene menos energía que la absorbida, de modo que la longitud de onda de la luz emitida es más larga que la de la luz absorbida, se produce un desplazamiento del espectro de excitación hacia otro de mayor longitud de onda que es el espectro de emisión, a este fenómeno se le llama Desplazamiento de Strokes. Todos los fluoróforos tienen un valor máximo de excitación y de emisión. Eso significa que cuando les incide la luz con una determinada longitud de onda, cuanto más próxima esté a su pico de excitación más fluorescencia emitirá. De la misma manera tienen unos valores de emisión de luz. Algunos fluorocromos tienen desplazamiento de Stokes cortos mientras que otros son más grandes. Ésto implica que, por ejemplo el FITC, tiene un desplazamiento corto (20nm), pues su espectro de excitación y de emisión es de casi la misma longitud de onda (absorbe el mismo color que emite). Sin embargo, la Ficoeritrina, tiene un desplazamiento de Stokes de 100nm, de modo que cuando absorbe una longitud de onda del verde-azul, emitirá a una longitud de onda de amarillo-naranja. Una misma longitud de onda puede servir para excitar fluorocromos de diferente desplazamiento por lo tanto emitirán una variedad de colores fluorescentes. Teniendo conocimiento de los espectros de emisión y excitación de todos los fluorocromos, nos permitirá trabajar simultáneamente con varios. 80

81 Inmunohistoquímica avanzada Principio de la IF. Espectro de emisión y excitación de fluoresceina Los fluorocromos pueden unirse a anticuerpos, los cuáles se acoplarán luego a estructuras químicas específicas dentro de las células. Hay otra serie de propiedades físicas y químicas de los fluorocromos que determinan cuando y donde se puede usr un determinado fluorocromo, según el análisis biológico que se quiera llevar a cabo. Un ejemplo sería el fluorocromo Hoechst 33342, puede unirse a célula vivas, pero la mayoría de los fluorocromos que se únen al DNA no pueden atravesar la membrana celular. Aquellos fluorocromos que no puede atravesar la membrana celular intacta, se usarán para distinguir células vivas de las células muertas (Ioduro de Propidio). El fluorocromo ideal debería tener estar características: Alta intensidad de fluorescencia: Pico de absorción con una longitud de onda disponible en el instrumento de detección Espectro de emisión estrecho que caiga dentro de la banda de detección del instrumento. Buena fosfoestabilidad: Propiedades fluorescentes que no se vean alteradas al acoplarlo al anticuerpo o por el ambiente de la muestra Limitaciones de la Inmunofluorecencia Fotobleaching El FITC es un fluoróforo que puede unirse a otra molécula no fluorescente y crear una nueva molécula fluorescente. En ocasiones lo que ocurre es una reducción de la intensidad de fluorescencia debido a un efecto denominado Fotobleaching o quenching. El fotobleaching consiste en una degradación irreversible del fluorocromo excitado debido a su interacción con oxígeno. La iluminación de fluorocromos con la longitud de onda adecuada da lugar una intensidad máxima de señal y a una menor degradación del fluorocromo. Este efecto de fotobleaching se puede disminuir utilizando la iluminación más baja posible dentro del intervalo de excitación adecuado de ese fluorocromo, añadiendo reactivos que reduzcan la disponibilidad de O2 y por último reduciendo la concentración del fluorocromo que tengan una alta eficiencia o intensidad de emisión. 81

82 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología Fenómeno de Fotobleaching Autofluorescencia Las células de mamíferos presentan autofluorescencia debido a metabolitos como coenzimas de la flavina (FAD y FMN) nucleótidos reducidos de la piridina (NADH). Esto puede ser un problema para la detección de sondas marcadas con fluorescencia en el tejido o en células en suspensión. La fijación con aldehídos (en concreto glutaraldehído) puede dar lugar a altos niveles de autofluorescencia. Esto se puede minimizarse lavando los cortes con 0,1% de borohidrato de sodio en PBS previo a la incubación del anticuerpo. También se pueden minimizar los efectos de la autofluorescencia mediante la selección de sondas y filtros que maximizan la señal de fluorescencia frente a la autofluorescencia. Autofluorescencia de NADH en un cultivo celular de carcinoma de colon Solapamiento de fluorescencia Un inconveniente que hay que solventar cuando se trabajan con varios colores a la vez es la posibilidad de que las señales que emiten los diversos fluorocromos se solapen, dando lugar a un nivel de fluorescencia más alto de lo que es en realidad; esto ocurre por ejemplo cuando se usan simultáneamente, FITC y PE. Para ello se usa un canal de detección para cada fluorocromo con un ancho de banda concreto. Debe ser lo suficientemente selectivo como para permitir alcanzar al detector sólo el rango de longitud de onda de un fluorocromo concreto. Siempre se cuela un poco de señal de otro fluorocromo que tenga un espectro de emisión parecido, pero debe configurarse el detector para que elimine esa señal. 82

83 Inmunohistoquímica avanzada Solapamiento de espectros de emisión de la Ficoeritrina (PE) y el FITC Aplicaciones de la Inmunofluorescencia en Anatomía Patológica Análisis de tejido congelado, frescos o fijados. Localización subcelular de antígenos en cultivos celulares monocapa. Observación de bacterias o microrganismos en muestras. Detección y localización de la presencia o ausencia de secuencias específicas de ADN en cromosomas. Identificación de patrones de expresión de genes en cultivos celulares/tejidos. El método más usado en anatomía patológica es la Inmunofluorescencia Indirecta. Sin embargo, en algún tipo de patología dérmica (i.e. lupus eritematoso) se hace uso de la IF directa para la detección de inmunocomplejos 83

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85 UNIDAD DIDÁCTICA VIII TINCIONES MÚLTIPLES

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87 Inmunohistoquímica avanzada 8.1 Introducción La inmunohistoquímica se ha convertido en una herramienta de diagnóstico e investigación. En ocasiones se necesita saber la localización exacta de varias proteínas en el tejido, en el mismo portaobjetos. Podríamos definir la tinción múltiple como la detección de dos o más proteinas en un mismo porta. De esta manera la información obtenida de un mismo porta es mucho mayor (permite un conocimiento topográfico de las proteínas en cuestión y su implicación en la patología) y además se reduce el tiempo de análisis de la muestra en comparación con la tinción individual. Permite distinguir, por ejemplo, si esas proteínas en concreto están en células diferentes, o en la misma célula pero diferentes compartimentos, etc Aparte se puede combinar hibridación in situ (ISH) e IHQ, obteniendo así información tanto de la expresión de la proteína como de mrna o DNA. Otra ventaja añadida es que se tiende cada vez más a utilizar técnicas menos invasivas, de manera que al disponer de menor cantidad de muestra, la tinción múltiple nos permite ahorrar reactivos y tiempo. 8.2 Ejemplos de tinción múltiple El clásico ejemplo es la tinción empleada para el diagnóstico del PIN: neoplasia intraepitelial prostática. La biopsia con agua fina es el método más usado para la toma de biopsias de este tipo de patologías, pero el problema se plantea porque morfológicamente quizás sólo aparecen unas pocas glándulas malignas o hay varias benignas que simulan un cáncer. Las células basales de las glándulas están presentes en las lesiones benignas pero desaparecen en las malignas. Se pueden usar estas células para distinguir entre un fenotipo otro. p63. Para ello teñimos las células basales con Citoqueratina de alto peso, Citoqueratina 5/6 ó Por otro lado, el marcador p504s o Racemasa se expresa mucho en un alto porcentaje de carcinomas prostáticos, pero es negativo o se expresa muy poco en el tejido sano. Tinción doble simultánea de un carcinoma de próstata.anticuerpo policlonal anti-racemasa (P504S, en rojo) y anti- CK 5/6 + CK34B12 (marrón) 87

88 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología Si se hace una tinción individual en cortes seriados corremos el riesgo, en muestras poco representativas, que algunos focos pequeños salgan en una sección pero no en otra y al hacer la tinción se quede alguna pequeña lesión sin diagnosticar. Una tinción múltiple mejora significativamente la capacidad de distinguir entre lesión benigna y maligna, disminuye la necesidad de tomas adicionales del biopsias del paciente. La hibridación in situ usa tinción múltiple sobre el mismo portaobjetos para determinar la amplificación génica. Además la tradicional hibridación con fluorescencia se puede transformar en hibridación con cromógenos y evaluarse en un microscopio óptico corriente. Fluorescencia dual empleando la técnica de FISH. En rojo la señal génica y en verde la centromérica. Transformación de señal fluorescente del FISH en señal cromogénica Antes de poner a punto esta técnica en un laboratorio, conviene tener en cuenta algunos aspectos importantes: La mayoría de los anticuerpos primarios que se usan hoy en día son de ratón o de conejo. Por tanto, los sistemas de visualización o revelado están basado en anticuerpos contra ratón o contra conejo. Cuando se hace una tinción múltiple hay que cuidarse que no haya interferencias en la detección de uno y otro, es decir, no usar dos primarios de ratón que tengan la misma localización celular, pues no seremos capaces de distinguirlos. 88

89 Inmunohistoquímica avanzada Los cromógenos utilizados para cada anticuerpo deben ser lo suficientemente distintos, pues si hay colocalización de las proteínas en la célula apenas los diferenciaremos. Es decir, cuando se mezclen o superpongan los cromógenos debemos ser capaces de distinguir bien uno y otro. Cuando una de las proteínas que queremos detectar está en una baja concentración y co-localiza con la otra más abundante, esta segunda tiende a enmascararla. Incluso si las proteínas no co-localizan, es difícil equilibran las señales de manera que la proteína menos abundante sea igualmente visible en el portaobjetos que la más abundante. Para solucionar esto lo que se hace es ajustar la concentración de los anticuerpos. En ocasiones, dependiendo del aumento del microscopio que se use para discernir una y otra señal con nitidez, igual perdemos información topográfica, en qué células del tejido se localizan. 8.3 Pre-tratamiento La tinción múltiple, al igual que la individual, se puede realizar en tejido fijado, fresco, congelado, extensiones celulares, etc La única limitación que existe es que, en ocasiones, un mismo pretratamiento no es válido para las dos dianas celulares que se quieren detectar. Hay que llegar a una situación de compromiso que nos permita detectar ambas dianas, aunque sea en detrimento de la intensidad de alguna de ellas. En los casos en los que se combina hibridación in situ (ISH) e Inmunohistoquímica, es un protocolo bastante complejo porque ambos procesos requieren de protocolos de recuperación antigénica o pretratamientos muy diferentes. Dado que algunos procesos de la ISH (la desnaturalización del ADN implica un calentamiento del tejido de 85ºC) no son compatibles con la presencia de anticuerpos, en protocolos combinados ISH/IHQ, se suele hacer primero la ISH antes que la inmunohistoquímica (ej: detección de carga viral en la célula). 8.4 Selección del método multifunción Hay varios métodos de multitinción disponibles. El método más adecuado debe ser aquel en el que no haya reacciones cruzadas entre los reactivos, lo ideal es que los anticuerpos primarios procedan de diferentes especies. En general podemos hablar de varias clases: Método de tinción secuencial: En este procedimiento, un protocolo de tinción sucede a otro. Por ejemplo, el anticuerpo primario 1 se aplica sobre el tejido seguido de un sistema de visualización como la estreptavidinabiotina conjugada con peroxidasa (HRP) y por último el cromógeno DAB. El anticuerpo primario 2, se aplica cuando el exceso de DAB se ha aclarado bien, luego se añadiría estreptavidina-biotina conjugada con fosfatasa alcalina (AP) y después un cromógeno de la AP, como el Fast Red. La gran ventaja de este método es que evita el problema de las reacciones cruzadas. 89

90 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología La desventaja es que no se puede emplear para detectar proteínas que co-localizan en la célula, suelen ser protocolos largos y complejos, los lavados entre un grupo de reactivos y otro debe ser muy eficiente sino corremos el riesgo de que no se elimine bien el primero y de falsos positivos o fondo. Esto se observa sobre todo en anticuerpos con mucha afinidad, que no se lavan muy bien y como consecuencia dejan algunas estructuras con doble tinción inespecífica. Pero si el lavado es excesivo podemos llegar a desnaturalizar el epítopo y que no se visualice correctamente. Además si el epítopo es muy pequeño, al añadir la DAB quizás se den interferencias de tamaño entre ésta y el anticuerpo primario 2. Por todo ésto, no es recomendable usar este método para la detección de proteínas que colocalizan. Se recomienda usar primero el cromógeno más estable (DAB, Fast Red, AEC, X-Gal ) y por último el menos estable. Tinción doble con protocolo secuencial de con anticuerpos policlonales anti-kappa y anti-lambda sobre una amigdala Método de tinción simultánea Los anticuerpos primarios se aplican a la vez sobre el tejido. La ventaja de este método es que requiere de menor tiempo de protocolo que el método secuencial porque los reactivos se pueden mezclar, pero los anticuerpos que se mezclan deben ser compatibles. Se puede usar un método directo de inmunohistoquímica doble con anticuerpos acoplados a enzimas, biotina, haptenos o fluorocromo que permiten visualización inmediata. También se puede usar un método indirecto usando anticuerpos hechos en diferentes especies o que sean de diferente isotipo de Ig o diferente subclase de IgG. Se aplica un cocktail de anticuerpos sobre el tejido. Los anticuerpos primarios serán reconocidos por diferentes secundarios. Lo más ventajoso es usar anticuerpos secundarios diferentes pero producidos en la misma especie, por ejemplo: goat anti-rabbit (conejo) y goat anti-mouse (ratón), de esta manera evitamos reacciones cruzadas interespecíficas de los secundarios. Luego se añadirían de manera secuencial los cromógenos. El resultado es una tinción doble donde el epítopo que reconoce el anticuerpo primario de ratón quedará teñido de un color (marrón si se usa DAB como cromógeno) y el que es reconocido por el primario de conejo quedará teñido de otro (rojo si se usa Fast Red). Tinción doble simultánea de con anticuerpo policlonal anti-racemasa (P504S) y anti- CK 5/6 + CK34B12 sobre un carcinoma de próstata 90

91 Inmunohistoquímica avanzada Método de pasos múltiples Es un método directo e indirecto que combina anticuerpos primarios conjugados con enzima y sin conjugar. El protocolo comienza incubando con un anticuerpo primario sin marcar, luego se añadirá su secundario conjugado con enzima. A continuación se bloquea el tejido con suero del animal en el que se ha producido el anticuerpo primario. Ahora se añade el otro primario conjugado con enzima. Para finalizar, realizamos las dos reacciones enzimáticas secuencialmente. Es un método recomendado cuando no hay mucha disponibilidad de anticuerpos primarios, pero en este protocolo no es posible mezclar reactivos. El usuario verá que al final el método de elección vendrá determinado por la disponibilidad de los anticuerpos primarios, las especies en que se fabricaron y el enzima con que va conjugado. Las dificultades vienen cuando los epítopos que se quieren teñir colocalizan y los únicos anticuerpos disponibles son anticuerpos primarios monoclonales de ratón sin enzima acoplado y de la misma subclase de IgG. Este caso en concreto, ninguna de las técnicas estudiadas será aplicable. Pero habría otra opción: Para marcar anticuerpos primarios de ratón podemos usar fragmentos Fab de ratón biotinilados. A continuación haríamos un bloqueo con suero de ratón. Este procedimiento se puede usar como parte de un método de pasos múltiples. La ventaja es que se requiere muy poca cantidad de anticuerpo primario. Por último, decir que los sistemas de revelado con reconocimiento dual de primarios (ratón y conejo) no discriminan entre estas dos especies de modo que sólo deben usarse para el método secuencial de multitinción y aquellos con sistemas de amplificación en los que no se especifica en qué consisten los diferentes pasos de amplificación, pues puede haber problemas de reacción cruzada. 8.5 Selección de sustrato-cromógenos: cromogénicos, fluorescentes Lo primero que debemos escoger es si queremos hacer una visualización del epítopo por tinción inmunoenzimática o por fluorescencia Colorantes cromogénicos Ejemplos de parejas de enzima-cromógeno para tinciones múltiples pueden ser: 1. Gal-XGal-Turquoise + AP-Fast Blue + HRP-AEC 2. HRP-DAB + Gal-XGal-Turquoise + AP-Fast Red 3. HRP-DAB + AP-New Fucsin + HRP-TMB Cuando se usan combinaciones de colores, deben escogerse colores que sean fáciles de distinguir en el espectro, por ejemplo: rojo y azul, rojo y verde, marrón y azul. Esto es vital sobre todo cuando las proteínas que queremos teñir colocalizan, debemos ser capaces de distinguir la mezcla de ambos colores de los cromógenos individualmente. La cosa se complica cuando realizamos triples tinciones, en estos casos se puede usar la técnica llamada Imagen Espectral. 91

92 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología Permite discernir y mostrar la distribución y abundancia de los cromógenos individualmente en el tejido. Para que acontezca la visualización de la proteína es necesario que el cromógeno precipite. Si no hay una concentración suficiente de cromógeno, aunque sea catalizado por el enzima no va a precipitar. Y de la misma manera si hay un exceso de producto precipitado, puede inhibir el depósito posterior de un cromógeno minoritario. La consecuencia es que es difícil visualizar en el mismo portaobjetos proteínas en muy baja concentración junto con otra a muy alta concentración. Para paliar esto hay un método inmunohistoquímico denominado llamado amplificación de señal catalizada que permite dar una intensidad de señal a la proteína más minoritaria similar a la más abundante Colorantes fluorescentes La tinción múltiple con fluorocromos tiene unas consideraciones técnicas similares a la tinción múltiple con colorantes cromogénicos: deben seleccionarse fluorocromos con propiedades espectrales muy diferentes para que no solapen. Aunque hay muchos colores de fluorocromos disponibles, su espectro de emisión es más reducido que con los colorantes cromogénicos. El uso de colorantes fluorescentes también está extendido al FISH y a la citometría de flujo donde se usan filtros de emisión/excitación que permiten filtrar las diferentes señales recogidas por el microscopio, hacer una separación espectral y tener una imagen más nítida. Gracias a las tecnologías como la Microscopía confocal, podemos visualizar hasta 8 fluorocromos simultáneamente sin problemas de solapamiento de señales. Cuando se tiñen proteínas que colocalizan, los fluorocromos permiten identificar ambas por separado, hacen posible identificar dos proteínas incluso cuando están a muy distintas concentraciones, mientras que con colorantes cromogénicos es fácil que una proteína que está a muy baja concentración pase desapercibida. La inmunofluorescencia tiene una gama de colores más amplia que la tinción cromogénica y tiene más sensibilidad que la tinción cromogénica. Al no haber amplificación enzimática la capacidad de detección de una proteína depende exclusivamente de la sensibilidad del detector. Entre las desventajas podemos citar: Cuando hay dos señales fluorescentes muy próximas, una puede llagar a eclipsar a la otra (QUENCHING). La señal fluorescente acaba reduciéndose cuando se le ilumina mucho tiempo con luz, así la señal fluorescente tiene una vida más corta. Aunque se guarden protegidos de la luz, los fluorocromos se acaban deteriorando a temperatura ambiente. La morfología observada en portaobjetos con IF es diferentes a la que se observa con tinción inmunoenzimática y contratinción. En tejidos fijados con formalina, puede verse algo de tinción inespecífica de fondo debido a la autofluorescencia. A pesar de todo esto, la IF da una señal clara y nítida sobre la localización de los epítopos y es más adecuada cuando se trabaja con proteínas que colocalizan. Algunos cromógenos como el 92

93 Inmunohistoquímica avanzada Fast Red (sustrato del enzima AP) también puede verse (y con más intensidad) con microscopio de fluorescencia. Otras alternativas a la tinción inmunoenzimática y fluorescente para detectar dianas celulares es usar: coloide, anticuerpos marcados con oro e intensificados por precipitación con plata, GFP (Green Fluorescent Protein y su variantes) y Quantum dots. Estos últimos son más estables y más brillantes. Pueden unirse a anticuerpos o streptavidina como alternativa a los fluorocromos; su inconveniente es conseguir que estas partículas inorgánicas accedan a la célula y a los orgánulos subcelulares. 8.6 Análisis de imagen mulitinción automatizado El análisis digital de las imágenes aumenta el número de colorantes disponibles ya que es más sensible que el ojo humano. Estos sistemas toman imágenes tras excitar los fluorocromos a una longitud de onda adecuada y es capaz de separar de una misma señal los diversos colores individuales. Nos va a permitir usar colorantes fluorescentes y cromogénicos en la misma preparación. Hay que tener en cuenta que los detectores amplifican la señal recibida, cosa que no hace el ojo humano, de modo que deben ajustarse las propiedades del filtro detector: permiten la compensación de espectros de emisión que solapan, dándonos una señal muy específica y nítida de cada fluorocromo. El sistema de análisis de imagen permite cuantificar la señal. A través de los algoritmos de un software, el usuario puede contar la intensidad de señal entre diferentes tipos celulares o cual es el porcentaje de células positivas para un determinado anticuerpo en una sección de tejido o cuantas células tienen positividad por encima de un umbral de expresión fijado. 93

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95 UNIDAD DIDÁCTICA IX OPTIMIZACIÓN DE REACCIONES INMUNOHISTOQUÍMICAS

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97 Inmunohistoquímica avanzada 9.1 Digestión tisular con enzimas proteolíticas El proceso de implementación de la inmunohistoquímica en los laboratorios clínicos y de investigación se ha simplificado mucho gracias a la disponibilidad de instrumentos, reactivos y protocolos estandarizados. Sin embargo, la comunidad investigadora le gusta desarrollar nuevas aplicaciones de los protocolos ya existentes. Para ello es necesario considerar los métodos de fijación del tejido, las condiciones de reacción de cada paso de protocolo para obtener resultados claros, nítidos y con mínima tinción de fondo inespecífica. La morfología tisular sirve de gran ayuda para interpretar la especificidad de una tinción en una reacción inmunohistoquímica nueva; además los tejidos tienden a tener reacciones inespecíficas o artefactos de tinción y junto con alguna actividad enzimática endógena puede generar falsos positivos y dar lugar a confusión. El objetivo de la optimización del test es intensificar y aumentar la especificidad de la señal generada por las reacciones inmunológicas y enzimáticas, así como suprimir los artefactos y las tinciones inespecíficas. En este capítulo discutiremos la formulación y el uso de los diversos reactivos inmunohistoquímicos: enzimas proteolíticas del pretratamiento, diluyentes de anticuerpo, soluciones bloqueantes e intensificantes, soluciones de lavado en definitiva cualquier reactivo relacionado con la optimización del ensayo. La digestión tisular con enzimas proteolíticas en un método utilizado para romper los enlaces covalentes que se forman con la inclusión de la pieza quirúrgica en formol. Una proteolisis controlada mejora la penetración de los reactivos en las estructuras tisulares y recupera la conformación nativa de los epítopos de interés, facilitando así que el anticuerpo se una al sitio de interés. Los enzimas proteolíticos reconocen secuencias de aminoácidos específicas en la proteína. Dado que cada proteasa difiere en su especificidad, pueden tener efecto diferente según el tipo de tejido, el tipo de fijador empleado para el procesamiento, el tipo de diana celular, el epítopo reconocido por el anticuerpo, tiempo y temperatura de incubación, concentración enzimática La efectividad de una digestión proteolítica depende de diversos factores, las condiciones óptimas deben determinarse empíricamente para cada tejido, antígeno, tipo de fijador usado Ej: un epítopo con grupos carbohidrato, si no tiene una base proteinácea, quizás no se vea afectado por un tratamiento proteolítico, sin embargo, sobre una glicoproteína que contiene epítopos con grupos carbohidrato si que se podrá hacer un tratamiento antígénico proteolítico porque podremos liberar el antígeno del esqueleto peptídico que lo enmascara. Los antígenos no proteicos pueden ser también desenmascarados con este método porque la digestión proteica favorece la penetración de los reactivos. Lo habitual es hacer incubaciones a 37ºC pues es la temperatura de máximo rendimiento para los enzimas, pero en ocasiones se prefiere alargar el tiempo de incubación y reducir la temperatura porque el proceso de digestión es más gradual y corremos menos riesgo de dañar la morfología del tejido. 97

98 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología Los enzimas más utilizados son: Temperatura Tiempo Proteinasa K min Tripsina min Pepsina min Proteasa XXIV min Pronasa min Los fijadores basados en formol conservan las proteínas formando puentes covalentes entre los aminoácidos, sin embargo, los basados en cloruro de mercurio o etanol fijan por coagulación. En aquellos tejidos fijados con etanol, no debería hacerse desenmascaramiento antigénico. 9.2 Bloqueantes enzimáticos endógenos Los dos enzimas más usados actualmente para generar señal cromogénica en inmunohistoquímica son la peroxidasa de rábano y la fosfatasa alcalina. Ambas enzimas son activas en multitud de tejidos y de células del organismo. Son similares en especificidad a las usadas en inmunohistoquímica, de modo que pueden interferir/superar la señal de la reacción inmunohistoquímica y por tanto producir falsos positivos en el tejido. Para evitar falsos positivos usaremos los bloqueantes de enzimas endógenos que las inactivarán. Células/tejidos que poseen peroxidasa endógena: glóbulos rojos, granulocitos, eosinófilos, hepatocitos, células musculares, riñón, monocitos Células/tejidos que poseen fosfatasa alcalina: placenta, túbulos proximales del riñón, osteoblastos del hueso, células endoteliales de capilares y arterias, neutrófilos, células del folículo y del manto en los tejidos linfoides. Ejemplos de bloqueantes: De la Peroxidasa endógena: peróxido de hidrógeno (H2O2) De la Fosfatasa alcalina: levamisol + cromógeno y un ácido débil (0.3N HCl) 98

99 Inmunohistoquímica avanzada Como norma general los bloqueantes se aplican sobre el tejido antes del anticuerpo, sin embargo en determinadas ocasiones interfieren en la unión antígeno-anticuerpo. El tratamiento con un ácido débil puede también destruir el epítopo. En estos casos, es preferible realizar el paso de bloqueo después de la incubación del anticuerpo pero antes del reactivo que lleva acoplado el enzima (AP o HRP). 9.3 Bloqueantes proteicos Los bloqueantes proteicos sirven para reducir reacciones inespecíficas que resultan de la unión de los anticuerpos u otros reactivos de la inmunohistoquímica a varios componentes tisulares. Los anticuerpos y los reactivos de revelado tienen una base proteica, de modo que son susceptibles de uniones inespecíficas. Los bloqueantes proteicos minimizan la absorbancia inespecífica de proteínas en el tejido, ocupando los posibles sitios de unión inespecíficos en el tejido. De esta manera se reducen muchísimo las señales inespecíficas. 9.4 Diluyentes de anticuerpo Los diluyentes de anticuerpos son soluciones tamponadas que se usan para utilizar los anticuerpos a la solución de trabajo adecuada. La conformación del anticuerpo depende enormemente del entorno acuoso, por eso es esencial encontrar la dilución adecuada, de otro modo se puede alterar la estabilidad del anticuerpo, su capacidad de unión al epítopo y favorecer la interacción de la zona Fc del anticuerpo a regiones inespecíficas. Cambios en la carga, hidrofobicidad, glicosilación u otras propiedades físico-químicas en los anticuerpos puede hacer difícil predecir el comportamiento del anticuerpo con el diluyente. Las interacciones iónicas son las fuerzas que más controlan la unión antígeno-anticuerpo y estas interacciones son ph-dependientes. También las fuerzas de Van der Waals y las interacciones hidrofóbicas. Como norma general, los buffers o soluciones tampón más adecuados para la dilución de anticuerpos suelen tener ph El punto isoeléctrico o pi (ph al cuál la carga neta de una molécula es cero) de las inmunoglobulinas está entre 5.8 y 8.5. Si el ph del diluyente está muy próximo al pi del anticuerpo, disminuye la solubilidad de éste en el diluyente, afectando negativamente a la señal inmunohistoquímica y a la tinción de fondo. Si la señal es muy baja y el fondo muy alto, la recomendación general es subir o bajar el ph del diluyente en 0.5 unidades. 99

100 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología La fuerza iónica de la solución también influye sobre las interacciones de los anticuerpos, la mayoría contienen cantidades milimolares de NaCl y otras sales que sirven para reducir las uniones inespecíficas entre moléculas cargadas. No obstante, ésta no debe ser muy alta ya que si supera a las interacciones específicas de las uniones anticuerpo-epítopo de alta afinidad, ésta unión se verá comprometida. Actualmente, las soluciones tamponadoras confieren una mayor estabilidad a la dilución del anticuerpo y favorecen la optimización del mismo. La mayoría están basadas en soluciones Tris-HCl junto con detergente y estabilizantes. Algunos diluyentes ya contienen bloqueantes proteicos como proteínas séricas o albúmina de suero bovino. Deben estar muy bien optimizados porque si hay un exceso de proteínas séricas en el diluyente, la consecuencia es que interfieren con el anticuerpo primario (disminuyendo su sensibilidad) y con el secundario acoplado al enzima (dando lugar a falsos positivos). El anticuerpo es atraído por el antígeno inicialmente por interacciones electrostáticas y después por fuerzas de Van der Waals e interacciones hidrofóbicas. A: Puentes de Hidrógeno B: Interacciones iónicas C: Interacciones Hidrofóbicas D: Fuerzas de Van der Waals 9.5 Soluciones tampón de lavado: TBS Y PBS Se utilizan para eliminar el exceso de reactivo o aclarar un paso de incubación de un protocolo de inmunohistoquímica. Su composición ha de ajustarse de manera que no altere el equilibrio osmótico que hay a ambos lados de la membrana celular y nuclear. Los más usados son TBS (Tris-buffer Salino) y PBS (Fosfato-buffer Salino) TBS o Tris(hidroximetil)aminometano A menudo se usa en combinación con el detergente no-ionico Tween 20. Los TBS comerciales suelen llevar 0.01% azida sódica, como conservante y como antifúngico. Son soluciones dependientes de ph (por cada grado que disminuye la temperatura, el ph aumenta en 0.03 unidades). Por ejemplo: a 5ºC el ph del TBS es de 8.18, a 25ºC es de 7.6 y a 37ºC es de 7.3. Los buffer o soluciones tamponadoras de lavado también se usan como medios para reducir las uniones inespecíficas de los reactivos a estructuras tisulares. Cuando necesitamos unas condiciones muy restrictivas de inmunohistoquímica (en protocolos de detección muy sensibles), lo que haremos es aumentar en el contenido de sales (NaCl) o de detergente (Tween 20) en el wash buffer para eliminar tinción de fondo. 100

101 Inmunohistoquímica avanzada PBS o Fosfato Buffer Salino: La ventaja de este buffer es que reduce la autofluorescencia de las células para protocolos de inmunofluorescencia y es más barato. Sin embargo, el inconveniente es que da más tinción de fondo y reduce la unión de algunos anticuerpos con su epítopo (ej: anti-cd30). Comparativa de resultados variando la composición del buffer o solución de lavado Tejido prostático teñido con CK34B12 Solución de lavado: 150mM TBS-Tween 20 NaCl 0.05%, ph 7.6 a 25º C. Tejido prostático teñido con CK34B12 Solución de lavado: 300mM TBS-Tween 20 NaCl 0.05%, ph 7.6 a 25º C. 9.6 Intensificadores de cromógeno (DAB) La DAB (diaminobenzidina) es el cromógeno más usado cuando el método de detección o revelado usa peroxidasa. Cuando el producto de la reacción precipita sobre el tejido, vemos una señal marrón claro. Pues bien, esa coloración podemos hacer que se vuelva más oscura y más notoria, algunos metales pesados reducen la DAB y la oscurecen (níquel, cobre, plata, oro y cobalto). Se pueden añadir sobre la solución de DAB o en un paso aparte. Lo habitual es añadirlo después, así podemos controlar la reacción bajo el microscopio. La intensidad final depende de tipo y la concentración de metal empleada. 101

102 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología Dado que la reacción de intensificación con el metal sólo ocurre allá donde haya depositado DAB, no hay riesgo de que deje tinción de fondo inespecífica. Comparativa de resultados usando intensificadores de DAB (Diaminobenzidina) Revelado con DAB sin intensificador Revelado con DAB con intensificador 9.7 Tinciones de fondo En este apartado se tratarán todos los factores que provocan la tinción de fondo y cómo evitarlos. Puede deberse a la propia reacción antígeno-anticuerpo o al método de detección, que cada vez tienen un mayor grado de sensibilidad Tinciones inespecíficas debido a la actividad Peroxidasa endógena Tinción inespecífica debida a la actividad peroxidasa endógena: se define como la reacción de descomposición del H2O2. Esta actividad es propia de la hemoglobina (glóbulos rojos), mioglobina (miocitos), citocromo (granulocitos y monocitos) y catalasas (en hígado y riñón). También hay actividad peroxidasa en tejido adyacente a un área vascularizada debido a la difusión de la sangre. 102

103 Inmunohistoquímica avanzada COMO EVITARLO: El método más usual de inactivar esta actividad es incubando 10min en 3% H2O2 ya que de esta manera saturamos la actividad de este enzima. También se puede hacer con H2O2 metanólico (11partes de H2O2 y 4 partes de metanol absoluto), pero no cuando se quieren teñir marcadores de la superficie celular ni en tejido congelado porque se despegan del cristal. Otra posibilidad es con una mezcla de H2O2 y azida sódica. Otra solución es que en tejido con mucha actividad peroxidasa endógena, se opte por un revelado usando fosfatasa alcalina para que no interfiera en la señal final. Comparativa de resultados inhibiendo la actividad peroxidasa endógena del tejido Sin inhibir la actividad peroxidasa endógena de los glóbulos rojos Después de inhibir la actividad peroxidasa endógena de los glóbulos rojos con 3% H2O Fosfatasa alcalina endógena La actividad fosfatasa alcalina: la actividad fosfatasa alcalina endógena se encuentra sobre todo en intestino, riñón, osteoblastos, superficie de células endoteliales, neutrófilos, tejido linfoide y placenta. COMO EVITARLO: La manera de inactivarla es añadiendo levamisol 5mM a la solución del cromógeno. La mayoría de la actividad fosfatasa se puede inactivar así, salvo la del intestino, ésta puede inactivarse tratando la muestra con un ácido débil antes de añadir el anticuerpo. 103

104 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología De modo que importante bloquear estos sitios extra de unión de biotina con una incubación posterior con biotina. Una solución a base de carbohidratos bloqueará las lectinas, minimizando así el fondo. Comparativa de resultados inhibiendo la actividad fosfatasa endógena de una placenta Sin inhibir la actividad fosfatasa alcalina endógena de una placenta Después de inhibir la actividad fosfatasa alcalina endógena de una placenta con levamisol Avidina endógena Si queremos hacer una tinción doble usando los dos enzimas para el revelado deberemos inactivar las dos, puede hacerse de manera secuencial, da igual cual primero, o simultánea. La avidina es una glicoproteína con un 10% de carbohidratos y un pi de 10, de modo que a un ph fisiológico tiende a unir inespecíficamente componentes tisulares con carga negativa y lectinas. La estreptavidina no contiene grupos carbohidrato y su pi es de 5. Su introducción en la inmunohistoquímica ha eliminado gran parte de los problemas de tinción de fondo que tiene la avidina. Muchos sistemas de revelado utilizan el complejo avidina-biotina para acoplar/unir enzimas a un anticuerpo secundario. La biotina se une a enzimas y a otras proteínas, especialmente en hígado, riñón (epitelio tubular) y en tejido linfoide (histiocitos paracorticales). COMO EVITARLO: La mejor manera de suprimir la actividad de unión de la avidina a otros enzimas es mediante incubaciones de 10-20min con 0.01% a 0.1% avidina y a continuación con %-0.01% biotina antes del protocolo de tinción. 104

105 Inmunohistoquímica avanzada La avidina posee 4 sitios de unión para la biotina y la biotina solo se une a una molécula de avidina. La primera incubación con avidina bloquea la actividad de la biotina endógena, pero a su vez añade 4 sitios de unión más para la biotina. Comparativa de resultados inhibiendo la actividad avidina endógena de una submucosa Sin inhibir la actividad avidina endógena de los mastocitos en una submucosa. Después de inhibir la actividad avidina endógena de los mastocitos en una submucosa Tinción inespecífica debido al uso de polímeros para el revelado El uso de polímeros como sistema de revelado evita el problema del fondo que tiene la avidina/biotina endógena. Estos dejan fondo cuando el lavado posterior a su incubación ha sido incompleto. Dado su enorme tamaño no vamos a tener problemas de difusión en el tejido que sí nos encontramos con conjugados de tamaño más pequeño. Además debido a su esqueleto hidrofóbico tienen tendencia a ser pegajosos. COMO EVITARLO: Para evitar uniones en sitios inespecíficos se harán lavados más largos, más veces y se recomienda añadir detergente al buffer de lavado para limpiarlo bien. 105

106 Técnico Superior Sanitario de Anatomía Patológica y Citología Tinción inespecífica debida a la recuperación antigénica La solución de recuperación antigénica puede afectar la unión epítopo-anticuerpo y alterar la unión del anticuerpo a la proteína del tejido. Hay muchas soluciones de recuperación con diferente composición, diferente ph y diferentes propiedades quelantes (TRIS, EDTA, etc..).todas afectan para bien o para mal esta unión. COMO EVITARLO: Debemos probar qué composición y tiempo nos da mejores resultados y menos tinción de fondo Tinción inespecífica debida a la difusión del antígeno Ocurre cuando la proteína que queremos ver en el tejido difunde de su sitio de síntesis o almacenamiento a los componentes o tejidos adyacentes. Los fijadores tisulares penetran lentamente en el tejido. Como normal general, los antígenos extracelulares y los de bajo peso molecular difunden más que los de alto peso molecular. El típico ejemplo es el de la tiroglobulina, que difunde del epitelio del folículo tiroideo al estroma circundante. Otro ejemplo es el de una proteína que está en altas concentraciones en el plasma sanguíneo y difunde al tejido antes de la fijación. Incluso la ingestión del antígeno en cuestión por parte de los fagocitos también dará tinción de fondo. COMO EVITARLO: Cuando un tejido está bien fijado, las proteínas no se degradan ni difunden, por eso conviene fijar los tejidos lo antes posible. Difusión de proteínas del plasma a todo el tejido linfoide circundante Las células plasmáticas marcan específicamente la presencia de cadenas kappa en su membrana 106