APLICACIONES DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR II

Transcripción

1 APLICACIONES DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR II Identificación de la(s) hexocinasa(s) sensor(es) de carbohidratos en maíz Giovanna Paulina Aguilera Alvarado Tutor: Dra. Sobeida Sánchez Nieto Departamento de Bioquímica Facultad de Química

2 CLONACIÓN MOLECULAR

3 CLONACIÓN MOLECULAR. La clonación molecular se refiere a los procesos mediante los cuales moléculas de DNA recombinante son producidos y transferido a un organismo hospedero en el cual serán replicadas. Se necesitaba un molde Mucha similitud RNA cdna 24h TRIzol Transcripción reversa 5 UTR ORF 3 UTR Diseño de primers Embrión de maíz PCR! HXKs aisladas Transformación y secuenciación Adenilación y ligación Miles copias del cdna de las HXKs de maíz

4 TECNOLOGÍA GATEWAY. Esta tecnología usa el sistema de recombinación del fago lamba para facilitar la transferencia de secuencias de DNA heterólogo (flanqueado por los sitios att) entre diferentes vectores. Se basa en dos reacciones de recombinación. Reacción BP gen Vector donador Kan R BP clonasa Reacción LR Kan R Clona de entrada gen Vector destino LR clonasa gen Clona de entrada Kan R Amp R gen Clona de expresión Amp R Subproducto Kan R

5 CARACTERIZACIÓN CINÉTICA I. Expresión heteróloga en E. coli.

6 PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA RECOMBINANTE. INDUCCIÓN: Liberación de la represión de los genes. BL21 (DE3) Codon Plus RIL (pet-dest42 Gateway: V5, 6X His). Inducción con IPTG Inducción con IPTG RNA pol E. coli laci RNA pol T7 RNA pol T7 ptrnar RNA pol T7 laci Gen de interés pexp42 Probar diferentes condiciones: o Temperatura o Tiempo de inducción o [IPTG] o Cepa o Tag laci laci ptrnai ptrnal Genoma de E. coli BL21 (DE3)

7 PRODUCCIÓN DE PROTEÍNA RECOMBINANTE. Proteína- 6His Resina 75 kda 50 kda ZmHXK X No se produjo ZmHXK9. X ZmHXK4, ZmHXK5 y ZmHXK6 insolubles, sin actividad de HXK. MEM* Citosol AtHXK1 AtHXK2 OsHXK5 OsHXK6 OsHXK7 OsHXK8 ZmHXK4 ZmHXK5 ZmHXK6 ZmHXK7 ZmHXK8 ZmHXK9 Qué tienen en común? *Membrana Externa Mitocondrial Balasubramanian et al., Plant Physiol (2007); Cheng et al., Biol Plantarum (2011); Cho et al., Plant Physiol (2009)

8 VARIANTES SIN N-TERMINAL. Eliminemos la región hidrofóbica, la PCR es nuestra amiga ZmHXK5 ZmHXK5 sin la región hidrofóbica Templado en pgem -T Easy Diseño de primer 5 ZmHXK5 ZmHXK5Δ30 75 kda ZmHXK 4Δ30 5Δ30 6Δ Δ30 50 kda Se produjo ZmHXK9Δ1-30 ZmHXK4Δ1-30, ZmHXK5Δ1-30, ZmHXK6Δ1-30 y ZmHXK9Δ1-30 solubles, con actividad de HXK.

9 MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA. Abs 340nm Existen diversas maneras de medir la actividad de una enzima: cuantificando la desaparición del sustrato, la aparición del producto o mediante un ensayo acoplado. X Hexosas o ATP marcados. Medición de NADH. 0.6 Curva temporal de actividad de HXK y = x R² = Tiempo (min)

10 OBTENCIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS. ZmHXK4Δ30 ZmHXK5Δ30 ZmHXK6Δ30 ZmHXK9Δ30 ZmHXK7 ZmHXK8 Substrate Glucose Fructose Mannose ATP Km (µm) ± ± ± ± V max 5.65 ± 0.12 k cat Km (µm) ± ± ± ± V max 4.55 ± 0.34 k cat Km (µm) ± ± ± ± V max 3.60 ± 0.14 k cat Km (µm) ND ND ND ND V max ND k cat ND Km (µm) ± ± ± ± 0.30 V max ± 0.77 k cat Km (µm) 4687 ± ND ± ± V max ± 0.24 k cat

11 OBTENCIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS. Inhibitor ADP NAG G6P IC50 (mm) ZmHXK4Δ ± ± ± 2.89 ZmHXK5Δ ± ± ± 1.44 ZmHXK6Δ ± ± ± 2.48 ZmHXK9Δ30 ND ND ND ZmHXK ± ± 3.24 NS ZmHXK ± ± 1.63 NS ND: Non detected NS: Non significance Sin actividad. Plegamiento incorrecto? Sistema heterólogo inadecuado?

12 CARACTERIZACIÓN CINÉTICA II. Expresión heteróloga en S. cerevisiae.

13 ENSAYO DE COMPLEMENTACIÓN EN S. cerevisiae. La genética inversa es una disciplina genética que, partiendo del conocimiento de un fragmento de ADN clonado o secuenciado, investiga sobre su función biológica alterando dicho ADN mediante mutación, generalmente a nivel masivo. Dicha mutación puede ser puntual, por sustitución de nucleótidos, o más drástica, por ejemplo mediante silenciamiento de genes completos. Primer UPTAG Homología con el gen de interés Templado Resistencia o prototrofía Homología con el gen de interés Primer DNTAG Cómo se obtiene una mutante de S. cerevisiae? Deleción Ronda 1 PCR Primer de homología Homología con el gen de interés Templado 2 Homología con el gen de interés Primer de homología Ronda 2 PCR Cassette de deleción Inserción del cassete por recombinación homóloga Confirmación por PCR La levadura perdió un gen pero adquirió otro, en este caso uno que le permite crecer en presencia de Kan Eason, PNAS (2004);

14 ENSAYO DE COMPLEMENTACIÓN EN S. cerevisiae. JT 20088: hxk1::his3 hxk2::leu2 glk1::leu2, fondo genético W303-1a: No es capaz de crecer en presencia de Glu ni en ausencia de uracilo. pdrf1-gw: Alto número de copias, prototrofía a uracilo, gen de interés bajo un promotor constitutivo. Transformación de la mutante con las diferentes HXKs de maíz: Método LiAc/SS DNA/ PEG. JT Crece en YPGal Crecimiento hasta la fase mid-log LiAC SSDNA PEG DNA de interés Vórtex 42 C 40 min Siembra en medio selectivo 29 C, 2-3 días Crecimiento en presencia de diferentes hexosas. SGal-URA Gietz, Yeast Protocols (2014);

15 ENSAYO DE COMPLEMENTACIÓN EN S. cerevisiae. El extremo N- terminal estará afectando la actividad in vivo?

16 ENSAYO DE COMPLEMENTACIÓN EN S. cerevisiae. Todas las versiones truncas crecieron mejor que las versiones completas, incluso ZmHXK9Δ30.

17 CARACTERIZACIÓN CINÉTICA. ZmHXK4Δ30, ZmHXK5Δ30 and ZmHXK6Δ30: They have a smaller Km value for Man followed by the Glc Km value, but the lower V max found is displayed with Man. The enzyme with the smallest Km for Glc was ZmHXK6Δ30. In addition, ZmHXK7 showed the smallest Km for ATP and Fru, as opposed to ZmHXK8, whose Km for Fru was not possible to estimate. The 30 amino acids at N-terminal not only make the proteins insoluble in E. coli, but also modify their activity. ZmHXK9 has a minimal enzymatic activity sufficient to allow yeast growth in a medium supplemented with Glc or Fru as carbon source. Therefore, ZmHXK4-9 must be considered as true HXKs, even if ZmHXK9 shows a marginal enzymatic activity whose physiological relevance remains uncertain.

18 RECORDANDO EL OPERON LAC laci laci