REAL CLEAN MATRIX KIT

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1 03/10 RBMCM01 REAL CLEAN MATRIX KIT Ref. RBMCM Preps. 1. INTRODUCCIÓN 1. INTRODUCTION Real Clean Matrix Kit provee un método versátil y efectivo para una rápida y eficiente purificación y concentración de ADN a partir de soluciones, o geles de agarosa ya sean de TAE o TBE, aunque se recomienda el uso de geles de TAE para una óptima recuperación. La purificación se basa en la absorción selectiva de los ácidos nucleicos en partículas de sílica especialmente preparadas en presencia de sales caotrópicas. El método utiliza una Real Sílica Matrix y Ioduro de Sodio que disuelve los geles de agarosa más fácilmente que el tradicionalmente empleado perclorato de sodio y que requiere menos fases de lavado. Real Clean Matrix Kit permite una recuperación de ADN de Kb con una eficiencia que varía entre el 60-90% dependiendo del tamaño. Real Clean Matrix Kit provides a versatile and effective method for a quick and efficient purification and concentration of DNA from solutions, or either TAE or TBE agarose gels, although the use of TAE gels is recommended for an optimum recovering. The purification is based on the nucleic acids selective absorption in silica particles specially prepared in presence of chaotropic agents. The method uses a Real Silica Matrix and Sodium iodure that dissolves agarose gels more easily than, the usually employed, Sodium Perchlorate, and requires less washing steps. Real Clean Matrix Kit allows a DNA recovering of Kb with an efficiency that varies between 60 90% depending on the DNA fragment size. Sistema de producción certificado bajo norma ISO Tamaño del ADN Recuperación % Agarosa Tamaño del ADN DNA Size Recovering % Agarose DNA Size 200 bp 60 % 0.3 % 5-60 Kb 500 bp 70 % 0.5 % 1-30 Kb 5 Kb 90 % 0.7 % Kb 23 Kb 75 % 1.0 % Kb 50 Kb 60 % 1.2 % Kb 1.5 % Kb Production system certified under ISO 1/6

2 2. COMPONENTES DEL KIT KIT COMPONENTS Equipos y reactivos necesarios no incluidos en el kit: * Etanol 100 %. * Microtubos de 1.5 ml * Microcentrifuga. * Ácido Acético Glacial * Baño de Agua REAL Sílica Matrix REAL Silica Matrix Solución de Solubilización y Unión Solubilization and Binding Solution Solución de Lavado Wash Solution Ref. Ref. RBMCM preps Equipment and additional reagents required * 100 % Ethanol * 1.5 ml microtubes * Microcentrifuge * Glacial Acetic Acid * Water Bath. Tª RSM 1.5 ml RT CM01 75 ml 4ºC EP08 20 ml RT 3. PROTOCOLO GENERAL GENERAL PROCEDURE 3.1 Consideraciones preliminares 1. El protocolo implica los siguientes pasos: Solubilización del gel, el Ioduro de Sodio solubiliza la agarosa y además promueve la unión del ADN a la Real Sílica Matrix. Unión del ADN, la Real sílica Matrix se añade a la solución o gel solubilizado y se une al ADN. Purificación del ADN, lavado de la Real sílica Matrix unida al ADN con una solución de lavado que contiene etanol y elimina los contaminantes, proteínas, etc. Secado, la Real sílica Matrix es secada para eliminar el etanol residual que puede inhibir las siguientes manipulaciones enzimáticas. Recuperación del ADN, el ADN es eluido de la Real sílica Matrix con Tris-Cl ph 8.5 o agua estéril. 2. Para purificaciones de fragmentos de pb. Se recomienda añadir 1/200 volúmenes de ácido acético al 10 %. Esto producirá un descenso en el ph a promoviendo una mayor eficiencia en la unión. Además se recomienda testar pequeñas cantidades de muestra de fragmentos de ADN entre pb con este kit antes de purificar una muestra entera. 3.1 Preliminary conditions 1. The protocol implies the following steps: Gel solubilization, Sodium iodure solubilizes the agarose and promotes the DNA binding to the Real Silica Matrix. DNA binding, the Real Silica Matrix is added to the solution or solubilized gel and binds to DNA. DNA purification, wash the Real Silica Matrix bounded to DNA with a wash solution which contains ethanol and removes contaminants, proteins, etc. Drying, the Real Silica Matrix is dried to remove the residual ethanol that can inhibit following enzymatic manipulations. DNA recovering, DNA is eluted from the Real silica Matrix with Tris-HCl ph 8.5 or sterile water. 2. To purify bp fragments. It is recommended to add 1/200 volumes of 10% acetic acid. This will produce a decrease in the ph to stimulating a higher binding efficiency. REAL recommends to test small volumes of sample with DNA fragments between bp with this kit, prior to purify a whole sample. 2/6

3 03/10 RBMCM01 3. Coloración de la solución CM01. Cuando se expone al aire por un largo tiempo se vuelve de color amarillo. A pesar de ello, el cambio de color no inhibe la función de esta solución, siempre y cuando el ph, normalmente entre , no exceda de 7.5, lo cual produce un descenso en la eficiencia de unión. El ph puede ser ajustado a con 1/ 200 volúmenes de Acido acético 10% respecto el volumen de Solución de Solubilización y Unión. 4. Secado de la Real Sílica Matrix. Con el uso se puede producir una evaporación de líquido del vial de la Real sílica Matrix. Para reconstituirlo añadir agua estéril de forma que la cantidad de líquido y sólido sea igual. 5. Geles de TBE. Cuando se desea purificar ADN a partir de geles de agarosa de TBE, que tienen un efecto inhibidor en la unión de la sílica al ADN, se recomienda añadir Acido acético. Preparar una solución de Acido acético al 50 % en agua, añadir 5 µl por cada 250 µl de solución de Solubilización y Unión utilizados. Puede observarse un cambio en la coloración. Preparar cada vez esta solución, no conservar. 3. CM01 Solution staining. When it is exposed to air for a long time it will turn yellow. Nevertheless, the change of colour does not inhibit the solution function, as long as the ph, usually between , is not higher than 7.5, as this decreases the binding efficiency. The ph can be adjust to with 1/200 volumes of 10% acetic acid according to the Solubilization and Binding Solution volume. 4. Real Silica Matrix drying The liquid from the vial of the Silica Matrix can be evaporated as it is used. To reconstitute it add sterile water, so the liquid quantity is the same as the solid quantity. 5. TBE gels. When you want to purify DNA from TBE agarose gels, which have an inhibition effect on the DNA binding to the Silica, it is recommended to add Acetic acid. Prepare a 50% Acetic acid solution in water; add 5 µl per each 250ul of Solubilization and Binding solution used. A change of colour can be observed. Prepare the solution each time you need it, do not store it. 3.2 Preparaciones preliminares Añadir 80 ml de Etanol 100% a la Solución de Lavado. Marcar el envase y mantenerlo bien cerrado para evitar la evaporación del etanol. Resuspender bien la Real Sílica Matrix por agitación con vortex. 3.2 Preliminary Preparations Add 80 ml of 100% ethanol to the Wash solution. Label the container and keep it close to avoid ethanol evaporation. Resuspend the Real Silica Matrix by shaking with vortex. 3.3 Protocolo de trabajo 1. Medir el volumen / peso del ADN Si el ADN se encuentra en solución medir el volumen con una pipeta Para purificaciones de geles de agarosa, cortar la banda e intentar minimizar el tamaño del fragmento eliminando el exceso de agarosa. Para la conversión asumir que 1g de gel equivale a 1 ml. Si el fragmento pesa menos de 0.4g utilizar un microtubo de 1.5 ml. 2. Añadir 3 volúmenes de Solución de Solubilización y Unión (ref. CM01) Basándose en el volumen de la solución o peso del gel más la cantidad de Real sílica Matrix utilizada Para fragmentos menores de 500 pb o fragmentos mayores de 23 Kb añadir 4.5 volúmenes de Solución CM Para geles de TBE añadir 4. 5 volúmenes de solución CM Añadir 15 µl de Real sílica Matrix. Verificar que la Real sílica Matrix ha sido bien resuspendida mediante agitación con vortex. 4. Incubar a 55ºC durante 5-10 minutos. Para permitir la solubización de la agarosa y la unión de la Real sílica Matrix al ADN. Mezclar por inversión cada 1-2 minutos. Cuando se trabaje con volúmenes mayores aumentar el tiempo de incubación. 3/6

4 5. Centrifugar durante 30 segundos y eliminar todo el sobrenadante por aspiración o pipeta. 6. Lavar el pellet de Real sílica Matrix con 600 µl de Solución de Lavado. Resuspender el pellet mediante agitación con vortex o con una pipeta. Centrifugar durante 30 segundos y eliminar el sobrenadante. No excederse con el vortex. Para mayores cantidades de Real sílica Matrix ver la cantidad de solución de lavado a utilizar en la tabla adjunta al final del protocolo. 7. Repetir el lavado pero añadiendo la mitad de solución de lavado que en el punto 6 8. Centrifugar el microtubo durante unos segundos. Eliminar las gotas residuales de etanol con una pipeta si es necesario, puesto que podrían inhibir las siguientes manipulaciones enzimáticas. 9. Secar el pellet a 55ºC durante 4 minutos. De esta manera se elimina el etanol que ha podido quedar atrapado en el pellet de Real sílica Matrix. No prolongar más tiempo el secado ya que un exceso en el secado produciría una pobre recuperación en el proceso de elución. Únicamente en el caso de que se esté utilizando una cantidad mayor de Real Sílica Matriz, se puede aumentar el tiempo de secado. 10. Eluir el ADN con 30 µl de agua estéril o 10 mm Tris-Cl ph 8.5. Resuspender el pellet por agitación con vortex o pipeta. 11. Incubar a 55 ºC durante 5-10 minutos. Mezclar cada 1-2 minutos. 12. Centrifugar a máxima velocidad durante 90 segundos en una microcentrifuga. Recoger el sobrenadante (aproximadamente de 27 µl) que contiene el ADN en un nuevo microtubo. ATENCION si se observa Real Sílica Matrix en la muestra eluida, volver a centrifugar y cuidadosamente pasar el sobrenadante a un nuevo microtubo, evitando tocar el pellet de Real Sílica Matrix. 13. Aunque no se observe Real Sílica Matrix, SE RECOMIENDA, efectuar esta segunda centrifugación, ya que la presencia de partículas de Real Sílica Matrix podría inhibir las siguientes manipulaciones enzimáticas. 14. Opcional. Repetir el proceso de elución. Una segunda elución puede rendir un 10-20% adicional de recuperación de ADN. 3.3 Working Protocol 1. Measure the volume / weight of DNA If the DNA is in solution, measure the volume with the use of a pipette For agarose gels purifications, cut the band and try to minimize the fragment size removing the excess of agarose. For the conversion, assume that g of gel is equivalent to 1ml. If the fragment weights less than 0.4g use a 1.5 ml micro tube. 2. Add 3 volumes of Solubilizaton and Binding Solution (ref. CM01) According to the solution volume or weight of gel plus Real Matrix quantity used For smaller than 500 bp fragments, or larger than 23 Kb fragments, add 4.5 volumes of CM01 Solution For TBE gels, add 4.5 volumes of CM01 Solution 3. Add 15 µl of Real silica Matrix. Verify that the Real silica Matrix has been well resuspended shaking it well 4. Incubate at 55ºC for 5-10 minutes. To allow the agarose solubilization and the DNA binding to the Real silica Matrix, gently, mix every 1-2 minutes. If you are working with bigger volumes increase the incubation time. 5. Centrifuge for 30 seconds and remove all the supernatant by aspiration or pipette. 6. Wash the Real silica Matrix pellet with 600 µl of washing Solution. Dissolve the pellet by shaking it with a vortex or with a pipette. Centrifuge for 30 seconds and remove the supernatant. Do not use the vortex too much. For bigger Real Silica Matrix quantities, see the washing solution quantity you must use on the table above. 7. Repeat the washing step, but adding half of the washing solution used in step Centrifuge the microtube for several seconds. Remove the residual ethanol drops with a pipette if necessary, as they could inhibit following enzymatic manipulations. 9. Dry the pellet at 55º C for 4 minutes. This way the ethanol that could have been retained in the Real silica Matrix is removed. 10. Elute DNA with 30 µl of sterile water or 10 mm Tris-HCl ph 8.5. Dissolve the pellet shaking with vortex or pipette. 11. Incubate at 55 ºC for 5-10 minutes. Mix every 1-2 minutes. 12. Centrifuge at maximum speed for 90 seconds in a microcentrifuge. Collect the supernatant (27 µl approximately) contained the DNA in a new microtube. CAUTION if you can see Real Silica Matrix in the eluted sample, centrifuge once more and carefully change the supernatant into a new microtube avoiding touching the Real Silica Matrix pellet. 4/6

5 03/10 RBMCM Even though you can not see Real Silica Matrix, IT IS RECOMMENDED, to do this second centrifugation, as the presence of Real Silica Matrix particles could inhibit the following enzymatic manipulations. 14. Optional. Repeat the elution process. A second elution can provide an additional % DNA recovering Tabla para el cálculo de la cantidad de Solución de Lavado necesaria Wash solution needing calculation table Cantidad de ADN DNA Quantity REAL Sílica Matrix REAL Silica Matrix Solución de Lavado Wash Solution < 7.5 µg 15 µl 600 µl < 12.5 µg 25 µl 750 µl < 25 µg 50 µl 900 µl < 50 µg 100 µl 1500 µl 4. GUIA DE PROBLEMAS Y POSIBLES SOLUCIONES TROUBLESHOOTING 1. Baja recuperación de ADN Debido a que el Etanol 100% no fue añadido a la solución de lavado o su concentración es inadecuada. Comprobar que se añade y marcar el envase convenientemente. Evitar también la evaporación conservando la Solución de lavado a 4ºC Debido a que los fragmentos de agarosa no fueron disueltos completamente con la Solución de Solubilización y Unión. Esto puede ocurrir si se añade demasiada agarosa y no se mezcla cada 1-2 minutos durante el periodo de incubación a 55ºC Debido al uso de un tampón de elución inadecuado. Utilizar 10 mm Tris-Cl ph 8.5 o agua estéril. Chequear el ph del tampón de elución Debido a que en geles de TBE no se utilizó la solución al 50 % de ácido acético para optimizar la recuperación Debido a que la Real Clean Matrix no fue lavada correctamente para eliminar las sales, sino son eliminadas, el ADN puede permanecer unido a la Real sílica Matrix en el paso de elución. 1. Low DNA recovering Due to 100% Ethanol was not added to the washing solution or its concentration is not the correct one. Be sure it is added and label the container. Avoid evaporation, storing the washing solution at 4ºC Due to agarose fragments were not completely dissolved with the Solubilization and Binding Solution. This may happen if too much agarose is added and it is not mixed every 1-2 minutes during the incubation period at 55º C Due to the elution buffer is not the correct one. Use 10 mm Tris-HCl ph 8.5 or sterile water. Check the elution buffer ph Due to in TBE gels, the 50% Acetic acid solution, to optimize the recovering, was not used Due to the Real Clean Matrix was not correctly cleaned to remove salts, if they are not removed, DNA may be kept bounded to the Real silica Matrix in the elution step 5/6

6 2. El ADN eluido no es funcional en las siguientes manipulaciones enzimáticas Debido a que en el paso de lavado y secado del pellet de Real Sílica Matrix con la Solución de lavado no se elimina todo el etanol, la presencia de etanol residual inhibe las posteriores manipulaciones enzimáticas Debido a la presencia de Real Sílica Matrix en el ADN eluido. Se recomienda una segunda centrifugación y no tocar el pellet en el momento de recoger el sobrenadante que contiene el ADN Debido a la presencia residual de ioduro de sodio o sal. Insuficiente lavado de la Real sílica Matrix previo a la elución. Esto puede ocurrir sino se resuspende bien la Real sílica Matrix en el proceso de lavado. Se puede realizar un lavado extra con la solución de lavado o con etanol 70 %. Además la presencia de ioduro de sodio residual puede afectar en las estimaciones espectrofotométricas del ADN ya que absorbe a 260 nm. 2. The eluted DNA is not functional in following enzymatic manipulations Due to during the washing and drying step of the Real Silica Matrix pellet with the washing solution, not all the ethanol was removed; the presence of residual ethanol inhibits later enzymatic manipulations Due to Real silica Matrix presence in the eluted DNA.It is recommended to do a second centrifugation, as well as to avoid touching the pellet when the supernatant that contains the DNA is collected Due to residual presence of Sodium iodure or Salt. The Real Silica Matrix washing step before the elution was not enough. This may happen if the Real Silica Matrix is not dissolved in the correct way during the washing step. An extra washing step can be done using washing solution or 70% ethanol. Moreover, the presence of residual Sodium Iodure may affect the spectrophotometric DNA estimations, as it absorbs at 260nm. 6/6