REALPURE GENOMIC DNA EXTRACTION KIT

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1 04/10 RBMEG01/RBMEG02/RBMEG03 REALPURE GENOMIC DNA EXTRACTION KIT Ref. RBMEG01 Ref. RBMEG02 Ref. RBMEG03 1. INTRODUCCIÓN 1. INTRODUCTION Este kit está designado para la extracción de ADN genómico de alta calidad a partir de una amplia variedad de muestras incluyendo células en cultivo, tejidos animales, colas de ratón, bacterias, levaduras, tejidos embebidos en parafina y fluidos corporales. Otros protocolos pueden obtenerse para diferentes muestras solicitándose al servicio técnico del laboratorio REAL (saliva, semen, orina, pelo humano, stain blood, Drosophila, etc.) El procedimiento incluye una lisis celular con un detergente aniónico que solubiliza los componentes celulares. Si es necesario, el ARN contaminante puede ser eliminado con un tratamiento con RNasa. Las proteínas celulares son eliminadas por un paso de precipitación, el cual hace precipitar las proteínas pero deja el ADN genómico en solución. Finalmente, el ADN genómico es aislado por una precipitación con isopropanol. El ADN purificado puede ser utilizado en una variedad de aplicaciones, incluyendo amplificaciones de ADN, digestiones con enzimas de restricción, Southern y dot/slot blots, secuenciación y clonaje. Sistema de producción certificado bajo norma ISO This kit is designed for the extraction of high quality genomic DNA from a wide variety of samples, including cell cultures, animal tissues, mouse tail, bacteria, yeasts, paraffin-embedded tissue and body fluids. You can obtain other protocols for different samples asking REAL s technical service (saliva, semen, urine, human hair, stain blood, Drosophila, etc.) The processing includes a cell lysis with an anionic detergent that solubilizes the cell components. If it is necessary, the contaminant RNA can be removed with RNase treatment. Cell proteins are removed by a precipitation step, which makes the proteins precipitate but leave the genomic DNA in Finally, the genomic DNA is isolated by a precipitation with isopropanol. The purified DNA can be used for different applications, including DNA amplifying, digestions with restriction enzymes, Southern and dot/slot blots, sequencing and cloning. Production system certified under ISO 1/12

2 2. COMPONENTES DEL KIT KIT COMPONENTS Tampón de Lisis REALPURE REALPURE Lysis Solution Solución de Eliminación de Proteínas Protein Precipitation Solution Solución de Hidratación del ADN DNA Hydratation Solution RNasa 10 mg/ml RNase 10 mg/ml Proteinasa K 20 mg/ml Proteinase K 20 mg/ml Ref. Ref. RBMEG01 Ref. RBMEG02 Ref. RBMEG03 E22 30 ml 120 ml 120 ml RT E23 20 ml 75 ml 75 ml RT E24 8 ml 30 ml 30 ml RT/4ºC E µl 600 µl ºC E µl 600 µl ºC Tª Ref. RBMEG01: Incluye reactivos suficientes para realizar 50 extracciones de 20 mg de tejido o colas de ratón, o 50 extracciones 4 x 10 6 células en cultivo o 50 ml cultivo bacteriano, o 100 ml cultivo de levaduras. Incluye la RNasa y la Proteinasa K. Ref. RBMEG02: Incluye reactivos suficientes para realizar 200 extracciones de 20 mg de tejido o colas de ratón, o 200 extracciones 4 x 10 6 células en cultivo, o 200 ml cultivo bacteriano, o 400 ml cultivo de levaduras. Incluye la RNasa y la Proteinasa K. Ref. RBMEG03: Incluye reactivos suficientes para realizar 200 extracciones de 20 mg de tejido o colas de ratón, o 200 extracciones 4 x 10 6 células en cultivo, o 200 ml cultivo bacteriano, o 400 ml cultivo de levaduras. No Incluye la RNasa ni la Proteinasa K. Equipos y reactivos necesarios no incluidos en el kit: * Isopropanol. * Etanol 70%. * Microtubos de 1.5 ml y 2.0 ml, tubos de centrifuga de 15 o 50 ml * Microcentrifuga o centrifuga clínica. * Vortex. * Baño de agua. * Xileno (para extracción en tejidos embebidos en parafina). * Lisozima (para extracción de bacterias Gram(+)). * Liticasa (para extracción de levaduras). Ref. RBMEG01: Includes enough reagents for doing 50 extractions of 20 mg of tissue or mouse tails, or 50 extractions 4 x 10 6 culture cells or 50 ml bacterium culture, or 100 ml yeast culture. Includes the RNase and the Proteinase K. Ref. RBMEG02: Includes enough reagents for doing 200 extractions of 20 mg of tissue or mouse tails, or 200 extractions 4 x 10 6 culture cells, or 200 ml bacterium culture, or 400 ml yeast culture. Includes the RNase and the Proteinase K. Ref. RBMEG03: Includes enough reagents for doing 200 extractions of 20 mg of tissue or mouse tails, or 200 extractions 4 x 10 6 culture cells, or 200 ml bacterium culture, or 400 ml yeast culture. Does Not Include the RNase or the Proteinase K. Equipment and additional reagents required * Isopropanol. * 70%Ethanol. * 1.5 ml and 2.0 ml microtubes, 15 or 50 ml centrifuge tubes. * Microcentrifuge or clinic centrifuge. * Vortex. * Water bath. * Xylene (for extraction from paraffin-embedded tissue). * Lysozime (for extraction from Gram (+) bacteria). * Lyticase (for extraction from yeasts). 2/12

3 04/10 RBMEG01/RBMEG02/RBMEG03 3. PROTOCOLO GENERAL GENERAL PROCEDURE 3.1 Consideraciones preliminares Se recomienda incluir un tratamiento de Proteinasa K para aumentar la eficiencia de lisis, aunque en algunas muestras este tratamiento no es necesario. Si se quiere reducir el tiempo de purificación, el propio usuario puede determinar según la muestra si se requiere el tratamiento con Proteinasa K. La adición de 1.5 µl de Proteinasa K en 300 µl de Solución de lisis dará lugar a una concentración final de 100 µg/ml. Incubar a 55ºC durante 1 hora o hasta que la digestión sea completa. Si se requiere ADN libre de ARN para las subsiguientes aplicaciones, se puede realizar una digestión con RNasa. Las muestras que son difíciles de lisar pueden ser pulverizadas bajo Nitrógeno líquido o pueden ser tratadas con un homogenizador mecánico. Algunas cepas, especialmente las bacterias Gram + y levaduras pueden necesitar una preincubación con enzimas líticos, los cuales no son suministrados con este kit. Si la cantidad de ADN que se espera obtener es baja (< 2 µg), es recomendable añadir un carrier como glucógeno (1µl de solución de glucógeno 20 mg/ml por 600 µl de isopropanol). 3.2 Preparaciones preliminares Si la Solución de lisis contiene un precipitado debido a las bajas temperaturas. Incubar a 37ºC y mezclar para disolver el precipitado Conservar la RNasa y la Proteinasa K a 4ºC. Si el periodo de utilización del kit va a ser elevado, se recomienda hacer alicuotas y conservar a 20ºC. 3.1 Preliminary conditions It is recommended to include a Proteinase K treatment to increase the lysis efficiency, although this treatment is not necessary with some samples. If you want to reduce the purification time, the user can decide, according to the sample, if he wants the Proteinase K treatment. The addition of 1.5 µl of Proteinase K in 300 µl of Lysis Solution will give a final concentration of 100 µg/ml. Incubate at 55ºC for 1 hour or until the digestion is complete. If you want DNA free from RNA for the following applications, a digestion with Rnase can be done. The samples which are difficult to lyse can be pulverised with liquid Nitrogen or can be treated with a mechanical homogenizator. Some strains, especially Gram + bacteria and yeast may need a preincubation with lytic enzymes, which are not supplied with this kit. If the DNA quantity you hope to obtain is low (< 2 µg), it is recommended to add a carrier such as glycogen (1µl of 20 mg/ml glycogen solution per 600 µl of isopropanol). 3.2 Preliminary Preparations If the lysis solution contains a precipitate due to the low temperatures, incubate at 37ºC and mix to dissolve the precipitate Store the RNase and the Proteinase K at 4ºC. If the kit using period is going to be long, it is recommended to dispense aliquots and to store it at 20ºC. 3/12

4 3.3 Protocolo de extracción de ADN genómico a partir de 20mg / 50mg de tejidos animales Lisis celular 1. Diseccionar la muestra de tejido y rápidamente enfriar en nitrógeno líquido. Conservar a 70ºC 0 80ºC. Se puede utilizar directamente el tejido fresco para la extracción. Trabajar rápidamente y mantener el tejido en hielo durante toda la extracción. 2. Añadir 20 mg / 50 mg de tejido congelado pulverizado con nitrógeno líquido o tejido fresco a 600 µl / 1.5 ml de Solución de Lisis. Las muestras que son difíciles de lisar pueden ser tratadas con un homogenizador mecánico (Polytron, Ultraturrax). 3. Para aumentar la eficiencia de la lisis en tejidos se recomienda el uso de Proteinasa K. Añadir 3 µl / 7.5 µl mezclar e incubar a 55ºC durante 3 horas o toda la noche, hasta la lisis total. Si es posible, invertir o agitar mediante vortex periódicamente durante la incubación. Tratamiento con RNasa 1. Enfriar la muestra a temperatura ambiente. 2. Añadir 3 µl / 7.5 µl de RNasa al lisado. 3. Mezclar la muestra por inversión del tubo e incubar a 37ºC durante minutos. Precipitación de proteínas 1. Añadir 360 µl / 900 µl de Solución de precipitación de proteínas. 2. Agitar mediante vortex vigorosamente durante segundos. 3. Centrifugar a xg / xg durante 5-10 minutos. Se observará que el precipitado proteico forma un pellet. Precipitación del ADN 1. Pasar el sobrenadante que contiene el ADN a un tubo de 1.5 ml que contenga 600 µl de isopropanol o a un tubo de 15 ml que contenga 1.5 ml de isopropanol. Mezclar por inversión varias veces. 2. Centrifugar a xg / xg durante 3 minutos. 3. Eliminar el sobrenadante. Añadir 600 µl / 1.5 ml de etanol 70% e invertir varias veces para lavar el pellet de ADN. 4. Centrifugar a xg / xg durante 2 minutos. Eliminar todo el etanol cuidadosamente pues el pellet de ADN puede desplazarse. 5. Invertir el tubo y dejar secar en papel absorbente durante 15 minutos. Hidratación del ADN 1. Añadir 100 µl / 250 µl de Solución de Hidratación del ADN. 2. Incubar a 65ºC durante 1 hora con periódicas agitaciones para ayudar a la dispersión del ADN, o incubar overnight a temperatura ambiente para que se rehidrate. 3. Conservar a 2-8ºC. Para almacenajes largos conservar a 20ºC o 80ºC. 3.3 Protocol for genomic DNA extraction from 20mg / 50mg of animal tissues Cell lysis 1. Dissect the tissue sample and quickly freeze in liquid nitrogen. Store at 70ºC or 80ºC. It is possible to use fresh tissue directly, work very quickly and keep tissue on ice at all times. 2. Add 20 mg / 50 mg of frozen ground tissue or fresh tissue to 600 µl / 1.5 ml of Lysis Solution. Difficult to treat samples, can be treated with a mechanical homogenizator (Polytron, Ultra turrax). 3. To increase the lysis efficiency in tissues it is recommended to use Proteinase K. Add 3 µl / 7.5 µl mix and incubate at 55ºC for 3 hours to overnight night, until the total lysis. If possible, invert tube or shake periodically, with the use of vortex, during the incubation period. RNase treatment 1. Cool the sample to room temperature. 2. Add 3 µl / 7.5 µl of RNase to the cell lysate. 3. Mix the sample turning the tube upside down and incubate at 37ºC for minutes. Protein precipitation 1. Add 360 µl / 900 µl of protein Precipitation Solution. 2. Mix with vortex vigorously a high speed for seconds. 4/12 3. Centrifuge at xg / xg for 5/10 minutes. The precipitated proteins will form a tight pellet. DNA precipitation 1. Pour the supernatant containing the DNA in a 1.5 ml tube containing 600 µl of isopropanol in a 15 ml tube containing 1.5 ml of isopropanol. Mix by turning the tube upwards several times. 2. Centrifuge at xg / xg for 3 minutes. 3. Remove the supernatant. Add 600 µl / 1.5 ml of 70% ethanol and invert tube several times to wash the DNA pellet. 4. Centrifuge at xg / xg for 2 minutes. Remove carefully all the ethanol avoiding touching the pellet. 5. Invert and drain the tube on clean absorbent paper and allow to air dry for 15 minutes. DNA hydratation 1. Add 100 µl / 250 µl DNA hydratation 2. Incubate at 65ºC for 1 hour, shaking to help the DNA dispersion, or incubate overnight at room temperature. 3. Storage at 2-8ºC. For long time storage, store at 20ºC o 80ºC.

5 04/10 RBMEG01/RBMEG02/RBMEG Tabla de volúmenes de reactivos escalados desde 5 mg hasta 600 mg Scaled reactive volumes table from 5 mg to 600 mg Cantidad de tejido en mg Tissue quantity in mg Tamaño del Tubo Tube size Tampón de Lisis REALPURE REALPURE Lysis Buffer RNasa RNase Proteinasa K Proteinase K Solución de Precipitación de Proteínas Protein Precipitation Solution Isopropanol Isopropanol Solución de Hidratación del ADN DNA Hydratation Solution ml 1.5 ml 2 ml 15 ml 15 ml 50 ml 0.3 ml 0.6 ml 0.75 ml 1.5 ml 3.0 ml 18 ml 1.5 µl 3.0 µl 3.75 µl 7.5 µl 15 µl 90 µl 1.5 µl 3.0 µl 3.75 µl 7.5 µl 15 µl 90 µl 0.18 ml 0.36 ml 0.45 ml 0.90 ml 1.8 ml 10.8 ml 0.3 ml 0.6 ml 0.75 ml 1.5 ml 3.0 ml 18 ml 50 µl 100 µl 150 µl 250 µl 375 µl 500 µl 3.4 Protocolo de extracción de ADN genómico a partir de mg / mg de cola de ratón Lisis celular 1. Colocar 15 mm (20-30 mg) / 30 mm (40-60 mg) de cola de ratón troceada en 600 µl / 1.20 ml de Solución de Lisis. 2. Añadir 3 µl / 6.0 µ l de Proteinasa K. Mezclar e incubar a 55ºC durante toda la noche, o hasta la lisis total. Si es posible, invertir o agitar mediante vortex periódicamente durante la incubación. Tratamiento con RNasa 1. Enfriar la muestra a temperatura ambiente. 2. Añadir 3 µl / 6.0 µl de RNasa al lisado. 3. Mezclar la muestra por inversión del tubo e incubar a 37ºC durante minutos. Precipitación de proteínas 1. Añadir 360 µl / 720 µl de Solución de precipitación de proteínas. 2. Agitar mediante vortex vigorosamente durante segundos. 3. Centrifugar a xg / xg durante 5 / 10 minutos. Se observará que el precipitado proteico forma un pellet. Precipitación del ADN 1. Pasar el sobrenadante que contiene el ADN a un tubo de 1.5 ml que contenga 600 µl de isopropanol o a un tubo de 15 ml que contenga 1.2 ml de isopropanol. Mezclar por inversión varias veces. 2. Centrifugar a x g / xg durante 3 minutos. 3. Eliminar el sobrenadante. Añadir 600 µl / 1.2 ml de etanol 70% e invertir varias veces para lavar el pellet de ADN. 4. Centrifugar a xg / xg durante 2 minutos. Eliminar todo el etanol cuidadosamente pues el pellet de ADN puede desplazarse. 5. Invertir el tubo y dejar secar en papel absorbente durante 15 minutos. Hidratación del ADN 1. Añadir µl / µl de Solución de Hidratación del ADN. 2. Incubar a 65ºC durante 1 hora con periódicas agitaciones para ayudar a la dispersión del ADN, o incubar overnight a temperatura ambiente para que se rehidrate. 3. Conservar a 2-8ºC. Para almacenajes largos conservar a 20ºC o 80ºC. 5/12

6 3.4 Protocol for genomic DNA extraction from mg / mg of mouse tail. Cell lysis 1. Place 15 mm (20-30 mg) / 30 mm (40-60 mg) of mouse tail in 600 µl / 1.20 ml of lysis 2. Add 3 µl / 6.0 µ l of Proteinase K. Mix and incubate at 55ºC overnight, or until the total lysis. If possible, mix with vortex during the incubation time. RNase treatment 1. Cool tha sample to room temperature 2. Add 3 µl / 6.0 µl of RNasa to the cell lysate. 3. Mix the sample by turning the tube upside down and incubate at 37ºC for minutes. Protein precipitation 1. Add 360 µl / 720 µl of Protein precipitation 2. Mix with vortex vigorously a high speed for seconds. 3. Centrifuge at xg / xg for 5/10 minutes. The precipitated proteins will form a tight pellet. If the pellet is not visible, repeat step 3 followed by incubation on ice for 5 minutes, then repeat step 4. DNA precipitation 1. Pour the supernatant containing the DNA in a 1.5 ml tube containing 600 µl of isopropanol in a 15 ml tube containing 1.2 ml of isopropanol. Mix by turning the tube upwards several times. 2. Centrifuge at xg / xg for 3 minutes. 3. Remove the supernatant. Add 600 µl / 1.2 ml of 70% ethanol and invert tube several times to wash the DNA pellet. 4. Centrifuge at xg / xg for 2 minutes. Remove carefully all the ethanol avoiding touching the pellet. 5. Invert and drain the tube on clean absorbent paper and allow to air dry for 15 minutes DNA hydratation 1. Add µl/ µl DNA hydratation 2. Incubate at 65ºC for 1 hour, shaking to help the DNA dispersion, or incubate overnight at room temperature. 3. Storage at 2-8ºC. For long time storage, store at 20ºC o 80ºC. 3.5 Protocolo de extracción de ADN genómico a partir de 1 ml / 5 ml de cultivos de bacterias Gram(-) y Gram(+) Las bacterias Gram(+) son más difíciles de lisar es por ello que se recomienda la incubación con enzimas líticos. Para ciertas especies de Staphylococcus es necesaria una mezcla de Lisozima (10 mg/ ml) y lisostafina (10 mg / ml). Lisis celular 1. Añadir 1.0 ml / 5.0 ml de un cultivo overnight a un tubo de 1.5 ml / 15 ml 2. Centrifugar a xg / xg durante 30 segundos / 3 minutos. Eliminar el sobrenadante. Para bacterias Gram (+) continuar con el punto 3. Para bacterias Gram (-) pasar directamente al punto Resuspender las células en 540 µl / 2.7 ml de EDTA 50 mm. 4. Añadir la cantidad de enzimas líticos apropiada, 60 µl / 300 µl de Lisozima (10 mg/ml). El propósito de este tratamiento es debilitar la pared celular para hacer más eficiente la lisis celular. 5. Incubar la muestra a 37ºC durante 60 minutos. Centrifugar a xg / xg durante 2 minutos / 5 minutos. Eliminar el sobrenadante. 6. Añadir 600 µl / 3.0 ml de Solución de Lisis al pellet celular y pipetear para resuspender y lisar las células. Incubar las muestras a 80ºC durante 5 minutos. Tratamiento con RNasa 2. Enfriar la muestra a temperatura ambiente. 3. Añadir 3 µl / 15 µl de RNasa al lisado. 4. Mezclar la muestra por inversión del tubo e incubar a 37ºC durante minutos. Precipitación de proteínas 1. Añadir 300 µl / 1500 µl de Solución de precipitación de proteínas. 2. Agitar mediante vortex vigorosamente durante segundos. 3. Centrifugar a xg / xg durante 5 / 10 minutos. Se observará que el precipitado proteico forma un pellet. Precipitación del ADN 1. Pasar el sobrenadante que contiene el ADN a un tubo de 1.5 ml que contenga 600 µl de isopropanol o a un tubo de 15 ml que contenga 3 ml de isopropanol. Mezclar por inversión varias veces. 2. Centrifugar a xg / xg durante 3 minutos. 3. Eliminar el sobrenadante. Añadir 600 µl / 3 ml de etanol 70% e invertir varias veces para lavar el pellet de ADN. 4. Centrifugar a xg / xg durante 2 minutos. Eliminar todo el etanol cuidadosamente pues el pellet de ADN puede desplazarse. 5. Invertir el tubo y dejar secar en papel absorbente durante 15 minutos. Hidratación del ADN 1. Añadir 200 µl / 500 µl de Solución de Hidratación del ADN. 2. Incubar a 65ºC durante 1 hora con periódicas agitaciones para ayudar a la dispersión del 6/12

7 04/10 RBMEG01/RBMEG02/RBMEG03 ADN, o incubar overnight a temperatura ambiente para que se rehidrate. 3. Conservar a 2-8ºC. Para almacenajes largos conservar a 20ºC o 80ºC 3.5 Protocol for genomic DNA extraction from 1 ml / 5 ml bacteria Gram(-) and Gram(+) culture. Gram(+) bacteria are more difficult to lysate, for this reason we recommend the incubation with lytic enzymes. For some Staphylococcus species a Lysozime (10 mg/ ml) and lysostafine (10 mg / ml) mixture is necessary. Cell lysis 1. Add 1.0 ml / 5.0 ml of an overnight culture to a 1.5 ml / 15 ml tube. 2. Centrifuge at xg / xg for 30 seconds / 3 minutes. Remove the supernatant. For Gram (+) bacteria continue with step 3. For Gram (-) go directly to step Resuspend the cells in 540 µl / 2.7 ml of 50 mm EDTA. 4. Add the correct quantity of lytic enzymes, 60 µl / 300 µl of Lysozyme (10 mg/ml). This process makes easier the cell lysis. 5. Incubate the sample at 37ºC for 60 minutes. Centrifuge at xg / xg for 2 minutes / 5 minutes. Remove the supernatant. 6. Add 600 µl / 3.0 ml of Lysis solution to the cell pellet and use the pipettor for resuspending and lysate the cells. Incubate the samples at 80ºC for 5 minutes. RNase Treatment 1. Cool the sample at room temperature 2. Add 3 µl / 15 µl of RNase to the lysate. 3. Mix the sample turning the upside down and incubate at 37ºC for minutes. Protein precipitation 1. Add 300 µl / 1500 µl of protein precipitation 2. Mix with vortex vigorously a high speed for seconds. 3. Centrifuge at xg / xg for 5/10 minutes. The precipitated proteins will form a tight pellet. If the pellet is not visible, repeat step 3 followed by incubation on ice for 5 minutes, then repeat step 4. DNA precipitation 1. Pour the supernatant containing the DNA in a 1.5 ml tube containing 600 µl of isopropanol or in a 15 ml tube containing 3 ml of isopropanol. Mix well. 2. Centrifuge at xg / xg for 3 minutes. 3. Remove the supernatant. Add 600 µl / 3 ml of 70% ethanol and invert tube several times to wash the DNA pellet. 4. Centrifuge at xg / xg for 2 minutes. Remove carefully all the ethanol avoiding touching the pellet. 5. Invert and drain the tube on clean absorbent paper and allow to air dry for 15 minutes DNA hydratation 1. Add 200 µl / 500 µl of DNA hydratation solution 2. Incubate at 65ºC for 1 hour shaking periodically con to help the DNA dispersion, or incubate overnight at room temperature for it to rehydrate. 3. Store at 2-8ºC. For long time storage, store at 20ºC o 80ºC. 3.6 Protocolo de extracción de ADN genómico a partir de 1 ml / 5 ml de cultivos de levaduras Lisis celular 1. Añadir 1.0 ml / 5.0 ml de un cultivo crecido overnight a un tubo de 1.5 ml / 15 ml 2. Centrifugar a xg / xg durante 2 minutos / 5 minutos. Eliminar el sobrenadante. Resuspender las células en 292 µl / 2.7 ml de EDTA 50 mm. 3. Añadir la cantidad de enzimas líticos apropiada, 8 µl / 40 µl de Lyticasa (20 mg/ml). El propósito de este tratamiento es debilitar la pared celular para hacer más eficiente la lisis celular. 4. Incubar la muestra a 37ºC durante 60 minutos. Centrifugar a x g / xg durante 2 minutos / 5 minutos. Eliminar el sobrenadante. 5. Añadir 300 µl / 1.5 ml de Solución de Lisis al pellet celular y pipetear para resuspender y lisar las células. Algunas cepas pueden requerir la incubación a 65ºC durante 5 minutos. Precipitación de proteínas 1. Añadir 150 µl / 750 µl de Solución de precipitación de proteínas. 2. Agitar mediante vortex vigorosamente durante segundos. 7/12

8 3. Centrifugar a xg / x g durante 5 / 10 minutos. Se observará que el precipitado proteico forma un pellet. Precipitación del ADN 1. Pasar el sobrenadante que contiene el ADN a un tubo de 1.5 ml que contenga 300 µl de isopropanol o a un tubo de 15 ml que contenga 1.5 ml de isopropanol. Mezclar por inversión varias veces. 2. Centrifugar a xg / x g durante 3 minutos. 3. Eliminar el sobrenadante. Añadir 300 µl / 1.5 ml de etanol 70% e invertir varias veces para lavar el pellet de ADN. 4. Centrifugar a xg / x g durante 2 minutos. Eliminar todo el etanol 5. cuidadosamente pues el pellet de ADN puede desplazarse. 6. Invertir el tubo y dejar secar en papel absorbente durante 15 minutos. Hidratación del ADN 1. Añadir 50 µl / 250 µl de Solución de Hidratación del ADN. 2. Añadir 1.5 µl / 7.5 µl de RNasa. 3. Mezclar la muestra y agitar mediante vortex 1 segundo. Centrifugar para recolectar la muestra e incubar a 37ºC durante 15 minutos. 4. Incubar a 65ºC durante 1 hora con periódicas agitaciones para ayudar a la dispersión del ADN, o incubar overnight a temperatura ambiente para que se rehidrate. 5. Conservar a 2-8ºC. Para almacenajes largos conservar a 20ºC o 80ºC 3.6 Protocol for genomic DNA extraction from 1 ml / 5 ml of yeast culture Cell lysis 1. Add 1.0 ml / 5.0 ml of an overnight culture to a 1.5 ml / 15 ml tube. 2. Centrifuge at xg / xg for 2 minutes / 5 minutes. Remove the supernatant. Resuspend the cells in 292 µl / 2.7 ml of 50 mm EDTA. 3. Add the correct quantity of lytic enzymes, 8 µl / 40 µl of Lyticase (20 mg/ml). This treatment helps the cell lysis. 4. Incubate the sample at 37ºC for 60 minutes. Centrifuge at x g / xg for 2 minutes / 5 minutes. Remove the supernatant. 5. Add 300 µl / 1.5 ml of Lysis solution to the cell pellet and use the pipettor for resuspending and lyse the cells. Some strains may require at 5 minutes incubation at 65ºC. Protein precipitation 1. Add 150 µl / 750 µl of protein precipitation 2. Mix with vortex vigorously a high speed for seconds. 3. Centrifuge at xg / xg for 5/10 minutes. The precipitated proteins will form a tight pellet. DNA precipitation 1. Place the supernatant containing the DNA in a 1.5 ml tube containing 300 µl of isopropanol or in 15 ml tube containing 1.5 ml of isopropanol. Mix several times. 2. Centrifuge at xg / x g for 3 minutes. 3. Remove the supernatant. Add 300 µl / 1.5 ml of 70% ethanol and invert tube several times to wash the DNA pellet. 4. Centrifuge at xg / xg for 2 minutes. Remove carefully all the ethanol avoiding touching the pellet. 5. Invert and drain the tube on clean absorbent paper and allow to air dry for 15 minutes DNA hydratation 1. Add 50 µl / 250 µl of DNA hydratation 2. Add 1.5 µl / 7.5 µl of RNase. 3. Mix the sample and shake with vortex for 1 second. Centrifuge to collect the sample and incubate at 37ºC for15 minutes. 4. Incubate at 65ºC for 1 hour shaking to help the DNA dispersion, or incubate overnight at room temperature for it to rehydrate. 5. Store at 2-8ºC. For long time storage, store at 20ºC o 80ºC. 3.7.Protocolo para extracción de ADN genómico a partir de 5-10 mg / mg de tejidos embebidos en parafina El ADN obtenido a partir de muestras preservadas en tejidos embebidos en parafina, es generalmente de pobre calidad. Aunque es posible realizar amplificaciones de secuencias mayores de 300 pb, recomendamos la elección de primers de forma que el resultado de los productos de amplificación sea menor o igual a 300 pb. Desparafinización de la muestra 8/12 1. Preparar secciones de las cantidades indicadas de un grosor de 5-10 µm, a partir de tejidos embebidos en parafina. Si es posible eliminar el exceso de parafina 2. Colocar en un tubo de 1.5 ml y añadir 300 µl / 1 ml de xileno o Hemo-De (alternativa no tóxica de Fisher. Cat A). Agitar

9 04/10 RBMEG01/RBMEG02/RBMEG03 mediante vortex e incubar 10 minutos a temperatura ambiente. 3. Centrifugar a xg durante 3 minutos. Eliminar el sobrenadante. 4. Repetir los pasos 2 y Añadir 300 µl / 1 ml de etanol 100%. Incubar 5 minutos con constante agitación 6. Centrifugar a xg durante 3 minutos. Eliminar el sobrenadante. 7. Repetir los pasos 5 y Eliminar todo el etanol incubando el tubo abierto a 37ºC durante 15 minutos Lisis celular 1. Añadir 300µl / 900µl de Solución de lisis y 2 µl / 6 µl de Proteinasa K. 2. Mezclar e incubar a 55ºC hasta la lisis total. Si es posible, invertir o agitar mediante vortex periódicamente durante la incubación. La muestra también puede ser incubada overnight. Tratamiento con RNasa (opcional) 1. Enfriar la muestra a temperatura ambiente. 2. Añadir 1.5 µl / 4.5 µl de RNasa al lisado. 3. Mezclar la muestra por inversión del tubo e incubar a 37ºC durante minutos. Precipitación de proteínas 1. Añadir 150 µl / 450 µl de Solución de precipitación de proteínas. 2. Agitar mediante vortex vigorosamente durante segundos. 3. Centrifugar a xg durante 5 minutos. Se observará que el precipitado proteico forma un pellet. Precipitación del ADN 1. Pasar el sobrenadante que contiene el ADN a un tubo de 1.5 ml que contenga 600 µl de isopropanol o a un tubo de 2 ml que contenga 0.9 ml de isopropanol. Mezclar por inversión varias veces. 2. Centrifugar a xg durante 3 minutos. 3. Eliminar el sobrenadante. Añadir 600 µl / 0.9 ml de etanol 70% e invertir varias veces para lavar el pellet de ADN. 4. Centrifugar a xg durante 2 minutos. Eliminar todo el etanol cuidadosamente pues el pellet de ADN puede desplazarse. 5. Invertir el tubo y dejar secar en papel absorbente durante 15 minutos. Hidratación del ADN 1. Añadir 25 µl / 50 µl de Solución de Hidratación del ADN. 2. Incubar a 65ºC durante 1 hora con periódicas agitaciones para ayudar a la dispersión del ADN, o incubar overnight a temperatura ambiente para que se rehidrate. 3. Conservar a 2-8ºC. Para almacenajes largos conservar a 20ºC o 80ºC. 3.7 Protocol for genomic DNA extraction from 5-10 mg / mg of paraffin-embedded tissues The DNA obtained from paraffin embedded tissues is generally a low quality DNA.. Although it is possible to do amplifications of sequences bigger than 300 bp, we recommend choosing primers to have amplification products of 300 bp or less. Paraffin removal 1. Cut sections of the indicated quantities 5-10 µm width. 2. Place it in a 1.5 ml tube and add 300 µl / 1 ml of xilene or Hem-De (no toxic alternative to Fisher. Cat A). Shake with vortex and incubate for 10 minutes at room temperature. 3. Centrifuge at xg for 3 minutes. Remove the supernatant. 4. Repeat steps 2 and Add 300 µl / 1 ml of 100% ethanol. Incubate for 5 minutes, shaking the tube. 6. Centrifuge at xg for 3 minutes. Remove the supernatant. 7. Repeat steps 5 and Remove all the ethanol by incubating the open tube at 37ºC for 15 minutes 9/12 Cell Lysis 1. Add 300µl / 900µl of Lysis solution and 2 µl / 6 µl of Proteinase K. 2. Mix and incubate at 55ºC until the total lysis. If possible, shake periodically with vortex during the incubation. The sample can also be incubated overnight. RNase Treatment (optional) 1. Cool the sample at room temperature. 2. Add 1.5 µl / 4.5 µl of RNase to the lysate. 3. Mix the sample by turning the tube upside down and incubate at 37ºC for minutes. Protein precipitation 1. Add 150 µl / 450 µl of Protein precipitation 2. Mix with vortex vigorously for seconds. 3. Centrifuge at xg for 5 minutes. The precipitated proteins will form a tight pellet. DNA precipitation 1. Put the supernatant containing the DNA in a 1.5 ml tube containing 600 µl of isopropanol or

10 in 2 ml tube containing 0.9 ml of isopropanol. Mix turn the tube upside down. 2. Centrifuge at xg for 3 minutes. 3. Remove the supernatant. Add 600 µl / 0.9 ml of 70% ethanol and invert tube several times to wash the DNA pellet. 4. Centrifuge at xg for 2 minutes. Remove carefully all the ethanol avoiding touching the pellet. 5. Invert and drain the tube on clean absorbent paper and allow to air dry for 15 minutes DNA hydratation 1. Add 25 µl / 50 µl DNA hydratation solution 2. Incubate at 65ºC for 1 hour shaking periodically to help the DNA dispersion, or incubate overnight at room temperature for it to rehydrate. 3. Store at 2-8ºC. For long time storages, store at 20ºC o 80ºC. 3.8 Protocolo de extracción de ADN genómico a partir de 3-5 millones / millones de células en cultivo. Previamente a la extracción, determinar el número de células con un hemocitómetro u otro contador de células. Las células que crecen en una monocapa pueden ser recogidas por scraping o por tripsinización. Aunque este protocolo recomienda el método de srcaping : Eliminar el medio. Lavar con PBS 1x. Recoger las células por scraping con 2ml de PBS y con la ayuda de un rubber policeman Lisis celular 1. Añadir 3-5 millones de células en PBS o medio de cultivo directamente a un microtubo de 1.5 ml. O añadir millones de células en PBS o medio de cultivo directamente a un tubo de 15 ml 2. Centrifugar a xg / 500 xg para precipitar las células durante 10 segundos / 3 minutos. Eliminar el sobrenadante dejando µl / µl de líquido residual. 3. Agitar mediante vortex vigorosamente para resuspender las células en el sobrenadante residual. 4. Añadir 600µl / 6 ml de Solución de lisis, y pipetear para lisar las células. 5. Incubar a 55ºC durante 15 minutos. Tratamiento con RNasa (opcional) 1. Añadir 1.5 µl / 4.5 µl de RNasa al lisado. 2. Mezclar la muestra por inversión del tubo e incubar a 37ºC durante minutos. Precipitación de proteínas 1. Añadir 360 µl / 3.6 ml de Solución de precipitación de proteínas. 2. Agitar mediante vortex vigorosamente durante segundos. 3. Centrifugar a xg / xg durante 5 / 10 minutos. Se observará que el precipitado proteico forma un pellet. Precipitación del ADN 1. Pasar el sobrenadante que contiene el ADN a un tubo de 1.5 ml que contenga 600 µl de isopropanol o a un tubo de 15 ml que contenga 6 ml de isopropanol. Mezclar por inversión varias veces. 2. Centrifugar a xg / xg durante 3 minutos. 3. Eliminar el sobrenadante. Añadir 600 µl / 6 ml de etanol 70% e invertir varias veces para lavar el pellet de ADN. 4. Centrifugar a xg / xg durante 2 minutos. Eliminar todo el etanol cuidadosamente pues el pellet de ADN puede desplazarse. 5. Invertir el tubo y dejar secar en papel absorbente durante 15 minutos. Hidratación del ADN 1. Añadir 100 µl / 500 µl de Solución de Hidratación del ADN. 2. Incubar a 65ºC durante 1 hora con periódicas agitaciones para ayudar a la dispersión del ADN, o incubar overnight a temperatura ambiente para que se rehidrate. 3. Conservar a 2-8ºC. Para almacenajes largos conservar a 20ºC o 80ºC. 3.8 Protocol for genomic DNA extraction from 3-5 millions / millions of cell culture. Before the extraction, determine the number of cell using a hemocitometer or other cell counter. Cells growing in a monolayer can be collected by scraping or by tripsinitation. This protocol recommends the scraping method: Remove the medium. Wash with PBS 1x. Collect the cells by scraping with con 2ml of PBS and with the help of a rubber policeman Cell lysis 1. Add 3-5 millions of cells in PBS or culture medium, directly to a 1.5 ml microtube. Or add millions of cells in PBS or culture medium directly to a 15 ml tube. 10/12

11 04/10 RBMEG01/RBMEG02/RBMEG03 2. Centrifuge at xg / 500 xg to precipitate the cells for 10 seconds / 3 minutes. Remove the supernatant, leaving µl / µl of residual liquid. 3. Vortex vigorously to resuspend the cells in the residual supernatant. 4. Add 600µl / 6 ml of Lysis Solution and pipet up and down to lyse the cells. 5. Incubate at 55ºC for 15 minutes. Treatment with RNase (optional) 1. Add 1.5 µl / 4.5 µl of RNase to the lysate. 2. Mix the simple by turning the tube upside down and incubate at 37ºC for minutes. Protein precipitation 1. Add 360 µl / 3.6 ml of protein precipitation 2. Mix with vortex vigorously a high speed for seconds. 3. Centrifuge at xg / xg for 5/10 minutes. The precipitated proteins will form a tight pellet. If the pellet is not visible, repeat step 3 followed by incubation on ice for 5 minutes, then repeat step 4. DNA precipitation 1. Put he supernatant containing the DNA into a 1.5 ml tube with 600 µl of isopropanol or in a tube of 15 ml containing 6 ml of isopropanol. Mix it well by turning the tube upside down several. 2. Centrifuge at xg / xg for 3 minutes. 3. Remove the supernatant. Add 600 µl / 6 ml of 70% ethanol and and invert tube several times to wash the DNA pellet. 4. Centrifuge at xg / xg for 2 minutes. Remove carefully all the ethanol avoiding touching the pellet. 5. Invert and drain the tube on clean absorbent paper and allow to air dry for 15 minutes. DNA hydratation 1. Add 100 µl / 500 µl of DNA Hydratation Solution. 2. Incubate at 65ºC for 1 hour shaking it periodically to help DNA dispersion, or incubate overnight at room temperature to rehydrate it. 3. Storage at 2-8ºC. For long storages, store at 20ºC o 80ºC Tabla de volúmenes de reactivos escalados desde 1-2millones hasta 500 millones de células Scaled reactive volumes table from 1-2 millions to 500 millions of cells Número de Células (en millones) Cell Number (in millions) Tamaño del Tubo Tube size Tampón de Lisis REALPURE REALPURE Lysis Buffer RNasa RNase Solución de Precipitación de Proteínas Protein Precipitation Solution Isopropanol Isopropanol Solución de Hidratación del ADN DNA Hydratation Solution ml 1.5 ml 15 ml 15 ml 15 ml 50 ml 250 ml 0.3 ml 0.6 ml 1.5 ml 3.0 ml 6.0 ml 15 ml 75 ml 1.5 µl 3.0 µl 7.5 µl 15 µl 30 µl 75 µl 375 µl 0.18 ml 0.36 ml 0.9 ml 1.8 ml 3.6 ml 9 ml 45 ml 0.3 ml 0.6 ml 1.5 ml 3.0 ml 6.0 ml 15 ml 75 ml µl µl µl µl µl 500 µl 2500 µl 11/12

12 4. GUIA DE PROBLEMAS Y POSIBLES SOLUCIONES TROUBLESHOOTING Dada la gran variedad de muestras que se pueden tratar para extraer ADN genómico con este kit se hace difícil poder generalizar los posibles problemas y soluciones. Es por ello, que recomendamos que no duden en ponerse en contacto con el servicio técnico del laboratorio REAL para cualquier consulta adicional respecto a los protocolos de trabajo o problemas que puedan surgir durante el trabajo. Due to the large sample variety that can be treated to obtain genomic DNA using this kit, it is difficult to generalize possible problems and their This is why we recommend contacting REAL s laboratory technical service for any additional question about work protocols or any problem that may appear while you are working. 12/12