HIGH PURITY REALPLASMID KIT

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1 HIGH PURITY REALPLASMID KIT Ref. RBMEPS04 MIDIPREP KIT 25 Preps. Ref. RBMEPS05 MAXIPREP KIT 10 Preps. 1. INTRODUCCIÓN 1. INTRODUCTION Sistema de producción certificado bajo norma ISO HIGH PURITY REALPLASMID Midi/Maxiprep Kit ofrece un método simple para la extracción de ADN plasmídico a partir de cultivos recombinantes de E.coli desde 25ml hasta 100 ml. Este kit combina un método modificado de lisis alcalina conjuntamente con columnas de intercambio aniónico para aislar ADN plasmídico de elevada pureza con un grado para transfección a partir de lisados bacterianos. Durante el paso de lisis, tanto el ADN cromosómico con el plasmídico son desnaturalizados. Se añade acetato potásico para formar un precipitado neutralizado que contiene el ADN cromosómico y otros componentes celulares. El ADN plasmídico permanece en solución pasando a su forma nativa superenrollada, y luego es pasado a través de una columna equilibrada de intercambio aniónico.. El ADN plasmídico se une a la resina de intercambio aniónico y luego es eluido de la columna después de varios lavados. El ADN plasmídico eluido es precipitado y fácilmente resuspendido en TE o agua libre de nucleasas. El ADN plasmídico purificado es útil en la mayoría de aplicaciones de biología molecular, incluyendo transfección, transcripción in vitro, secuenciación manual y automática, clonaje, hibridación y PCR. HIGH PURITY REALPLASMID Midi/Maxiprep Kit offers a simple method for isolating plasmid DNA from ml of recombinant E.coli cultures. This kit combines a modified alkaline lysis method with the convenience of anion-exchange columns to isolate high purity transfection grade plasmid DNA from bacterial cell lysates. During the cell lysis step, both chromosomal and plasmid DNA are denatured. Potassium acetate is added to form a neutralized precipitate containing chromosomal DNA and other cellular components. Plasmid DNA remains in the solution, reverts to its native supercoiled structure, and is then loaded onto an equilibrated anion-exchange column. The plasmid DNA becomes bound to the anionexchange resin and is then eluted from the column with washing steps. Eluted DNA is precipitated and easily dissolved in TE buffer or nuclease-freewater. The purified plasmids are suitable for use in the most demanding molecular biology applications, including transfection, in vitro transcription, automated or manual sequencing, cloning, hybridization and PCR Production system certified under ISO 1/7

2 2. COMPONENTES DEL KIT KIT COMPONENTS Solución de Resuspensión Resuspension Solution Solución de Lisis Lysis Solution Solución de Neutralización Neutralization Solution Tampón de Equilibración Equilibration Buffer Solución de Lavado Wash Solution Tampón de Elución Elution Buffer RNasa A (50mg/ml) RNase A (50 mg/ml) Columnas Midi/Maxi Midi/Maxi Columns Filtros Plegados Folded Filters Ref. Ref. RBMEPS04 25 Midipreps Ref. RBMEPS05 10 Maxipreps PM1 110 ml 110 ml 4ºC PM2 110 ml 110 ml RT PM3 110 ml 110 ml 4ºC PEQ 130 ml 130 ml RT PW 360 ml 360 ml RT PEL 220 ml 130 ml RT PRN 200 µl 200 µl 4ºC PC 25 unid. 10 unid. RT PFF 25 unid. 10 unid. RT Tª Equipos y reactivos necesarios no incluidos en el kit: * Etanol 70 %. * Centrífuga y tubos para recolectar cultivos bacterianos y precipitar ADN aptos para velocidades > xg * Tubos para recoger y precipitar el ADN plasmídico eluido * Isopropanol 100% * Tampón TE Equipment and additional reagents required * 70 % Ethanol * Centrifuge and tubes for harvesting bacterial cultures, and precipitate DNA, capable to spin speed of > xg * Tubes for collecting and precipitating eluted plasmid DNA * 100 % Isopropanol * TE Buffer 3. PROTOCOLO GENERAL GENERAL PROCEDURE 3.1 Consideraciones preliminares Varios factores pueden influir en la obtención del ADN plasmídico. Estos incluyen el número de copias de vector, el inserto de ADN, la cepa huésped, condiciones de crecimiento y el medio. 3.1 Preliminary conditions Several factors can interfere in the plasmid DNA obtaining. These include the number of vector copies, the DNA insert, the host cell, growing conditions and medium. Capacidad de Unión. Binding Capacity Volumen de Cultivo para plásmidos High copy High-copy plasmids culture volume Volumen de Cultivo para plásmidos Low copy Low-copy plasmids culture volume MIDIPREP MAXIPREP 100 µg 500 µg 25 ml 100 ml 100 ml 500 ml 2/7

3 3.2 Preparaciones preliminares Añadir la RNasa suministrada al Tampón de Resuspensión PM1 y conservar a 4ºC. Verificar que la Solución de Lisis PM2 no tiene SDS precipitado debido a las bajas temperaturas. Si es necesario, disolver el SDS calentando a 37ºC. 3.2 Preliminary Preparations Add provided RNase A to the PM1 Solution and store at 4ºC. Verify that the Lysis Solution PM2 does not contain precipitated SDS due to the low temperatures. If necessary, dissolve the SDS heating at 37 C Protocolo de extracción de ADN plasmídico a partir de Plásmidos HIGH-COPY ( > 20 copias/célula). Midiprep (5-25 ml) / Maxiprep ( ml) 1. Preparar un cultivo bacteriano: Empezar aislando una colonia bacteriana a partir de una placa e inocular un cultivo iniciador de 2-5 ml de caldo LB que contenga el antibiótico apropiado. Incubar durante aproximadamente 8h a 37ºC con agitación constante (aprox.300 rpm). Diluir el cultivo iniciador 1/500 o 1/1000 en un medio selectivo, crecer a 37ºC durante horas con agitación constante (aprox.300 rpm). 2. Recolectar las células bacterianas centrifugando a 6,000 x g durante 15 min at 4 C. Cuidadosamente descartar el sobrenadante. 3. Lisis Celular: 3.1. Resuspender el pellet bacteriano en 4 ml / 10 ml de Tampón de Resuspensión (+Rnasa A), (PM1) asegurándose de la completa resuspensión de las células. Una incompleta resuspensión en este paso producirá un bajo rendimiento de ADN. Utilizar un tubo de centrífuga capaz de soportar altas velocidades Añadir 4 ml / 10 ml de Tampón de Lisis (PM2) a la suspensión. Suavemente invertir el tubo 8-10 veces hasta que la mezcla aparezca clara y viscosa. No utilizar vortex. Se puede incubar 3 minutos, pero nunca más de 5 minutos Añadir 4 ml / 10 ml de Tampón de Neutralización (PM3) (4 C) a la suspensión. Suavemente invertir el tubo 8-10 veces hasta que se forme una suspensión homogénea que contenga un floculado blanco. Se recomienda la incubación durante minutos en hielo. Equilibrar la columna durante este periodo de tiempo. 4. Equilibrar la columna: Equilibrar una MIDI / MAXI Columna con 5 ml / 10 ml de Tampón de Equilibración (PEQ). Permitir que la columna se llene por gravedad y eliminar el líquido que fluye a través de la columna. 5. Clarificar el lisado, siguiendo una de las dos opciones, Opción 1 u Opción 2, descritas a continuación. Este paso es extremadamente importante; un exceso de flóculos en la suspensión puede obturar la columna en los siguientes pasos Opcion 1: Filtrar la suspensión. Colocar un filtro plegado (PFF) en un pequeño embudo, humedecer el filtro con algunas gotas de Tampón de equilibración o agua libre de nucleasas. Añadir el lisado bacteriano y recoger el líquido que fluye en un tubo libre de nucleasas. Este método produce un lisado limpio pero el rendimiento de ADN plasmídico puede ser menor que con el método de centrifugación aunque es un método más rápido y sin flóculos residuales Opcion 2: Centrifugar la suspensión. Centrifugar a >15,000 x g durante 30 min / 40 min a 4 C. Si la suspensión contiene floculados residuales después de la primera centrifugación, repetir este paso. 6. Unir el ADN plasmídico a la columna: Añadir el lisado clarificado del paso 5 a la columna equilibrada. Permitir que el líquido fluya por gravedad. 7. Lavar la columna con 12 ml / 36 ml de Tampón de Lavado (PW). Eliminar el líquido que fluye a través de la columna. 8. Eluir el ADN plasmídico con 8 ml / 12 ml de Tampón de Elución (PEL) y recolectar la muestra por gravedad en un tubo de centrifugación libre de nucleasas. Precipitar el eluido tan pronto como sea posible, de todas formas, puede ser almacenado a 4ºC durante varias horas. En este caso, es muy importante que el eluido alcance la temperatura ambiente antes de la precipitación del ADN plasmídico 3/7

4 9. Precipitar el ADN: Añadir 6 ml / 9 ml de isopropanol para precipitar el ADN plasmídico. Mezclar con cuidado y centrifugar a 15,000 x g durante 30 min a 4 C. Cuidadosamente eliminar el sobrenadante para no perder ADN plasmídico. 10. Lavar y secar el pellet de ADN: Añadir 2 ml / 5 ml de 70% etanol a temperatura ambiente al pellet. Agitar mediante vortex brevemente y centrifugar a 15,000 x g durante 10 min. Cuidadosamente eliminar todo el etanol del tubo con una punta de pipeta. Dejar secar el pellet min a temperatura ambiente (20-25 C). No sobresecar el pellet ya que sino el ADN será difícil de resuspender. 11. Resuspender el ADN: Redisolver el pellet de ADN plasmídico en una cantidad apropiada de TE o agua libre de nucleasas con constante y suave agitación durante minutos o redisolver el pellet lavando las paredes para recuperar todo el ADN plasmídico, especialmente si se utilizan tubos de vidrio para centrifugar. 3.3 Protocol for plasmid DNA extraction from HIGH-COPY PLASMID (> 20 copies/cell). Midiprep (5-25 ml) / Maxiprep ( ml) 1. Prepare an overnight culture: Begin with an isolated bacterial colony from a fresh plate and inoculate a starter culture of 2-5 ml LB medium containing the appropriate antibiotic(s). Incubate for approx. 8 h at 37ºC Dilute the starter culture 1/500 to 1/1000 into selective medium, grow at 37ºC for h 2. Harvest bacterial cells from an LB culture by centrifugation at 6,000 x g for 15 min at 4 C. 3. Cell Lysis: 3.1. Resuspend the pellet of bacterial cells in 4 ml / 10 ml of Resuspension Buffer (+ RNase A) (PM1) Add 4 ml / 10 ml of Lysis Buffer (PM2) to the suspension. Mix gently by inverting the tube 6-8 times. Incubate the mixture at room temperature (20-25 C) for 3 min (max 5 min). Do not vortex since this will release contaminating chromosomal DNA from the cellular debris into the suspension Add 4 ml / 10 ml of pre-cooled Neutralization Buffer (PM3) (4 C) to the suspension. Immediately mix the lysate by gently inverting the tube 6-8 times until a homogeneous suspension containing an off-white flocculate is formed. Incubate the suspension on ice for min. Equilibrate the column during this time. 4. Equilibrate the column: Equilibrate a MIDI / MAXI Column with 5 ml / 10 ml of Equilibration Buffer (PEQ). Allow the column to empty by gravity flow. Discard the flow-through. 5. Clarify the lysate: Clear the bacterial lysate by following either Option 1 or Option 2 described below. This step is extremely important; excess flocculate left in the suspension may clog the Column in later steps Option 1: Filter the suspension. Place Folded Filter (PFF) in a small funnel for support and pre-wet the filter with a few drops of Equilibration Buffer or nucleasefree H2O. Load the bacterial lysate onto the pre-wet filter and collect the flowthrough into a clean, nuclease-free tube. This method produces a clean lysate but the yield of plasmid DNA can be e smaller than with the centrifugation method Option 2: Centrifuge the suspension. Centrifuge at >15,000 x g for 30 min / 40 min at 4 C. If the suspension contains residual flocculate after the first centrifugation, repeat this step. 6. Bind plasmid to column: Load the cleared lysate from Step 5 onto the equilibrated Column. Allow the column to empty by gravity flow. 7. Wash the column with 12 ml / 36 ml of Wash Buffer (PW). Discard flow-through. 8. Elute the plasmid DNA with 8 ml / 12 ml of Elution Buffer (PEL) and collect the sample by gravity flow into a clean, nuclease-free tube. Precipitate the elute as soon as possible, however, it may be stored in a closed tube at 4 C for several hours. In this case, it is very important to pre-warm the elute to room temperature before the plasmid DNA is precipitated. 9. Precipitate DNA: Add 6 ml / 9 ml of roomtemperature isopropanol to precipitate the eluted plasmid DNA. Mix carefully and centrifuge at 15,000 x g for 30 min at 4 C. 10. Wash and dry DNA pellet: Add 2 ml / 5 ml of room-temperature 70% ethanol to the pellet as indicated below. Vortex briefly and centrifuge at 15,000 x g for 10 min. Carefully remove ethanol from the tube with a pipette tip. Allow the pellet to air dry min at room temperature (20-25 C), no less than the indicated time. Do not over-dry the pellet as the DNA will become difficult to resuspend. 11. Resuspend DNA in an appropriate volume of TE Buffer or nuclease free H2O with constant, gentle shaking for min or redissolve the DNA pellet by rinsing the walls to recover all the DNA, especially if glass tube has been used. 4/7

5 3.4 Protocolo de extracción de ADN plasmídico a partir de Plásmidos LOW-COPY ( < 20 copias/célula). Midiprep ( ml) / Maxiprep ( ml) Si se trabaja con vectores low copy, será beneficioso incrementar el volúmenes de los tampones para aumentar la eficiencia de la lisis alcalina y de esta forma el rendimiento del ADN palsmídico. Si se necesita cantidades adicionales de tampones, sus composiciones se suministran en el apéndice A. 1. Preparar un cultivo bacteriano: Empezar aislando una colonia bacteriana a partir de una placa e inocular un cultivo iniciador de 2-5 ml de caldo LB que contenga el antibiótico apropiado. Incubar durante aproximadamente 8h a 37ºC con agitación constante (aprox.300 rpm). Diluir el cultivo iniciador 1/500 o 1/1000 en un medio selectivo, crecer a 37ºC durante horas con agitación constante (aprox.300 rpm). 2. Recolectar las células bacterianas, centrifugando a 6,000 x g durante 15 min. a 4 C. Cuidadosamente descartar el sobrenadante. 3. Lisis Celular: 3.1. Resuspender el pellet bacteriano en 8 ml / 24 ml de Tampón de Resuspensión (+Rnasa A) (PM1), asegurándose de la completa resuspensión de las células. Una resuspensión incompleta en este paso producirá un bajo rendimiento de ADN. Utilizar un tubo de centrífuga capaz de soportar altas velocidades Añadir 8 ml / 24 ml de Tampón de Lisis (PM2) a la suspensión. Suavemente invertir el tubo 8-10 veces hasta que la mezcla aparezca clara y viscosa. No utilizar vortex. Se puede incubar 3 minutos, pero nunca más de 5 minutos Añadir 8 ml / 24 ml de Tampón de Neutralización (PM3) (4 C) a la suspensión. Suavemente invertir el tubo 8-10 veces hasta que se forme una suspensión homogénea que contenga un floculado blanco. Se recomienda la incubación durante minutos en hielo. Equilibrar la columna durante este periodo de tiempo. 4. Equilibrar la columna: Equilibrar una MIDI / MAXI Columna con 5 ml / 10 ml de tampón de Equilibración (PEQ). Permitir que la columna se llene por gravedad y eliminar el líquido que fluye a través de la columna. 5. Clarificar el lisado siguiendo una de las 2 opciones, Opción 1 o Opción 2 descritas a continuación. Este paso es extremadamente importante; un exceso de flóculos en la suspensión puede obturar la columna en los siguientes pasos Opcion 1: Filtrar la suspensión. Colocar un filtro plegado (PFF) en un pequeño embudo, humedecer el filtro con algunas gotas de Tampón de equilibración o agua libre de nucleasas. Añadir el lisado bacteriano y recoger el líquido que fluye en un tubo libre de nucleasas. Este método produce un lisado limpio pero el rendimiento de ADN plasmídico puede ser menor que con el método de centrifugación aunque es un método más rápido y sin flóculos residuales Opcion 2: Centrifugar la suspensión. Centrifugar a >15,000 x g durante 30 min / 40 min a 4 C. Si la suspensión contiene floculados residuales después de la primera centrifugación, repetir este paso. 6. Unir el ADN plasmídico a la columna: Añadir el lisado clarificado del paso 5 a la columna equilibrada. Permitir que el líquido fluya por gravedad. 7. Lavar la columna con 12 ml / 30 ml de Tampón de Lavado (PW). Eliminar el líquido que fluye a través de la columna. 8. Eluir el ADN plasmídico con 8 ml / 12 ml de Tampón de Elución (PEL) y recolectar la muestra por gravedad en un tubo de centrifugación libre de nucleasas. Precipitar el eluido tan pronto como sea posible, de todas formas, puede ser almacenado a 4ºC durante varias horas. En este caso, es muy importante que el eluido alcance la temperatura ambiente antes de la precipitación del ADN plasmídico 9. Precipitar el ADN: Añadir 6 ml / 9 ml de isopropanol para precipitar el ADN plasmídico. Mezclar con cuidado y centrifugar a 15,000 x g durante 30 min a 4 C. Cuidadosamente eliminar el sobrenadante para no perder ADN plasmídico. 10. Lavar y secar el pellet de ADN: añadir 2 ml / 5 ml de 70% etanol al pellet, agitar mediante votex brevemente y centrifugar a 15,000 x g durante 10 min. Cuidadosamente eliminar todo el etanol del tubo con una punta de pipeta. Dejar secar el pellet min a temperatura ambiente (20-25 C). No sobresecar el pellet ya que sino el ADN seré difícil de resuspender. 11. Resuspender el ADN: Redisolver el pellet de 5/7

6 ADN plasmídico en una cantidad apropiada de TE o agua libre de nucleasas con constante y suave agitación durante minutos o redisolver el pellet lavando las paredes para recuperar todo el ADN plasmídico, especialmente si se utilizan tubos de vidrio para centrifugar. 3.4 Protocol for plasmid DNA extraction from LOW-COPY PLASMID (< 20 copies/cell). Midiprep ( ml) / Maxiprep ( ml) If working with low-copy vectors, it may be beneficial to increase the lysis buffer volumes in order to increase the efficiency of alkaline lysis, and thereby the DNA yield. In case additional Buffers are needed, their compositions are provided en Appendix A 1. Prepare an overnight culture: Begin with an isolated bacterial colony from a fresh plate and inoculate a starter culture of 2-5 ml LB medium containing the appropriate antibiotic(s). Incubate for approx. 8 h at 37ºC Dilute the starter culture 1/500 to 1/1000 into selective medium, grow at 37ºC for h 2. Harvest bacterial cells from an LB culture by centrifugation at 6,000 x g for 15 min at 4 C. 3. Cell Lysis: 3.1. Resuspend the pellet of bacterial cells in 8 ml / 24 ml of Resuspension Buffer (+ RNase A) (PM1) Add 8 ml / 24 ml of Lysis Buffer (PM2) to the suspension. Mix gently by inverting the tube 6-8 times. Incubate the mixture at room temperature (20-25 C) for 2 3 min (max 5 min). Do not vortex since this will release contaminating chromosomal DNA from the cellular debris into the suspension Add 8 ml / 24 ml of pre-cooled Neutralization Buffer (PM3) (4 C) to the suspension. Immediately mix the lysate by gently inverting the tube 6-8 times until a homogeneous suspension containing an off-white flocculate is formed.incubate the suspension on ice for 5 min. Equilibrate the column during this time. 4. Equilibrate the column: Equilibrate a MIDI / MAXI Column with 5 ml / 10 ml of Equilibration Buffer (PEQ) Allow the column to empty by gravity flow. Discard the flowthrough. 5. Clarify the lysate: Clear the bacterial lysate by following either Option 1 or Option 2 described below. This step is extremely important; excess flocculate left in the suspension may clog the Column in later steps Option 1: Filter the suspension. Place Folded Filter (PFF) in a small funnel for support and pre-wet the filter with a few drops of Equilibration Buffer or nucleasefree H2O. Load the bacterial lysate onto the pre-wet filter and collect the flowthrough into a clean, nuclease-free tube. This method produce a clean lysate but the yield of plasmid DNA can be e smaller than with the centrifugation method Option 2: Centrifuge the suspension. Centrifuge at >12,000 x g for 30 min / 40 min at 4 C. If the suspension contains residual flocculate after the first centrifugation, repeat this step. 6. Bind plasmid to column: Load the cleared lysate from Step 5 onto the equilibrated Column. Allow the column to empty by gravity flow. 7. Wash the column with 12 ml / 30 ml of Wash Buffer (PW). Discard flow-through. 8. Elute DNA with 8 ml / 12 ml of Elution Buffer (PEL) and collect the sample by gravity flow into a clean, nuclease-free tube. Precipitate the elute as soon as possible, however, it may be stored in a closed tube at 4 C for several hours. In this case, it is very important to prewarm the elute to room temperature before the plasmid DNA is precipitated. 9. Precipitate DNA: add 6 ml / 9 ml of roomtemperature isopropanol to precipitate the eluted plasmid DNA. Mix carefully and centrifuge at 15,000 x g for 30 min at 4 C. 10. Wash and dry DNA pellet: add 2 ml / 5 ml of room temperature 70% ethanol to the pellet. Vortex briefly and centrifuge at 15,000 x g for 10 min. Carefully remove ethanol from the tube with a pipette tip. Allow the pellet to air dry min at room temperature (20-25 C), no less than the indicated time. Do not overdry the pellet as the DNA will become difficult to resuspend. 11. Resuspend DNA: Redissolve the DNA pellet in an appropriate volume of TE Buffer or nuclease free H2O with constant, gentle shaking for min or redissolve the DNA pellet by rinsing the walls to recover all the DNA, especially if glass tube have been used. 6/7

7 APENDICE A: Tampón de resuspensión: 50mM Tris-HCl, ph 8.0; 10 mm EDTA; 100 µg Rnasa A. Disolver 6.06 gr Tris base, 3.72 gr Na 2 EDTA.2H 2 0 en 800 ml agua destilada. Ajustar el ph a 8.0 con HCl. Ajustar el volumen a un 1 litro con agua destilada. Añadir 100 µg Rnasa A. Tampón de Lisis: 200 mm NaoH, 1% SDS (w/v) Disolver 8.0 gr NaOH pellets en 950 ml agua destilada y añadir 50 ml de una solución de SDS 20% (w/v). El volumen final debería ser de 1 litro. Tampón de Neutralización: 3.0 M acetato de potasio, ph 5.5 Disolver gr acetato potásico en 500 ml agua destilada. Ajustar el ph a 5.5 con glacial ácido acético glacial (aprox 110 ml). Ajustar el volumen a 1 litro con agua destilada. APPEDIX A: Resuspension Buffer: 50mM Tris-HCl, ph 8.0; 10 mm EDTA; 100 µg Rnase A. Dissolve 6.06 gr Tris base, 3.72 gr Na 2 EDTA.2H 2 0 in 800 ml distilled water. Adjust the ph to 8.0 with HCl. Adjust the volume to 1 litre with distilled water. Add 100 µg Rnase A. Lysis Buffer: 200 mm NaoH, 1% SDS (w/v) Dissolve 8.0 gr NaOH pellets in 950 ml distilled water and add 50 ml of a 20% SDS (w/v) solution. The final volume should be 1 litre. Neutralization Buffer: 3.0 M potassium acetate, ph 5.5 Dissolve gr potassium acetate in 500 ml distilled water. Adjust the ph to 5.5 with glacial acetic acid (approx 110 ml). Adjust the volume to 1 litre with distilled water. 7/7