REALPURE SALIVA KIT. Ref. RBMEG06 50 Preps. Ref. RBMEG Preps. 1. INTRODUCCIÓN 1. INTRODUCTION 06/15 RBMEG06/RBMEG07

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1 06/15 RBMEG06/RBMEG07 REALPURE SALIVA KIT Ref. RBMEG06 50 Preps. Ref. RBMEG Preps. 1. INTRODUCCIÓN 1. INTRODUCTION RealPure Kit provee un método para la extracción de ADN genómico de alta calidad a partir de: * Muestras de saliva directa * Muestras de frotis bucales con cepillos de espuma Ref. RBMESC01 * Muestras de saliva recolectadas con el REALSALIVA DNA Sample Collection Kit. Ref. RBMSAL01 * Muestras de saliva recolectadas con el ORAGENE self collection kits (DNAGenotek). Es un método rápido, seguro y económico. Utiliza un paso de desproteinización con un novedoso tampón salino evitando el uso de disolventes orgánicos tóxicos como fenol o cloroformo. En el caso de la saliva, la obtención de ADN en un mismo individuo presenta una variabilidad intrasujeto, es decir, no existe una cantidad aproximada de ADN / ml ya que puede variar según el momento de la recogida de la muestra, dándose el caso de que no se obtenga una gran cantidad de ADN y no se puedan llevar a cabo aplicaciones posteriores que requieren gran cantidad de ADN. Kit designed for an efficient and fast purification of highly pure genomic DNA from a wide variety of saliva samples including: *Saliva samples. *Buccal cell samples via buccal swabs from DURVIZ. Ref. RBMESC01 *Saliva samples via REALSALIVA DNA Sample Collection Kit. Ref. RBMSAL01 *Saliva samples via ORAGENE self collection kits (DNAGenotek). It is a fast, save and economical method. The protocol includes a deproteination step using a new saline buffer, avoiding the use of toxic organic solvents such as phenol or chlorophorm. DNA obtained from one only person shows an intra-subject variability, this is, there is not an estimated DNA/ ml quantity as it can change depending on the moment of collecting the sample. It may happen that the obtained DNA quantity is not very big and it will not be possible to carry on with later applications which need a big amount of DNA. 1/10

2 2. COMPONENTES DEL KIT KIT COMPONENTS Ref. Ref. RBMEG06 50 preps Ref. RBMEG preps Tampón de Lisis Lysis Solution E21 40 ml 105 ml Tªambiente Tampón de Precipitación de proteínas Protein Precipitation Solution E23M 15 ml 40 ml Tªambiente Tampón de Hidratación DNA Hydratation Solution E24 40 ml 50 ml Tªambiente RNasa ( 10mg/ml) RNase (10mg/ml) E l 800 l -20ºC Proteinasa K (20mg/ml) Proteinase K (20mg/ml) E l 800 l -20ºC Tª TIPOS DE MUESTRAS Ref. RBMEG06 Ref. RBMEG l de saliva directa 50 extracciones 160 extracciones ( Frotis bucales con cepillos de espuma Ref. RBMESC01 REALSALIVA DNA Sample Collection Kit. Ref. RBMSAL01 ORAGENE self collection kits (DNAGenotek) 50 extracciones 160 extracciones 20 extracciones 50 extracciones 10 extracciones 25 extracciones Equipos y reactivos necesarios no incluidos en el kit: Isopropanol. Etanol 70%. Microtubos de 1.5 ml, tubos de centrifuga de 15 o 50 ml. Microcentrifuga o centrifuga clínica. Vortex. Baño de agua.. Equipment and additional reagents required Isopropanol. 70%Ethanol. 1.5 ml and 2.0 ml microtubes, 15 or 50 ml centrifuge tubes. Microcentrifuge or clinic centrifuge. Vortex. Water bath. 2/10

3 06/15 RBMEG06/RBMEG07 3. PROTOCOLO GENERAL GENERAL PROCEDURE 3.1 Consideraciones preliminares 3.1 Preliminary conditions Las muestras de saliva se han de recoger antes de las comidas, lavarse la boca con agua y esperar unos 30 minutos para recoger la muestra.. Rinse the mouth with water and do not eat, drink, smoke or chew gum 30 before collecting saliva. Relax and gently massage cheek for 30 seconds to help saliva producing. Las muestras de saliva directa deben ser procesadas, o mantener a 4º C si serán procesadas en menos de 2 horas. Direct Saliva samples must be processed, or stored at 4 C if Sern processed in less than 2 hours * Si la Solución de Lisis contiene un precipitado debido a las bajas temperaturas, incubar a 37ºC y mezclar para disolver el precipitado. * If the lysis solution contains a precipitate due to the low temperatures, incubate at 37ºC and mix to dissolve the precipitate 3.2 Extracción a partir de muestras de 600 l de saliva directa Lisis Celular 1.Centrifugar 600 l de saliva durante 90 segundos a x g. Eliminar el sobrenadante con pipeta sin dañar el pellet visible de células. 2. Añadir 600 l de Tampón de Lisis + 5 l de Proteinasa K (20 mg/ml) + 5 l de RNasa y resuspender mediante pipeta para lisar las células. 3. Incubar a 37º C durante minutos. Si es posible vortex periódicamente durante el periodo de incubación. Precipitación proteica. 1. Dejar enfriar las muestras 10min a 4ºC 2. Añadir 200 l de Tampón de Precipitación proteínas al lisado celular. 3.Vortex vigorosamente a máxima velocidad durante segundos. 4.Centrifugar a x g durante 5 minutos. Se formará un precipitado. Si se observan partículas flotando volver a centrifugar después de incubar 5 minutos en hielo. 3.2 Extraction from samples of 600 l de saliva Cell Lysis 1.Centrifuge 600 l of saliva for 90 seconds at x g. Remove the supernatant using a pipette and avoiding damaging the cell visible pellet. 2. Add 600 l of Lysis Solution + 5 l of Proteinase K (20 mg/ml) + 5 l de RNase and using a pipette to resuspend the pellet to lyse the cells. 3. Incubate at 37º C for minutes. If possible, mix with vortex during the incubation time. Protein precipitation 1. Cool the sample to room temperature. 2. Add 200 l Protein Precipitation Solution. 3. Mix with vortex vigorously a high speed for seconds. 4. Centrifuge at x g for 3-5 minutes. A precipitate will be formed. If there are particles floating in the supernatant centrifuge again once you have incubated in ice for 5 minutes. 3/10

4 Precipitación del ADN. 1.Traspasar el sobrenadante que contiene el ADN a un microtubo nuevo que contiene 600 l de Isopropanol. 2. Mezclar por inversión unas 50 veces. 3. Centrifugar a x g durante 2 minutos. El ADN será visible como un pellet blanco. 4. Eliminar el sobrenadante y secar el tubo de forma breve en papel absorbente. Añadir 600 l de Etanol 70% para lavar el ADN. 5. Centrifugar a x g durante 1 minuto. Cuidadosamente eliminar el sobrenadante sin tocar el pellet de ADN. Se puede volver a centrifugar brevemente para recoger las últimas gotas de etanol residual. 6. Invertir el microtubo en un papel absorbente y dejar secar durante unos 5-10 minutos. Hidratación del ADN. 1. Añadir l de agua estéril o Tampón de Hidratación y resuspender con pipeta. 2. Incubar a 65 º C durante 1 hora, shacking para ayudar a la dispersión de ADN, o incubar durante la noche a temperatura ambiente. 3. Conservar a 2-8ºC. Para almacenajes largos conservar a -20ºC o - 80 ºC. DNA precipitation 1. Transfer the supernatant containing the DNA into a new microtube containing 600 l of Isopropanol. 2. Mix by inverting gently 50 times. 3. Centrifuge at x g for 2 minutes. The DNA will be visible as a white pellet. 4. Remove the supernatant and dry the tube on absorbent paper. Add 600 l of Ethanol 70% to wash the DNA. 5. Centrifuge at xg for 1 minute. Carefully remove the supernatant, avoiding touching the DNA pellet. It can be briefly centrifuged to collect the drops of residual ethanol. 6. Turn the microtube upside down on absorbent paper and leave it to dry for about 5-10 minutes DNA Hydratation 1. Add l of sterile water or DNA Hydratation Solution and mix well with pipette 2. Incubate at 65ºC for 1 hour, shacking to help the DNA dispersion, or incubate overnight at room temperature. 3. Storage at 2-8ºC. For long time storage, store at 20ºC o 80ºC. 4/10

5 06/15 RBMEG06/RBMEG Extracción a partir de muestras de frotis bucales con cepillos de espuma (Ref. RBMESC01) 1.Se recomienda que el individuo al que se le va a extraer la muestra se abstenga de beber café y tomar comida alguna al menos 30 minutos antes de la recogida. Si no fuera posible se recomienda un lavado suave sólo con agua de la boca. 2.Recoger la muestra de células bucales con el escobillón.frotar el escobillón en el interior de la mejilla (pared bucal) y encías con una firme presión unas 20 veces por cada lado de la cara y cada lado del escobillón. 3. Utilizar inmediatamente para la extracción. Si se ha de transportar la muestra, dejar secar el cepillo a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego introducir el cepillo en el receptáculo que se provee para el envío. En este tubo contenedor la muestra puede permanecer 1 semana a 22-37ºC antes de realizarse la extracción. Para almacenamientos largos conservar la muestra en el contenedor a - 20ºC hasta 6 meses. 4. El uso de cepillos de espuma como los que se proveen son los adecuados ya que permiten recuperar casi la totalidad del Tampón de lisis después del periodo de incubación. Lisis celular 1. Añadir 600 μl de Tampón de Lisis en un microtubo de 1.5 ml. Cortar la cabeza del cepillo con un poco de mango y introducirla en el microtubo. Vortex vigorosamente para liberar las células del cepillo. 2. Añadir 5 l de Proteinasa K (20 mg/ml) + 5 l de RNasa e incubar a 37ºC durante 1 hora. Realizar varios vortex durante el periodo de incubación. 3. Retirar la cabeza del cepillo de la solución de lisis, frotándolo contra las paredes para recoger la máxima cantidad de líquido. Precipitación de proteínas 1. Dejar enfriar las muestras 10 min a 4ºC 2. Añadir 200 μl de Tampón de precipitación de proteínas. 3. Vortex vigorosamente durante 30 segundos. 4. Centrifugar a x g durante 5 minutos. Se observará que el precipitado proteico forma un pellet. 3.2 Extraction from a buccal swabs of foam from DURVIZ (Ref. RBMESC01) We recommend that subjects abstain from drinking coffee or eating any food since at least 30 minutes before the collection. If this was not possible, it is recommended to do a gently wash of the mouth, only with water. Collect the buccal cells sample with the foam swab. Collet sample by rolling the sample collection swab firmly on the inside of the cheek and buccal gums, aproximately 20 times on each side, making certain to move the brush over the entire cheek. Allow the sample to air dry for 15 minutes at room temperature. Process the sample or store the dry swab in the original container. In this container tube the tube can be stored for 1 week at 22-37ºC before doing the DNA extraction. For longer storage keep the sample in the container at -20ºC for up to 6 months. The use of buccal swabs of foam are the suitable because they allow to recover almost the totality of the Lysis Solution after the period of incubation. Cell Lysis 1. Add 600 μl Lysis Solution into a 1.5 ml microcentrifuge tube. Remove the collection swab from its handle using sterile scissors or a razor blade, and place the detached head in the tube. Mix with vortex vigorously a high speed for seconds. 2. Add 5 l Proteinasa K (20 mg/ml) + 5 l de RNase. 3.Incubate at 37º C for minutes. If possible, mix with vortex during the incubation time. 4. Remove the collection brush head from the Lysis solution, scraping it on the sides of the tube to recover as much liquid as possible. Protein precipitation 1. Cool the sample to room temperature. 2. Add 200 l Protein Precipitation Solution. 3. Mix with vortex vigorously a high speed for seconds. 4. Centrifuge at x g for 3-5 minutes. A precipitate will be formed. If there are particles floating in the supernatant centrifuge again once you have incubated in ice for 5 minutes. 5/10

6 Precipitación del ADN 1. Pasar el sobrenadante que contiene el ADN a un tubo de 1.5 ml que contenga 600 μl de isopropanol. Mezclar por inversión varias veces. 2. Centrifugar a x g durante 3 minutos. 3. Eliminar el sobrenadante. Añadir 600 μl de etanol 70% e invertir varias veces para lavar el pellet de ADN. 4. Centrifugar a x g durante 2 minutos. Cuidadosamente eliminar todo el etanol. Vigilar no perder el pellet de ADN 5. Invertir el tubo y dejar secar en papel absorbente durante 5-10 minutos. Hidratación del ADN 1. Añadir μl de Tampónde Hidratación del ADN y resuspender con micropipeta. 2. Conservar a 2-8ºC. Para almacenajes largos conservar a -20ºC o -80ºC. DNA precipitation 1. Transfer the supernatant containing the DNA into a new microtube containing 600 l of Isopropanol. 2. Mix by inverting gently 50 times. 3. Centrifuge at x g for 2 minutes. The DNA will be visible as a white pellet. 4. Remove the supernatant and dry the tube on absorbent paper. Add 600 l of Ethanol 70% to wash the DNA. 5. Centrifuge at xg for 1 minute. Carefully remove the supernatant, avoiding touching the DNA pellet. It can be briefly centrifuged to collect the drops of residual ethanol. 6. Turn the microtube upside down on absorbent paper and leave it to dry for about 5-10 minutes. DNA Hydratation 1. Add l of sterile water or DNA Hydratation Solution and mix well with pipette. 2. Storage at 2-8ºC. For long time storage, store at 20ºC o 80ºC. 6/10

7 06/15 RBMEG06/RBMEG Extracción a partir de muestras de saliva conservadas en el REALSALIVA DNA Sample Collection Kit ( Ref. RBMSAL01) Lisis Celular 1. En el REALSALIVA DNA Sample Collection Kit. Ref. RBMSAL01. se observará un pellet blanco que contiene las células de dónde se va a extraer el ADN. Agitar bien el tubo que contiene los 2 ml de saliva recolectados. 2. Traspasar todo el contenido del tubo (4ml) del REALSALIVA DNA Sample Collection Kit. Ref. RBMSAL01 a un tubo de centrifuga de 15 ml. Asegurarse que se ha traspasado todo el contenido incluido el pellet blanco. 3. Centrifugar a 4000 x g durante 2 minutos. Se observará la formación de un pellet blanco. Eliminar el sobrenadante sin perder nada de pellet celular. 4. Añadir 2 ml de Tampón de Lisis + 15 l de Proteinasa K (20 mg/ml) + 15 l de RNasa y resuspender mediante pipeta para lisar las células. Incubar a 37º C durante 60 minutos. Muy importante que todo el pellet celular sea resuspendido. Precipitación proteica. 1. Dejar enfriar las muestras 10min a 4ºC 2. Añadir 750 l de Tampón de Precipitación proteínas al lisado celular. 3. Vortex vigorosamente a máxima velocidad durante segundos. 4.Centrifugar a 4000 x g durante 5 minutos. Se formará un precipitado. Si se observan partículas flotando volver a centrifugar después de incubar 5 minutos en hielo. 3.3 Extraction from Saliva samples via REALSALIVA DNA Sample Collection Kit. Ref. RBMSAL01 Cell Lysis 1. In the REALSALIVA DNA Sample Collection Kit. Ref. RBMSAL01. will be observed a white pellet that contains the cells where from the DNA is going to be extracted. Mix well the tube that contains the 2 ml of saliva for dissolve the pellet. 2. Transfer the whole content of the tube (4ml) REALSALIVA DNA Sample Collection Kit. Ref. RBMSAL01 to a 15 ml centrifuge tube. You must assure that the whole content has been added, included the white pellet. 3. Centrifuge at 4000 x g for 2 minutes. Will be observed the formation of a white pellet. Carefully discard the supernantant avoiding touching the cell pellet. 4. Add 2 ml of Lysis Solution + 15 l of Proteinase K (20 mg/ml) + 15 l de RNase and using a pipette to dissolve the pellet to lyse the cells. Very important to dissolve completely the cell pellet 5. Incubate at 37º C for 60 minutes. If possible, mix with vortex during the incubation time. Protein precipitation 1. Cool the sample to room temperature. 2. Add 750 l Protein Precipitation Solution. 3. Mix with vortex vigorously a high speed for seconds. 4. Centrifuge at 4000 x g for 5 minutes. A precipitate will be formed. If there are particles floating in the supernatant centrifuge again once you have incubated in ice for 5 minutes. 7/10

8 Precipitación del ADN. 1.Traspasar el sobrenadante que contiene el ADN a un tubo de centrifuga de 15 ml nuevo que contiene 2 ml de Isopropanol. 2. Mezclar por inversión unas 25 veces. 3. Centrifugar a x g durante 2 minutos. El ADN será visible como un pellet blanco. 4. Eliminar el sobrenadante y secar el tubo de forma breve en papel absorbente. Añadir 2 ml de Etanol 70% para lavar el ADN. 5. Centrifugar a x g durante 1 minuto. Cuidadosamente eliminar el sobrenadante sin tocar el pellet de ADN. Se puede volver a centrifugar brevemente para recoger las últimas gotas de etanol residual. 6. Invertir el tubo en un papel absorbente y dejar secar durante unos 5-10 minutos. Hidratación del ADN. 1. Añadir l de agua estéril o Tampón de Hidratación y resuspender con pipeta. 2.Incubar a 65 º C durante 1 hora, shacking para ayudar a la dispersión de ADN, o incubar durante la noche a temperatura ambiente. 3. Conservar a 2-8ºC. Para almacenajes largos conservar a -20ºC o - 80 ºC DNA precipitation 1. Transfer the supernatant containing the DNA into a new 15 ml centrifuge tube containing 2 ml Isopropanol. 2. Mix by inverting gently 25 times. 3. Centrifuge at 4000 x g for 2 minutes. The DNA will be visible as a white pellet. 4. Remove the supernatant and dry the tube on absorbent paper. Add 2 ml Ethanol 70% to wash the DNA. 5. Centrifuge at 4000 x g for 1 minute. Carefully remove the supernatant, avoiding touching the DNA pellet. It can be briefly centrifuged to collect the drops of residual ethanol. 6. Turn the tube upside down on absorbent paper and leave it to dry for about 5-10 minutes. DNA Hydratation 1. Add l of sterile water or DNA Hydratation Solution and mix well with pipette 2. Incubate at 65ºC for 1 hour, shacking to help the DNA dispersion, or incubate overnight at room temperature. 3. Storage at 2-8ºC. For long time storage, store at 20ºC o 80ºC. 8/10

9 06/15 RBMEG06/RBMEG Extracción a partir de muestras de saliva conservadas en el ORAGENE self collection kits (DNAGenotek). Lisis Celular 1. Incubar las muestras de ORAGENE/saliva a 50ºC en un incubador de agua durante 1 hora o en un incubador de aire por un mínimo de 2 horas. 2. Traspasar todo el contenido del tubo (4ml) a un tubo de centrifuga de 15 ml. 3. Añadir 1 ml de Tampón de Lisis + 15 l de RNasa. Vortex para mezclar bien. Incubar a tempratura ambiente durante 15 minutos. Precipitación proteica. 1. Añadir 1.60 ml de Tampón de Precipitación proteínas al lisado celular. 2. Vortex vigorosamente a máxima velocidad durante segundos. 3.Centrifugar a 4000 x g durante 5 minutos. Se formará un precipitado. Si se observan partículas flotando volver a centrifugar después de incubar 5 minutos en hielo. Precipitación del ADN. 1.Traspasar el sobrenadante que contiene el ADN a un tubo de centrifuga de 15 ml nuevo que contiene 5 ml de Isopropanol. 2. Mezclar por inversión unas 25 veces. 3. Centrifugar a x g durante 2 minutos. El ADN será visible como un pellet blanco. 4. Eliminar el sobrenadante y secar el tubo de forma breve en papel absorbente. Añadir 5 ml de Etanol 70% para lavar el ADN. 5. Centrifugar a x g durante 1 minuto. Cuidadosamente eliminar el sobrenadante sin tocar el pellet de ADN. Se puede volver a centrifugar brevemente para recoger las últimas gotas de etanol residual. 6. Invertir el tubo en un papel absorbente y dejar secar durante unos 5-10 minutos. Hidratación del ADN. 1. Añadir l de agua estéril o Tampón de Hidratación y resuspender con pipeta. 2. Incubar a 65 º C durante 1 hora, shacking para ayudar a la dispersión de ADN, o incubar durante la noche a temperatura ambiente. 3. Conservar a 2-8ºC. Para almacenajes largos conservar a -20ºC o - 80 ºC. 3.4 ORAGENE self collection kits (DNAGenotek)/saliva purification usig the REALPURE SALIVA KIT Cell Lysis 1.Incubate ORAGENE/saliva simple at 50ºC in a wáter incubator for a minimum of 1 hour or in an air incubator for a minimum of 2 hours. 2.Transfer 4ml of lysate simple ( 2ml saliva plus 2ml Oragene solution) to a 15 or 50 ml centrifuge tube. 3.Add 1ml Lysis solution + 15 l de RNase. Vortex at high speed for 10 seconds to mix simple and incúbate 15 minutes at room temperature. Protein precipitation 1. Add 1.60 ml Protein Precipitation Solution. 2. Mix with vortex vigorously a high speed for seconds. 4. Centrifuge at 4000 x g for 5 minutes. A precipitate will be formed. If there are particles floating in the supernatant centrifuge again once you have incubated in ice for 5 minutes. DNA precipitation 1. Transfer the supernatant containing the DNA into a new 15 or 50 ml centrifuge tube containing 5 ml Isopropanol. 2. Mix by inverting gently 25 times. 3. Centrifuge at 4000 x g for 3 minutes. The DNA will be visible as a white pellet. 4. Remove the supernatant and dry the tube on absorbent paper. Add 5 ml Ethanol 70% to wash the DNA. 5. Centrifuge at 4000 x g for 1 minute. Carefully remove the supernatant, avoiding touching the DNA pellet. It can be briefly centrifuged to collect the drops of residual ethanol. 6. Turn the tube upside down on absorbent paper and leave it to air dry for about 5-10 minutes. DNA Hydratation 1. Add l of sterile water or DNA Hydratation Solution and mix well with pipette 2. Incubate at 65ºC for 1 hour, shacking to help the DNA dispersion, or incubate overnight at room temperature. 3. Storage at 2-8ºC. For long time storage, store at 20ºC o 80ºC. 9/10

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