MECANISMO DE EVASIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE POR CÉLULAS DE CÁNCER CERVICAL: APOPTOSIS INDUCIDA SOBRE CÉLULAS LINFOIDES. Laura Padierna Mota 1,2, Paula Figueroa-Arredondo 1, Fernando Enríquez-Rincón 2. 1 Lab. de Microbiología Molecular, Programa Institucional de Biomedicina Molecular. ENMyH-IPN. Gmo. Masssieu Helguera #239. La Escalera Ticomán, 07320. México, D.F. figueroapaula@hotmail.com 2 Departamento de Biología Celular, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados. Av. IPN # 2508, 07360, Zacatenco, México DF. fenriqz@cell.cinvestav.mx RESUMEN El linfocito T es una de las células del sistema inmune que se encargan de la vigilancia inmunológica, induce muerte programada en células neoplásicas, infectadas, senescentes o indiferenciadas. El mecanismo por el que se lleva a cabo esta eliminación comprende dos vías principales: la exocitosis granular mediada por perforina y granzimas y la vía de Fas/FasL, desembocando ambas en la apoptosis. En ésta última, el proceso se activa cuando el receptor Fas de las células blanco se une a su ligando (FasL) expresado en células T citotóxicas y células NK. Algunas células neoplásicas (de vejiga, colon, hígado, pulmón, ovario, tiroides, riñón, sarcoma y melanoma) siendo anormales y atípicas, expresan en su membrana el FasL como mecanismo de contraataque para inducir apoptosis a las células del sistema inmune. Concordando con tales datos, nuestro grupo ha detectado la presencia del FasL en líneas celulares de cáncer cervical (SiHa, CaSki, HeLa y C-33 A). El objetivo de este trabajo fue demostrar que las células de cáncer cervical no solamente expresan el ligando de Fas sino que este es funcionalmente capaz de inducir apoptosis de linfocitos T (células Jurkat) in vitro. Nuestros resultados experimentales ponen de manifiesto que no solo el contacto con las células derivadas de cáncer cervical sino también los sobrenadantes de sus cultivos fueron capaces de inducir apoptosis medida mediante los ensayos de anexina V y por la prueba de TUNEL en células Jurkat. Adicionalmente logramos bloquear el efecto apoptótico de los sobrenadantes utilizando inhibidores del procesamiento proteolítico del FasL. Para corroborar la participación de FasL, incubamos las líneas tumorales y las células Jurkat en presencia de anticuerpos anti-fasl, lo cual neutralizó el efecto. Conocer el mecanismo anterior y evitar la expresión genética del FasL es uno de los objetivos que sigue nuestro laboratorio para idear una terapia génica anti-tumoral. Palabras clave: Apoptosis, FasL, escape inmunológico. INTRODUCCIÓN El carcinoma del cuello uterino y sus lesiones precancerosas constituyen la segunda causa de muerte relacionada al cáncer en mujeres a nivel mundial. En México así como en otros países en vías de desarrollo ocupa el primer lugar. La infección con tipos oncogénicos del virus del papiloma humano (VPH) es considerada como el factor de riesgo principal para el desarrollo de tumores malignos en el cuello uterino. Sin embargo, otros factores además del VPH contribuyen al proceso carcinogénico entre los que se cuentan los factores ambientales y los propios del hospedero (1). El sistema inmune del hospedero es el encargado de eliminar tanto células infectadas por el virus como células cancerosas. La respuesta de anticuerpos
específicos tiene una eficacia muy limitada a diferencia de la respuesta inmune mediada por linfocitos T. El mecanismo principal de eliminación de células infectadas por virus y células tumorales es a través de los linfocitos T citotóxicos que reconocen a péptidos derivados de las proteínas virales asociados a las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad de clase I presentados en la superficie de las células blanco. El mecanismo de citotoxicidad está mediado por dos vías: la liberación de perforinas y granzimas que penetran a las células blanco causando los eventos intracelulares que conducen a la apoptosis y la activación de receptores Fas que también llevan a apoptosis a través de señales moleculares (2). Existen varios ligandos de receptores relacionados a la muerte celular programada en las células blanco. Uno de los más importantes es el ligando de Fas que se encuentra normalmente expresado en las células citotóxicas (linfocitos T y células NK), sin embargo, recientemente se descubrió la presencia de este ligando en células tumorales de algunos tipos de cánceres como el de colon, pulmón, gástrico y en astrocitoma (3). La demostración de la expresión de FasL en tejidos inmunoprivilegiados como el ojo, asigna un papel preponderante al FasL en la regulación de las respuestas inflamatorias necesarias para mantener la homeostasis en el organismo. Durante la carcinogénesis, las células tumorales desarrollan múltiples mecanismos para subvertir al sistema inmune y suprimir la respuesta antitumoral (escape tumoral). La expresión de FasL en los tumores podría representar un mecanismo de contraataque al inducir apoptosis en los linfocitos T que infiltran al tumor y de esta forma escapar a la acción del sistema inmune (4). En nuestro laboratorio detectamos la expresión del FasL en líneas celulares provenientes de cáncer cervical y en este trabajo demostramos la funcionalidad de este ligando sobre cultivos de una línea de linfocitos T en los cuales demostramos apoptosis utilizando el ensayo de anexina V y la técnica de TUNEL. METODOLOGÍA Las células Jurkat se co-cultivaron con monocapas de cada una de las tres líneas celulares [CaSki (HPV-16), HeLa (HPV-18) y C-33A (HPV negativo)] o con sus respectivos sobrenadantes, después de 24 horas de incubación, se colectaron para someterlas a un ensayo de apoptosis. La apoptosis de los linfocitos T (células Jurkat) se determinó mediante el ensayo de anexina V-FITC/ioduro de propidio y el porcentaje de células apoptóticas se obtuvo por citometría de flujo en un FACSCalibur (Beckton-Dickinson). Para la determinación del FasL soluble, las células tumorales fueron tratadas con un inhibidor de metaloproteasas de matriz extracelular (MMPI) la cual previene la liberación del ligando (5). Por otro lado, las células tumorales fueron tratadas con anticuerpos anti-fasl para bloquear el efecto apoptótico y corroborar la participación de dicha molécula. RESULTADOS Todas las líneas tumorales derivadas de cáncer cervical empleadas en este trabajo y sus sobrenadantes indujeron apoptosis en la línea celular Jurkat. El inhibidor de metaloproteasas de matriz extracelular (MMPI) suprimió el efecto apoptótico de los sobrenadantes de los cultivos. Esto sugiere que el ligando de Fas soluble es el factor que participa en la inducción de apoptosis, ya que éste ligando se libera al medio por acción de metaloproteasas expresadas por las células tumorales (Fig. 1).
2º Congreso Nacional de Química Médica Padierna-Mota y col. Para comprobar que el ligando de Fas es responsable del efecto apoptótico inducido por las líneas celulares de cáncer cervical, sobre los linfocitos T (células Jurkat), se utilizaron anticuerpos policlonales contra FasL (anti-human Fas ligand/tnfsf6 antibody, R&D Systems, Inc.). El efecto apoptótico fue completamente neutralizado cuando se usaron las monocapas de las líneas tumorales tratadas con el inhibidor de metaloproteasas, MMPI (Fig. 2). Figura 1. Apoptosis de células Jurkat co-cultivadas durante 24 h con las monocapas (M) o sobrenadantes (S) de líneas celulares de cáncer cérvico uterino (HeLa, SiHa, CaSki y C-33 A). Controles de inducción de apoptosis cuantificada por citometría de flujo usando la tinción de anexina V-FITC/Ioduro de propidio: células Jurkat sin tratamiento, tratadas con actinomicina D 0.2 µg/ml, con anticuerpos monoclonales anticd95 0.5 µg/ml o incubadas con el inhibidor de metaloproteasas de matriz extracelular 10 µm (MMPI). Las letras se refieren a: M.- cultivo mixto de células Jurkat con la monocapa que se indica. S.- Incubación de células Jurkat con el sobrenadante de la monocapa que se indica. MMPI.Tratamiento con MMPI a la monocapa que se indica. Se hicieron tres repeticiones de este experimento, la figura muestra un ensayo representativo. Los resultados de la Fig. 2 corresponden a las determinaciones de apoptosis empleando la prueba de TUNEL. En la línea superior del panel a) muestra la apoptosis inducida por las células CaSki (HPV16+) sobre la línea celular Jurkat en tres condiciones experimentales. En este caso las células CaSki sin tratamiento inducen apoptosis de las Jurkat por contacto directo en un 48%, en tanto que el CD95L en forma soluble en el sobrenadante de los cultivos fue capaz de inducir apoptosis a las Jurkat de forma más eficiente, en un 61%. Cuando en el experimento se trató a las CaSki con su anticuerpo específico anti-cd95l a fin de bloquear su actividad, se observó una inhibición significativa de la apoptosis sobre las Jurkat (el 12% de células mostraron apoptosis). En la Fig. 2 la línea inferior del panel a) muestra la apoptosis inducida sobre las células Jurkat empleando sobrenadantes de la línea celular CaSki en tres condiciones experimentales. El sobrenadante de las células CaSki sin tratamiento es capaz de inducir apoptosis a un 59.3% de las células Jurkat. En cambio al someter los cultivos de las células CaSki al tratamiento con el inhibidor de metaloproteasas MMPI, el ligando de CD95L queda unido a la membrana de las células por lo que al emplear su sobrenadante este solamente es capaz de inducir apoptosis a un 3% de las Jurkat. Al
tratar a la línea CaSki con el anticuerpo específico contra el CD95L no se observó una inhibición significativa de la apoptosis inducida por el sobrenadante (56% de las Jurkat sufrieron apoptosis) a las concentraciones de anticuerpo (1:500) empleadas en estas pruebas. En el panel b) la línea superior muestra los experimentos de inducción de apoptosis obtenidos mediante experimentos con las células C-33 (HPV-), con la línea celular Jurkat bajo tres condiciones experimentales. En la primera línea horizontal se observa que las células C-33 sin tratamiento inducen apoptosis eficientemente a las Jurkat en un 57%, al tratar a las C-33 con el inhibidor MMPI, conservando el CD95L en la membrana, la inducción de apoptosis se eleva hasta el 76.5%. Al bloquear a CD95L con su anticuerpo específico solamente se observa un 25% de apoptosis inducida sobre las Jurkat por las monocapas de esta línea. En cambio en el experimento de inducción de apoptosis empleando los sobrenadantes de C-33 sin tratamiento, el 61% de las Jurkat experimentaron apoptosis. El sobrenadante de las células tratadas con el MMPI solamente conservó su actividad apoptótica en un 13.5% de las Jurkat. Sorprendentemente al tratar el sobrenadante de las C-33 con el anticuerpo anti-cd95l la apoptosis sobre las Jurkat aún fue del 48%, este resultado al parecer indica que a la concentración de anticuerpo empleada en este experimento, el anti-cd95l no es capaz de inhibir totalmente el efecto apoptótico inducido por el ligando soluble contenido en el sobrenadante. Figura 2. El ligando de CD95 anclado a la membrana de las células de cáncer cervical induce apoptosis en las células Jurkat. En el panel a) aparecen los resultados obtenidos con la línea celular CaSki (HPV-16+) y en el panel b) los resultados de la línea C-33 (HPV-). La primera columna representa a las células sin tratamiento, la segunda son las células tratadas con el inhibidor de metaloproteasa MMPI y en la tercera columna las células recibieron tratamiento con el inhibidor MMPI y con el anti- CD95L. Se muestran los valores obtenidos de la inducción de apoptosis en las células Jurkat valorada por la tinción de TUNEL después del cultivo mixto de las células linfoides con las monocapas (M) o los sobrenadantes (S) que se indican.
CONCLUSIONES Todas las líneas celulares de cáncer cervical empleadas así como sus sobrenadantes, indujeron apoptosis en las células Jurkat aún en la línea tumoral en donde no se detecta la presencia del genoma del HPV, lo que evidencia que una molécula unida a membrana y otra soluble está interviniendo en el proceso. El tratamiento con un inhibidor de metaloproteasas MMPI que no permite que se lleve a cabo la proteólisis que liberaría la forma soluble del ligando de FAS (CD95L) dio lugar a un aumento en el efecto apoptótico observado cuando las células de cáncer cervical tienen contacto directo con las células Jurkat, en comparación con los cultivos celulares sin tratamiento. Consistentemente con el resultado anterior, los sobrenadantes de ambas líneas celulares perdieron su capacidad de inducir apoptosis al someter las células a tratamiento con el MMPI. El anticuerpo anti-cd95l bloqueó el efecto apoptótico del CD95L presente en la membrana de las células tumorales, pero no se consiguió bloquear totalmente el efecto apoptótico inducido por los sobrenadantes de la línea celular C-33 A. Probablemente un exceso de anticuerpo podría lograr una completa inhibición, pero es necesario llevar a cabo la comprobación de este resultado. BIBLIOGRAFIA 1. zur Hausen H. 2002. Papillomaviruses and cancer: from basic studies to clinical application. Nature Reviews Cancer. 2:342-350. 2. Andersen MH, Schrama D, Straten PT, Becker JC. 2006. Cytotoxic T cells. Journal of Investigative Dermatology. 126:32-41. 3. Houston A and O Connell J. 2004. The Fas signaling pathway and its role in the pathogenesis of cancer. Current Opinion in Pharmacology. 4:321-326. 4. O Connell J. 2002. Fas ligand and the fate of antitumor cytotoxic lymphocytes. Immunology. 263-266. 5. Stamenkovic I. 2000. Matrix metalloproteinases in tumor invasion and metastasis. Seminars in Cancer Biology. 10:415-433.