EL MICROSCOPIO El tamaño de la mayor parte de las células está entre 1 y 100 ηm, por lo que su observación requiere el uso de microscopios, cuyo perfeccionamiento ha sido determinante en los grandes avances conseguidos en su estudio y conocimiento. Hay dos grandes tipos de microscopios: ópticos y electrónicos MICROSCOPÍA ÓPTICA PARTES DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO SISTEMA ÓPTICO OCULAR: lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo. OBJETIVO: lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta. CONDENSADOR: lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación. DIAFRAGMA: regula la cantidad de luz que entra en el condensador. FOCO: dirige los rayos luminosos hacia el condensador. SISTEMA MECÁNICO SOPORTE: mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo. PLATINA: lugar donde se deposita la preparación. CABEZAL: contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular,.. REVÓLVER: contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos. TORNILLOS DE ENFOQUE: macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que consigue el enfoque correcto. PROPIEDADES AUMENTO: es la relación entre una dimensión lineal de la imagen y la misma dimensión del objeto. Se calcula multiplicando el aumento del ocular por el del objetivo. APERTURA NUMÉRICA DEL OBJETIVO: calcula el poder de resolución y el tamaño mínimo observable. PODER DE RESOLUCIÓN O PODER SEPARADOR: es la propiedad más importante en un microscopio, ya que de ella depende la nitidez de los detalles. Joaquín Rodríguez Piaya 1
TAMAÑO MÍNIMO OBSERVABLE O LIMITE DE RESOLUCIÓN: es la distancia mínima a la que tienen que estar dos puntos de la muestra para que puedan verse como distintos. También puede definirse como la anchura mínima de una rendija o de un objeto para que resulten visibles al microscopio. En los microscopios ópticos es de 0,2μm (200 nm) TIPOS MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO Este microscopio es el más utilizado. Tiene el condensador por debajo de la muestra, lo que permite que la luz de la fuente luminosa converja sobre ella formando un cono de luz brillante que penetra en el objetivo. Es el más adecuado para visualizar muestras que presentan un alto contraste, como, por ejemplo, los cortes de tejidos teñidos. MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO En este microscopio, solamente llegan a la muestra los rayos de luz que han sido desviados al atravesar el condensador especial. Las células destacan sobre un fondo oscuro. Resulta muy útil para visualizar las suspensiones coloidales, como, por ejemplo, el citoplasma celular. MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASE Con este microscopio, las diferencias en el índice de refracción de las partes de la muestra se convierten en variaciones de intensidad (brillo y oscuridad) que son visibles al ojo. Permite observar células y tejidos sin teñir, lo que resulta útil en el estudio de células vivas. 2
MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA O RADIACIÓN ULTRAVIOLETA Permite detectar moléculas que tienen la capacidad de ser autofluorescentes, como la vitamina A, además, se pueden ver compuestos fluorescentes inyectados en una célula viva, o fluorocromos unidos a anticuerpos y sondas para detectar los correspondientes antígenos o cadenas complementarias de ácidos nucleicos. MICROSCOPIO DE POLARIZACIÓN Es una modificación del microscopio de fondo claro, en el que la muestra es atravesada por luz polarizada. Las sustancias cristalinas o de elevado grado de ordenación alteran al plano de la luz polarizada. Las estructuras anisótropas aparecen brillantes en un campo oscuro, distinguiéndose de las isótropas. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA Los microscopios electrónicos utilizan como fuente de radiación un haz de electrones precedente del calentamiento de un filamento de tungsteno, el cátodo, mediante una corriente eléctrica. Los electrones viajan desde el cátodo hasta el ánodo a gran velocidad, y se dirigen a través de una columna hueca y al vacío para que no choquen con las moléculas de gas y se dispersen. El haz de electrones es guiado a la muestra por medio de un sistema de lentes, que son electroimanes capaces de desviar la trayectoria de los electrones, puesto que son partículas cargadas. Las ondas asociadas las haz de electrones poseen una longitud de onda mucho menor que la de la luz visible. Tipos MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN (MET) Emplea secciones muy finas de muestras, cortes de unos 500 nm. (se usan ultramicrotomos). La imagen que se obtiene depende de la variación en la dispersión de los electrones al incidir sobre las diferentes estructuras que componen la muestra. Se pueden distinguir estructuras de unos 10 Å (1nm), o incluso menores. El aumento, en condiciones óptimas, puede ser de 500.000. Para que el material biológico resulte opaco a los electrones, se tiñe con átomos de metales pesados como tetraóxido de osmio (OsO4), que impregnan regiones hidrófilas de la muestra. Si se interpone una película fotográfica de blanco y negro, esta queda impresionada. Las partes oscuras de la fotografía corresponden a formaciones hidrófilas de la célula que, por impregnarse del material pesado, han dispersado los electrones. Y las zonas claras se deben a regiones de la preparación que han permitido el paso de los electrones sin dispersión. 3
El MET también se utiliza para conseguir imágenes que reflejen la textura superficial del material biológico mediante una técnica denominada SOMBREADO METÁLICO. Consiste en depositar una fina capa de un metal, como el oro o el platino, evaporado al vacío y dirigido oblicuamente. Posteriormente un baño acido disuelve el material biológico, dejando una réplica metálica de la superficie de la muestra que puede ser examinada con el microscopio electrónico de transmisión. El metal queda depositado con un grosor desigual, y esto le da la imagen de un aspecto de relieve. MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO (MEB) Es el instrumento destinado a examinar con gran claridad y detalle la superficie de muestras sin seccionar, cuyo tamaño puede variar entre el de un virus y el de la cabeza de un insecto. Este tipo de microscopio tiene la ventaja, con respecto al MET, de que permite observar objetos enteros previamente sombreados. La muestra se recubre por evaporación al vacío de una fina capa de un metal pesado como el platino. El haz de electrones es lanzado contra la superficie del objeto, barriéndola rápidamente y no atravesándola. Las moléculas de la muestra se excitan y emiten haces de electrones secundarios que, enfocados, se recogen en una pantalla monocromática de un monitor. Este microscopio alcanza un aumento menos (hasta 20.000). Se consiguen imágenes de gran calidad tridimensional. Permite visualizas la superficie de la célula y las prolongaciones, extensiones y materiales extracelulares que intervienen en las interacciones que se producen entra la célula y el medio que la rodea. 4
EL MICROSCOPIO La CRIOFRACTURA es una técnica de la que se puede obtener mucha información de las muestras de microscopía electrónica. Consiste en congelar la muestra rápidamente. Para evitar el daño que produce la formación de cristales de hielo, la muestra se sumerge en compuestos crioprotectores como el glicerol. Después, se congela rápidamente en líquidos a muy baja temperatura, como el nitrógeno líquido (-196 C) o el helio líquido (-269 C). Las muestras de tejido congelado se fractura bruscamente, logrando un plano de fracturación o fisura que desdobla la muestra en os partes. De este modo, se pueden separar en dos la membrana plasmática u otras formaciones membranosas de la célula. ESQUEMA COMPARATIVO DE LOS TIPOS DE MICROSCOPIOS CARACTERÍSTICAS MO MET MEB Fuente de radiación Luz Electrones Electrones Regulación de la fuente de radiación Lentes de vidrio Electroimanes Electroimanes Portátil Sí No No Aumento x 2.500 x 500.000 x 20.000 Tamaño mínimo observable 120 nm 1 nm 10 nm Fotografía B/N y color B/N B/N Tipo de material que permite observar Vivo y no vivo No vivo No vivo Joaquín Rodríguez Piaya 5