2 - Evaluación de los métodos analíticos actuales para alérgenos del látex de esta edición: Asociación Española de Alérgicos al Látex Dirección y coordinación Asociación Española de Alérgicos al Látex Carlos Albarrán Collado Adoración Carpintero Montoro Pilar Vicente García Expertos consultados Mª Rosa Sánchez-Monge (Universidad Politécnica de Madrid) Gabriel Salcedo (Universidad Politécnica de Madrid) Timo Palosuo (Instituto Finlandés de Salud Pública) David A. Kostyal (Fundación Guthrie) Hardi Tamm (Quattromed Ltd.) Beatriz Bellido (Instituto de Salud Carlos III) Pilar Guerra (Instituto de Salud Carlos III) Pilar Díaz (Instituto de Salud Carlos III) Carlos Blanco (Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín) Alberto Martínez (Bial Arístegui) Domingo Barber (ALK Abelló) El presente informe comparativo de tecnologías ha sido realizado en colaboración conjunta entre la Asociación Española de Alérgicos al Látex y Parque Científico de Madrid, entidad que gestiona el Círculo de Innovación en Biotecnología, perteneciente al Sistema Regional de Innovación madrid+d. Autores Esther García Iglesias Cecilia González de Orduña Cristina Rodríguez Rivera Lara Gago Cabezas José Manuel González Izquierdo José Luís Fernández Nuevo Javier Benito Andrés ISBN: 978-84-612-9585-2 Depósito Legal: GU-50/2009 Diseño cubierta y maquetación: J.J.Gràfics - c/ Espígol, 14-08328 Alella (Barcelona) Impresión: Grafi-6, s.l.l. - Polig. nº2 de Cabanillas - 19171 Cabanillas del C. (Guadalajara) Financiado por el Ministerio de Sanidad y Consumo El copyright y otros derechos de propiedad intelectual de este documento pertenecen a la Asociación Española de Alérgicos al Látex. Se autoriza a las organizaciones de atención sanitaria a reproducirlo total o parcialmente para uso no comercial, siempre que se cite el nombre completo del documento, año, institución y financiación.
Índice de contenidos - 3 Índice de contenidos Agradecimientos... 5 Resumen ejecutivo... 6 1. Antecedentes y objetivo del informe... 7 2. Problemática de la alergia al látex y la detección de alérgenos... 8 3. Métodos analíticos para alérgenos del látex... 13 3.1. Método de Lowry modificado... 15 3.2. Cromatografía líquida de alta resolución... 16 3.3. Ensayos inmunoenzimáticos tipo ELISA...17 3.4. Inmunoelectroforesis... 23 3.5. Inmunodetección en membrana (Western Blot)... 24 3.6. Evaluación y comparación de métodos analíticos... 26 3.7. Propiedad industrial...29 4. Catálogo de empresas... 32 4.1. Productos y servicios de detección... 32 4.2. Alérgenos del látex y anticuerpos... 39 4.3. Otras empresas... 45 4.4. Legislación y normalización...48 5. Catálogo de grupos de investigación... 53 5.1. Grupos de investigación nacionales... 53 5.2. Otros grupos de investigación... 57 5.3. Proyectos de investigación...65 6. Conclusiones del Informe... 69 7. Bibliografía... 71 8. Glosario y abreviaturas... 74
4 - Evaluación de los métodos analíticos actuales para alérgenos del látex
Agradecimientos - 5 Agradecimientos Como consecuencia del estudio Una Aproximación a la Situación Real de la Alergia al Látex en España, la Asociación Española de Alérgicos al Látex creyó necesaria una Evaluación de los Métodos Analíticos Actuales para Alérgenos del Látex. Para poder realizar este estudio, hemos contado con la colaboración y asesoramiento de numerosos expertos, tanto nacionales como internacionales. Nuestro agradecimiento a todas estas personas, a los técnicos del Parque Científico de Madrid, y a los miembros de la Asociación Española de Alérgicos al Látex que han colaborado en la realización del mismo. Mención especial al Ministerio de Sanidad y Consumo ya que sin su apoyo hubiera sido imposible la realización de este estudio.
6 - Evaluación de los métodos analíticos actuales para alérgenos del látex Resumen ejecutivo Este informe comparativo de tecnologías consta de una primera parte en la que se recogen brevemente los antecedentes del mismo y su objetivo. A continuación, en el punto 2 se introduce el problema de la alergia al látex y las medidas que se aplican actualmente para su diagnóstico, tratamiento y prevención. En el siguiente epígrafe se detallan los métodos analíticos identificados para la determinación y cuantificación de los alérgenos del látex. Para cada uno de ellos se incluye una representación esquemática del proceso de análisis junto con sus principales ventajas e inconvenientes. Además, en el punto 3.6 estos métodos se evalúan y comparan entre sí en función de una serie de características como el límite de detección, la especificidad, el coste, la necesidad de personal cualificado, etc. Y en el punto 3.7 se enumeran las patentes y solicitudes de patente sobre técnicas de análisis aplicables a los alérgenos del látex y temas afines. En los puntos 4 y 5 se describen los catálogos de empresas y grupos de investigación relativos a la determinación de estos alérgenos. En el primer caso, se presentan los perfiles de diversas empresas que comercializan y/ o disponen de servicios de análisis y que producen alérgenos y anticuerpos. En el segundo, se proporciona una relación de algunos de los grupos de investigación más relevantes que trabajan en este campo además de varios proyectos financiados con fondos públicos. En él también se mencionan los aspectos más importantes de la legislación nacional y comunitaria con respecto a la identificación y etiquetado de los productos con látex junto con las iniciativas llevadas a cabo en EE.UU. en este ámbito. Asimismo, se indican los métodos de detección que se han estandarizado por los distintos organismos internacionales. En el punto 6 se incluyen las conclusiones extraídas del análisis de la información recopilada en este informe comparativo de tecnologías. Por último, se presentan las referencias bibliográficas consultadas en el epígrafe 7 y una lista de abreviaturas y un glosario de términos en el 8.
Antecedentes - 7 1. Antecedentes y objetivo del informe La Asociación Española de Alérgicos al Látex, tras la realización del estudio Una aproximación a la situación real de la alergia al látex en España, en el que queda patente la necesidad de conocer el contenido de látex natural que pudiera haber en diferentes productos del ámbito sanitario, así mismo consideró la necesidad de realizar una Evaluación de los Métodos Analíticos Actuales para los Alérgenos al Látex.
8 - Evaluación de los métodos analíticos actuales para alérgenos del látex 2. Problemática de la alergia al látex y la detección de alérgenos El látex, goma natural o caucho es un producto que se obtiene de la savia del árbol del caucho Hevea brasiliensis (figura 1). Se trata de una emulsión acuosa coloidal, de aspecto lechoso, que procede del citoplasma de las células denominadas laticíferas. Tras su recolección, la goma natural se somete a diversos tratamientos (coagulación, vulcanización, moldeado) y se adicionan distintas sustancias como aceleradores, conservantes, antioxidantes, plastificantes, etc. con el fin de modificar y mejorar sus propiedades físico-químicas y mecánicas. (1) El látex presenta un gran interés para la industria por sus características de elasticidad. Es un material ubicuo que se utiliza en la fabricación de más de 40.000 productos de uso cotidiano y médico. En la siguiente tabla se recoge un listado de diversos productos que pueden contener látex. (2) Figura 1. Recolección de látex del árbol del caucho (Hevea brasiliensis).
Problemática de la alergia al látex y la detección de alérgenos - 9 Tabla 1. Listado de productos de uso cotidiano y médico que pueden contener látex. (2) Alergia al látex La alergia al látex mediada por anticuerpos de la clase inmunoglobulina E (IgE) fue descrita por primera vez en el año 1979. A finales de los años ochenta, se produjo un incremento considerable del número de casos, debido a la generalización del uso de guantes y preservativos de látex, como parte de las medidas recomendadas para evitar el contagio del virus de la inmunodeficiencia humana o VIH (3). Como consecuencia de esta situación, en las últimas décadas la alergia al látex ha supuesto un problema socioeconómico y sanitario importante. Actualmente las medidas preventivas y los avances realizados en su diagnóstico, junto con los tratamientos basados en inmunoterapia, han reducido el número de casos. Sin embargo, la alergia al látex puede considerarse todavía hoy un riesgo potencial para determinados grupos como, por ejemplo, el personal sanitario y algunos pacientes aquejados de ciertas enfermedades que han sufrido repetidas operaciones quirúrgicas. La prevalencia de sensibilización de esta patología se establece en torno al 0,3-1% para la población general. En la tabla 2 se indican algunas cifras sobre la prevalencia de la alergia al látex en distintos tipos de población. Aparte de éstos, también se ven afectados los profesionales con una exposición alta al látex en su puesto de trabajo (operarios de industrias de productos de goma y trabajadores de las plantaciones de látex); aquellos que emplean frecuentemente guantes fabricados con este material, como manipuladores
10 - Evaluación de los métodos analíticos actuales para alérgenos del látex de alimentos, trabajadores de invernaderos, peluqueros, empleadas de hogar, etc.; y, personas con un historial clínico de reacciones alérgicas frente a ciertas frutas y frutos secos. (2) Tabla 2. Prevalencia de la alergia al látex en distintas poblaciones analizadas. (2) Las reacciones alérgicas que puede desencadenar el látex se clasifican en reacciones de hipersensibilidad inmediata y reacciones de hipersensibilidad retardada. Reacciones de hipersensibilidad inmediata o tipo I, mediadas por anticuerpos de la clase IgE. Estas reacciones se originan por la presencia de determinadas proteínas del látex (ver epígrafe 3). Se caracterizan porque la aparición de los síntomas tiene lugar en un período de tiempo corto, desde los pocos minutos hasta una hora después de la exposición a las mismas. Estos síntomas pueden limitarse a la zona de contacto o ser generalizados y varían desde manifestaciones más o menos leves (rinoconjuntivitis, urticaria, angioedema, asma bronquial) hasta algunas tan graves que pueden causar la muerte (choque anafiláctico). Reacciones de hipersensibilidad retardada o tipo IV, mediadas por células del sistema inmune. Los principales responsables de estas reacciones son los aditivos y otros compuestos (aceleradores, conservantes, antioxidantes, plastificantes, etc.) añadidos durante el proceso de fabricación del látex. En este caso, los síntomas se muestran a las 12-48 horas desde la exposición al látex en personas sensibilizadas previamente y, en general, consisten en la aparición de eccema en los dedos y el dorso de las manos. (3) La dermatitis irritativa es otro de los problemas asociados al contacto con objetos de látex, en especial guantes, que se ve favorecida por otros productos irritantes como jabones, detergentes, etc. Se trata de una manifestación cutánea no mediada por mecanismos inmunológicos. Localizada generalmente en las manos, sus síntomas son eritema, prurito, descamación y formación de vesículas. El látex también es uno de los agentes relacionados con mayor frecuencia con el asma ocupacional, sobre todo, entre el personal sanitario. Las partículas de látex se
Problemática de la alergia al látex y la detección de alérgenos - 11 dispersan en el ambiente y pueden causar sensibilización y provocar otros síntomas no bien definidos. Una de las principales vías para su dispersión es el polvo de almidón de maíz que se utiliza como lubricante en los guantes de látex y donde quedan absorbidas. Aparte de esto, las moquetas, alfombras y tapicerías junto con los sistemas de ventilación suelen ser reservorios importantes de estas partículas. (4) Por último, la alergia al látex se relaciona estrechamente con la alergia a ciertos alimentos, lo que se conoce como síndrome látex-frutas. Se debe a la similitud que existe entre algunas proteínas de los alimentos con determinadas proteínas del látex. En la tabla 3 se muestran los alimentos implicados en este síndrome y el tipo de asociación existente con la alergia al látex. (5) Tabla 3. Alimentos implicados en el síndrome látex-frutas y tipo de asociación que existe entre ellos y la alergia al látex. (5) Diagnóstico, tratamiento y prevención de la alergia al látex El diagnóstico de la alergia al látex se realiza mediante la historia clínica y la exploración física del paciente. En la historia clínica de las personas hipersensibles al látex se reflejan antecedentes de reacciones alérgicas como urticaria, rinitis, angioedema, anafilaxia, etc. inmediatas a la exposición a productos de látex y/ o a la ingestión de ciertos alimentos (plátanos, aguacates, kiwis y castañas, principalmente). Junto con la historia clínica es frecuente efectuar pruebas cutáneas (prick-test) que confirmen la sensibilización frente al látex. En ocasiones, también se llevan a cabo análisis para la detección de anticuerpos IgE específicos en sangre y pruebas de provocación controlada con látex. (3) En la actualidad, el tratamiento de la alergia al látex, fundamentalmente se basa en la prevención, el manejo sintomático y en el futuro, posiblemente la inmunoterapia. El tiempo y la frecuencia de exposición al látex son factores de riesgo que condicionan la aparición de la alergia. Por tanto, la medida básica para la prevención de la alergia al látex es evitar el contacto con productos de látex en cualquier ambiente (doméstico, escolar, laboral) lo que resulta muy complicado dada la ubicuidad de este material.
12 - Evaluación de los métodos analíticos actuales para alérgenos del látex En concreto, en el medio hospitalario la presencia de látex es altamente peligrosa para los pacientes y trabajadores sanitarios afectados por este tipo de alergia. En este ámbito las disposiciones preventivas generales que se proponen son: La creación de una comisión que coordine la atención médica del paciente alérgico y la prevención de alergia en el personal sanitario. La formación de los trabajadores sanitarios para evitar la alergia profesional al látex y facilitar el diagnóstico precoz de la enfermedad entre los pacientes. El desarrollo de protocolos de actuación para atender a los pacientes alérgicos al látex. La identificación de los materiales y productos sanitarios que pueden contener látex y la búsqueda de alternativas libres de este compuesto. (3)
Métodos analíticos para alérgenos del látex - 13 3. Métodos analíticos para alérgenos del látex Un alérgeno es una sustancia reconocida como "extraña" por el organismo de determinadas personas, cuya presencia desencadena en el mismo una respuesta inmunológica. Uno de los mecanismos que emplea el sistema inmune frente a los alérgenos es la liberación de anticuerpos o inmunoglobulinas, sobre todo, inmunoglobulinas tipo E (IgE). Estos anticuerpos reconocen y se unen de forma específica a un alérgeno concreto iniciando una serie de procesos que son los responsables de la sintomatología clínica de la alergia. En el látex se han identificado diversos alérgenos, todos de origen proteico. Por el momento, sólo trece de ellos se han clasificado con un nombre sistemático (tabla 4) pero existen otras moléculas de mayor o menor alergenicidad como la hevamina. Se ha comprobado que algunos de estos compuestos son capaces de soportar los procesos físico-químicos que se llevan a cabo en el procesado del látex. Por lo tanto, están presentes en los productos manufacturados y pueden originar reacciones alérgicas. Asimismo, se sospecha que durante la fabricación de los objetos y materiales de látex se forman nuevos alérgenos que sólo se encuentran en estos productos y no existen inicialmente en la goma natural. (6) Tabla 4. Denominación sistemática de los alérgenos del látex, su peso molecular y grado de alergenicidad (*EB: espina bífida). (3) (1)
14 - Evaluación de los métodos analíticos actuales para alérgenos del látex Aparte del contacto con materiales y objetos que contienen látex, otra vía de exposición difícil de controlar es la aérea. Las partículas de látex se consideran aeroalérgenos muy importantes, es decir, se trata de alérgenos que se transmiten por el aire con gran facilidad. Determinar la existencia de estos alérgenos en los productos manufacturados y en el ambiente reduciría el riesgo de sensibilización y desarrollo posterior de un cuadro clínico de alergia al látex. Los métodos analíticos aplicados a su detección y cuantificación disponibles en la actualidad pueden clasificarse en dos categorías: Métodos químicos como el método de Lowry modificado y el análisis de aminoácidos mediante cromatografía. La mayoría de los alérgenos son compuestos de naturaleza proteica. Algunas de las técnicas analíticas utilizadas en su detección se basan en determinar la cantidad de proteína total. En estos casos, se establece el contenido de proteínas extraíbles de la muestra sin obtener información concreta sobre la proporción de alérgenos presentes en ella. En estos ensayos se asume que la cantidad de proteína detectada se correlaciona con la capacidad del producto de desencadenar una reacción de hipersensibilidad. El método de Lowry modificado y el análisis de aminoácidos mediante cromatografía se han estandarizado para algunos productos. Habitualmente, estos procedimientos se emplean en estudios comparativos de distintas marcas comerciales, por ejemplo, para conocer el contenido de proteína total de los guantes de látex existentes en el mercado. (1) Métodos inmunológicos como los ensayos inmunoenzimáticos, la inmunoelectroforesis y la inmunodetección en membrana o Western Blot. Las técnicas inmunológicas se caracterizan por una mayor sensibilidad y especificidad. Al contrario que las anteriores, estos procedimientos detectan los alérgenos del látex y no se limitan a la cantidad total de proteína extraíble. Además, se trata de métodos rápidos que, en general, permiten el análisis simultáneo de varias muestras.
Métodos analíticos para alérgenos del látex - 15 3.1. Método de Lowry modificado Dentro de las técnicas basadas en el contenido de proteína total, una de las más utilizadas para la cuantificación de las proteínas del látex es el método de Lowry modificado. Se trata de un método químico bastante sencillo que permite determinar la cantidad total de proteínas solubles en agua, presentes en la goma natural y los productos fabricados con ella. En el método de Lowry modificado las proteínas se solubilizan mediante una disolución tampón y se separan por precipitación y centrifugación. Estas proteínas se suspenden posteriormente en un medio alcalino en presencia de iones de cobre al que se añade reactivo de Folin. La reacción que tiene lugar origina un color azul intenso que se mide por colorimetría (figura 2). Comparando los valores obtenidos con el patrón correspondiente se halla la cantidad de proteína total de la muestra. (7) (8) Figura 2. Método de Lowry modificado para determinar la cantidad total de proteínas solubles de una muestra. Puntos fuertes - Es reproducible; se trata de un método estandarizado. - Es bastante sencillo. - Puede implementarse como método de análisis rutinario en los controles industriales. - Los reactivos necesarios para este análisis se encuentran disponibles en kits. Puntos débiles - Cuantifica el contenido total de proteínas y no la cantidad de alérgenos. - Presenta algunas interferencias importantes por la falta de especificidad. No distingue entre las proteínas del látex y otras proteínas de la muestra (por ejemplo, las caseínas añadidas durante la fabricación de algunos productos como los guantes). - Su fiabilidad es menor si se analizan productos con contenidos de proteínas de látex pequeños. - Es poco sensible.
16 - Evaluación de los métodos analíticos actuales para alérgenos del látex 3.2. Cromatografía líquida de alta resolución Otro método químico para la determinación de la proteína total en productos que contienen látex es la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC en sus siglas inglesas). Las técnicas cromatográficas permiten la separación de los distintos componentes de una mezcla que se distribuyen entre dos fases, una fija o estacionaria y una móvil, para su detección posterior. En HPLC la fase estacionaria consta de multitud de partículas, con determinadas características químicas en su superficie, empaquetadas dentro de una columna mientras que la fase móvil es un líquido en el que se disuelven los componentes a separar. Cada uno de ellos interacciona de forma diferente con la fase estacionaria por lo que la atraviesan a distintas velocidades. A la salida de la columna un detector señala la presencia de estos componentes generando una señal que depende de la concentración, tipo de sustancia, etc. En la figura 3 se representa de forma esquemática la separación de dos compuestos por cromatografía líquida de alta resolución. Figura 3. Separación de los componentes A y B de una mezcla mediante cromatografía líquida de alta resolución y su detección posterior. Para los productos de látex se extraen las proteínas de la muestra y se someten a una hidrólisis completa que proporciona una mezcla de aminoácidos y péptidos de pequeño tamaño. Estas moléculas se separan en la columna cromatográfica y, finalmente, se cuantifican. Puntos fuertes - Puede utilizarse para evaluar la presencia de alérgenos del látex en distintos productos aunque sólo se ha validado clínicamente para los guantes. (1) Puntos débiles - Únicamente determina la cantidad total de proteínas pero no permite conocer el contenido de alérgenos de la muestra. - Esta técnica de análisis no puede emplearse en controles rutinarios. - El equipamiento de HPLC resulta costoso. - Requiere personal cualificado. (9)
Métodos analíticos para alérgenos del látex - 17 3.3. Ensayos inmunoenzimáticos tipo ELISA El ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima o ELISA (del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) se basa en la detección del alérgeno mediante un anticuerpo determinado. Los anticuerpos utilizados reconocen de forma específica ciertas zonas de la estructura de los alérgenos y se unen a estas moléculas formando un complejo alérgenoanticuerpo. Además, los anticuerpos tienen adherida en su superficie una enzima. Cuando se ha formado el complejo anterior y adicionando el sustrato adecuado, esta enzima cataliza una reacción que produce modificaciones (por ejemplo, un cambio de color en el medio) a partir de las cuales pueden cuantificarse los alérgenos presentes en la muestra. Los ensayos tipo ELISA se realizan habitualmente en un soporte sólido, como la placa de 96 pocillos que se muestra en la figura 4, sobre el que se inmovilizan bien los anticuerpos bien los alérgenos. Figura 4. Fotografía de una placa ELISA de 96 pocillos. En función del número de anticuerpos distintos que se emplean en cada ensayo y de la molécula que se detecta con la reacción enzimática (complejos alérgeno-anticuerpo, anticuerpos libres), se diferencian distintos test ELISA: directo, indirecto, competitivo, tipo sándwich, de inhibición, etc. En la detección de alérgenos del látex se utilizan concretamente el ELISA indirecto y el ELISA de inhibición, además de otros ensayos de características muy similares como el IEMA. Puntos fuertes - Los ELISA son mucho más sensibles que los métodos de detección de la proteína total como el método de Lowry. - Permiten procesar un gran número de muestras simultáneamente. - Los análisis son rápidos y permiten tener los resultados en el mismo día. - Tiene una especificidad elevada. No se producen interferencias por otras proteínas de la muestra (por ejemplo, las caseínas presentes en los guantes de látex) porque los anticuerpos sólo reconocen y se unen a los alérgenos. Puntos débiles - Los kits ELISA resultan costosos. - Sólo permiten detectar aquellos alérgenos que reconozcan los anticuerpos utilizados en el ensayo. En ocasiones, los resultados del análisis no se correlacionan directamente con el contenido real de alérgenos en una muestra.
18 - Evaluación de los métodos analíticos actuales para alérgenos del látex ELISA indirecto El ELISA indirecto se caracteriza por la participación de dos anticuerpos diferentes en cada ensayo, uno que reconoce al posible alérgeno y otro que tiene ligada una enzima y que se une a este primer anticuerpo. En esta técnica se inmovilizan inicialmente las proteínas extraídas de la muestra en los pocillos de la placa. A continuación, se añade una cantidad conocida de anticuerpos que reconocen algunas de las proteínas. Tras la formación de los complejos entre proteínas y anticuerpos se incorpora el segundo anticuerpo que también se une a estas estructuras. Por último, con la adición del reactivo correspondiente se produce una reacción, catalizada por la enzima ligada al segundo anticuerpo, que origina un compuesto coloreado en el medio. En la figura 5 se indican las diferentes etapas del ELISA indirecto. Figura 5. Esquema de las diferentes etapas que componen un ELISA indirecto. El ELISA indirecto aplicado a la detección de las proteínas del látex se conoce como LEAP (Latex ELISA for Antigenic Protein) y fue diseñado por la Fundación Guthrie de Pensilvania, EE.UU, en el año 1993. En el epígrafe "Catálogo de grupos de investigación" se proporciona más información sobre esta entidad. Además de los puntos fuertes y débiles generales expuestos en el epígrafe anterior para los test ELISA, el LEAP presenta las siguientes características: Puntos fuertes - Tiene una sensibilidad elevada. Varios anticuerpos marcados con enzimas pueden unirse al mismo complejo alérgeno-anticuerpo lo que amplifica la señal para su detección.
Métodos analíticos para alérgenos del látex - 19 Puntos débiles - Este ensayo resulta poco específico. Los anticuerpos empleados en él pueden unirse a algunas proteínas de la muestra que no corresponden con los alérgenos del látex. Esto se debe al proceso utilizado para la obtención de dichos anticuerpos. - En las muestras que contienen compuestos detergentes o una alta concentración de proteínas distintas a las del látex, estas moléculas impiden que las proteínas que se desea detectar se fijen en la placa. Este hecho puede producir resultados donde la cantidad de alérgenos detectada es inferior a la real. Para evitar este fenómeno se realizan diluciones seriadas de la muestra. - No se trata de un método estandarizado. (7) (9)
20 - Evaluación de los métodos analíticos actuales para alérgenos del látex ELISA de inhibición En el ELISA de inhibición también se utilizan dos anticuerpos distintos como en el LEAP. En este tipo de ensayos se realiza una primera fase (fase de inhibición) en la que las proteínas de la muestra se incuban con una cantidad conocida de anticuerpos específicos frente a los alérgenos de interés. Al finalizar esta etapa se tienen, por una parte, los complejos alérgeno-anticuerpo recién formados y, por otra, un número determinado de anticuerpos libres y el resto de proteínas de la muestra. Para la segunda fase de este análisis (fase de reacción) se prepara una placa ELISA donde se inmovilizan moléculas estandarizadas del alérgeno correspondiente en una proporción conocida. En sus pocillos se añade la mezcla resultante de la etapa anterior. Los anticuerpos que quedaron libres reaccionan ahora con los alérgenos fijados en el soporte. Su presencia se revela con la adición de un segundo anticuerpo ligado a una enzima y del reactivo adecuado para la formación de productos coloreados en el medio de reacción. La cantidad de alérgenos en la muestra es inversamente proporcional a la intensidad de color desarrollada. La figura 6 representa las etapas descritas para el ELISA de inhibición. Figura 6. Fases de inhibición y de reacción de un test ELISA de inhibición. Junto con las características generales para los test ELISA, el ELISA de inhibición presenta los siguientes puntos fuertes y débiles: Puntos fuertes - El ELISA de inhibición es un método estandarizado. - Se trata de un procedimiento analítico bastante sensible. (9) - Gracias a la primera fase de inhibición que se lleva a cabo en este tipo de ELISA se obtienen resultados más reproducibles comparados con otros test ELISA, como el LEAP.
Métodos analíticos para alérgenos del látex - 21 Puntos débiles - Este tipo de ELISA cuenta con una especificidad baja debido al método de producción de los anticuerpos utilizados en él. - En la segunda etapa del ensayo, la unión de los anticuerpos a los alérgenos inmovilizados en la placa puede inhibirse debido a la presencia de diversas sustancias procedentes del extracto del producto de látex natural.
22 - Evaluación de los métodos analíticos actuales para alérgenos del látex Ensayo inmunoenzimométrico A diferencia de las dos técnicas anteriores, en el ensayo inmunoenzimométrico o IEMA (ImmunoEnzyMetric Assay) se inmovilizan en la placa los anticuerpos frente al alérgeno que se desea detectar. Posteriormente se añade el extracto de proteínas obtenido de la muestra y se mantiene en incubación durante un tiempo para permitir la formación de los complejos alérgeno-anticuerpo. Estos complejos se detectan mediante la adición de un segundo anticuerpo marcado con una enzima que se une a ellos. Por último, se incorporan los reactivos correspondientes lo que desencadena un cambio de color en el medio como resultado de la reacción enzimática (figura 7). (10) Figura 7. Ensayo inmunoenzimométrico para la detección de los alérgenos presentes en una muestra. La empresa FIT Biotech de Finlandia ha patentado esta técnica inmunoenzimométrica para la detección de determinados alérgenos del látex. También ha desarrollado una serie de kits basados en ella que se denomina FITkit y comercializa la compañía estonia Quattromed (www.quattromed.com). En el epígrafe "Catálogo de empresas" se proporciona más información sobre este producto. Puntos fuertes - Estos kits permiten cuantificar individualmente algunos alérgenos del látex. - Se trata de un método sensible y reproducible. - Su especificidad es alta. No se producen interferencias causadas por otras proteínas distintas a los alérgenos que se desean detectar. (11) - Los kits basados en el IEMA pueden emplearse para detectar los alérgenos presentes en distintos materiales y objetos. Puntos débiles - El coste de estos kits puede resultar elevado.
Métodos analíticos para alérgenos del látex - 23 3.4. Inmunoelectroforesis La inmunoelectroforesis es una técnica cualitativa que permite la separación de los distintos componentes proteicos de una mezcla y su identificación posterior gracias al uso de anticuerpos específicos. En la inmunoelectroforesis se distinguen dos etapas que se representan en la figura 8. En la primera de ellas las proteínas de la muestra se cargan en un gel de agarosa. Bajo la acción de un campo eléctrico estas moléculas se desplazan a través del gel de un modo diferente según su carga eléctrica. En la segunda etapa se aplica un anticuerpo específico frente al compuesto que se desea detectar (por ejemplo, un alérgeno del látex) en un canal del gel paralelo al eje de migración de los componentes de la muestra. Los anticuerpos difunden por el gel y se unen a las moléculas que reconocen formando los complejos alérgeno-anticuerpo. Estas interacciones son visibles por la aparición de unas líneas de precipitación cuya posición y forma dependen de las características y concentración del alérgeno. Figura 8. Separación de los componentes A y B de una muestra mediante inmunoelectroforesis. Puntos fuertes - Esta técnica tiene una alta especificidad, permitiendo diferenciar sustancias con movilidades electroforéticas similares. Puntos débiles - Es un método cualitativo y no se ha estandarizado. - Con él sólo se detectan aquellos alérgenos para los que se disponga de su anticuerpo correspondiente. - Es una técnica que consume bastante tiempo, sobre todo, por los largos periodos de incubación (24-48 horas) que requiere. - Los complejos alérgeno-anticuerpo únicamente se forman si ambas moléculas se encuentran en una proporción determinada (relación de equivalencia) que debe hallarse en experimentos preliminares. - Cuando se analizan alérgenos con un peso molecular parecido pueden formar una única banda lo que no permite discriminar entre unos y otros.
24 - Evaluación de los métodos analíticos actuales para alérgenos del látex 3.5. Inmunodetección en membrana (Western Blot) La inmunodetección en membrana (o Western Blot) se asemeja a la inmunoelectroforesis descrita en el epígrafe anterior. En este caso, se lleva a cabo el fraccionamiento de las proteínas de la muestra mediante una electroforesis seguido de la transferencia de estas moléculas a una membrana sintética donde se procede a su caracterización con anticuerpos específicos. Inicialmente, las proteínas de la muestra se someten a un tratamiento para dotarlas de carga negativa (esta carga negativa es proporcional al peso molecular de cada proteína). Con la aplicación de un campo eléctrico estas proteínas cargadas se desplazan a través del gel de poliacrilamida hacia el polo positivo a velocidades distintas dependiendo de su masa. Cuando finaliza esta etapa pasan a una membrana de nitrocelulosa siguiendo el mismo patrón que presentan en el gel. La transferencia entre los dos soportes puede realizarse de distintos modos aunque lo más habitual es el empleo de una corriente eléctrica. A continuación, se prepara una disolución con anticuerpos frente a la proteína o alérgeno que se desea detectar. Durante la fase de incubación estos anticuerpos forman complejos con las proteínas de la membrana que reconocen. En ocasiones, se emplean sueros de pacientes alérgicos al látex donde los anticuerpos presentes son inmunoglobulinas tipo E específicas frente a los alérgenos del látex. En una segunda incubación se añade otro anticuerpo capaz de unirse al primero. Éste último tiene ligada una enzima que cataliza la formación de determinados compuestos coloreados insolubles. En la figura 9 se muestran las principales etapas de la inmunodetección en membrana o Western Blot. Figura 9. Inmunodetección en membrana o Western Blot para la detección del componente de interés (componente A) de una muestra compleja.
Métodos analíticos para alérgenos del látex - 25 Puntos fuertes -Es un método altamente específico. - En la inmunodetección en membrana las proteínas a analizar se encuentran más accesibles porque se sitúan en la superficie de la membrana sintética y no están embebidas en un gel como sucede en una inmunoelectroforesis. Puntos débiles - Este método no permite cuantificar los alérgenos detectados. - Su tiempo de realización es bastante largo, al menos se requieren 24 horas para obtener los resultados.
26 - Evaluación de los métodos analíticos actuales para alérgenos del látex 3.6. Evaluación y comparación de métodos analíticos En este punto se establece una comparativa entre los distintos métodos analíticos descritos en este informe. Para ello se ha considerado una serie de características que se enumeran a continuación: Tipo de análisis: clasificación en métodos químicos o inmunológicos. Estandarización: técnicas estandarizadas por alguno de los organismos nacionales o internacionales de estandarización. Especificidad: capacidad de un método analítico para distinguir el compuesto de interés, en este caso un alérgeno del látex, entre otros de características muy similares. Para el LEAP y el ELISA de inhibición puede obtenerse una especificidad mayor si se emplean determinados anticuerpos (inmunoglobulinas tipo E). Coste de la instrumentación: inversión para disponer del equipamiento necesario para cada técnica analítica. Cualificación del personal: grado de especialización del grupo de trabajo requerido para efectuar los análisis. Correlación con la respuesta alérgica: correlación entre las proteínas detectadas por un método concreto y la respuesta alergénica obtenida mediante prick test (prueba cutánea realizada al paciente para confirmar su sensibilización frente al látex). Reproducibilidad: capacidad de obtener el mismo resultado en mediciones diferentes realizadas en las mismas condiciones a lo largo de periodos dilatados de tiempo. En este caso, se expresa el porcentaje de la variación entre las mediciones. Sensibilidad o límite de detección: capacidad para detectar compuestos presentes en la muestra en concentraciones muy pequeñas. Para este estudio se indica la concentración más baja que la técnica analítica es capaz de detectar (en µg/g de producto). Tiempo de análisis: tiempo que consume el análisis de una muestra sin considerar el proceso de extracción de las proteínas del látex. Coste del análisis: coste aproximado sin IVA del análisis de una muestra de acuerdo con los precios establecidos por los servicios de análisis de varias entidades consultadas. Para la recopilación de los datos necesarios en este estudio comparativo se ha solicitado la colaboración de varios investigadores y empresas nacionales e internacionales, que son expertos en las técnicas analíticas consideradas, además de revisar la información indicada en las siguientes referencias bibliográficas: T. Palosuo, S. Makinen-Kiljunen, H. Alenius, T. Reunala, E. Yip y K. Turjanmaa (1998) Measurement of natural rubber latex allergen levels in medical gloves by allergen-specific IgE-ELISA inhibition, RAST inhibition, and skin prick test. Allergy. vol. 53 (1), pág. 59-67. T. Palosuo, H. Alenius y K. Turjanmaa (2002) Quantitation of latex allergens. Methods, vol. 27, nº 1, pág. 52-58. D.H. Beezhold, D.A. Kostyal y V.J. Tomazic-Jezic (2002) Measurement of latex proteins and assessment of latex protein exposure. Methods, vol. 27, pág. 46-51.
Métodos analíticos para alérgenos del látex - 27 European Commission, Directorate General XII, Science, Research and Development. Directorate C: Industrial and Material Technologies Programm Measurements and Testing. Proyecto de investigación. Nº de referencia: MAT-1-CT 940060. En la tabla 5 se muestra de forma resumida la comparación entre las distintas técnicas analíticas aplicables a los alérgenos del látex considerando el listado de características mencionado anteriormente. Esta comparación se realiza tomando tres valores para cada característica (alto, medio o bajo) como se indica en la leyenda. Por último, en la siguiente tabla se recogen algunos datos más específicos para aquellas técnicas analíticas que permiten cuantificar los alérgenos (o proteínas) del látex: Tabla 5. Resumen de las principales características de los métodos analíticos descritos en este informe, que pueden emplearse para la detección y cuantificación de los alérgenos del látex en productos de uso cotidiano y médico.
28 - Evaluación de los métodos analíticos actuales para alérgenos del látex Tabla 6. Datos correspondientes a varias características consideradas para la comparación de algunas de las técnicas analíticas recogidas en este informe. (6) (7) (12) (13)
Métodos analíticos para alérgenos del látex - 29 3.7. Propiedad industrial El número de patentes y solicitudes de patente identificadas en relación con el análisis de alérgenos del látex en productos de uso cotidiano y médico es escaso. Se han localizado cinco invenciones que se detallan a continuación. Tres de ellas describen la producción de proteínas alergénicas del látex, otra trata sobre la obtención de anticuerpos frente a los alérgenos del látex y la restante se refiere a un método inmunológico para su detección. EP1604996 Complejo proteico alergénico de la goma natural Tipo de documento Solicitud de patente de invención A2. Fecha de publicación 14/12/2005 Solicitante (país) Instituto de Investigaciones sobre el Caucho (Malasia). Contenido técnico Producción de la proteína alergénica del látex Hev b 4 y de anticuerpos frente a ella para su utilización en ensayos de cuantificación de este alérgeno en productos fabricados con látex. EP1350798 Proteína alergénica Hev b 3 de la goma natural, su producción y uso en ensayos Tipo de documento Solicitud de patente de invención A1. Fecha de publicación 08/10/2003 Solicitante (país) Universiti Sains Malaysia (Malasia) Instituto de Investigaciones sobre el Caucho (Malasia). Contenido técnico Producción de la proteína alergénica del látex Hev b 3 y su utilización en ensayos de cuantificación de este alérgeno en la goma natural y en productos fabricados con látex.
30 - Evaluación de los métodos analíticos actuales para alérgenos del látex WO2001061305 Métodos inmunoquímicos Tipo de documento Solicitud de patente de invención vía PCT (Tratado de Cooperación en Materia de Patentes). Fecha de publicación 23/08/2001 Solicitante (país) FIT Biotech (Finlandia). Contenido técnico Método de análisis inmunológico que permite la detección de los alérgenos del látex presentes en productos fabricados con goma natural. WO199507298 Antígenos de la goma natural asociados a alergias Tipo de documento Solicitud de patente de invención vía PCT (Tratado de Cooperación en Materia de Patentes). Fecha de publicación 16/03/1995 Solicitante (país) Ansell Inc. (EE.UU.) Contenido técnico Obtención de anticuerpos frente a una proteína alergénica del látex y su utilización en la determinación de los alérgenos del látex en productos fabricados con este material. US6759517 Proteínas alergénicas de la goma natural, su producción y uso en ensayos Tipo de documento Patente de invención. Fecha de publicación 06/07/2004 Solicitantes (país) Universiti Sains Malaysia (Malasia) Instituto de Investigaciones sobre el Caucho (Malasia). Contenido técnico Producción de proteínas alergénicas del látex y su utilización en ensayos de cuantificación de alérgenos del látex en la goma natural y en productos fabricados con látex.
Métodos analíticos para alérgenos del látex - 31 Además, se han localizado otras seis invenciones (una de ellas correspondiente a una empresa española) vinculadas a la alergia al látex que se recogen en la siguiente tabla. La mayor parte de estos casos también describen la obtención de anticuerpos y proteínas alergénicas del látex. Sin embargo, a diferencia de las anteriores en estas patentes y solicitudes no se reivindica específicamente su aplicación para detectar la presencia de alérgenos en productos de uso cotidiano y médico. Tabla 7. Otras patentes relacionadas con la alergia al látex.
32 - Evaluación de los métodos analíticos actuales para alérgenos del látex 4. Catálogo de empresas A continuación, se enumeran las empresas vinculadas a la detección de los alérgenos del látex que se han identificado. La información correspondiente a cada una de ellas se presenta en unas fichas donde se indican los datos de contacto y la página web de la compañía, una breve descripción sobre ella, los productos y servicios que ofrecen relacionados con el tema de interés de este informe y las vías para adquirirlos y solicitarlos así como los distribuidores para nuestro país. Para identificar de forma rápida el tipo de producto/ servicio de que disponen las empresas según los métodos analíticos descritos anteriormente se utilizan los siguientes iconos: 4.1 Productos y servicios de detección En este punto se detallan las empresas que comercializan productos y/o cuentan con servicios de análisis para la detección de los alérgenos del látex en distintos objetos y materiales. Se han encontrado seis empresas en total entre las que destaca la compañía Quattromed que dispone de kits específicos para la determinación de varios alérgenos del látex por un método inmunológico.
Catálogo de empresas - 33 Sigma Aldrich Química S.A. www.sigmaaldrich.com Datos de contacto Ronda de Poniente, 3, 2ª planta, apdo. de correos 278 28760 Tres Cantos (Madrid) Tel.: 900 101 376 Fax: 900 102 028 Correo electrónico: escustsv@sial.com Descripción Filial española del grupo empresarial Sigma-Aldrich Corp. dedicado a la producción y comercialización de un amplio catálogo de productos químicos y biológicos, kits, reactivos y suministros de laboratorio para la investigación científica en ciencias de la vida, biotecnología y química y para el desarrollo y la fabricación farmacéutica y química. Productos Kits compuestos por distintos reactivos químicos para determinar el contenido total de proteína de una muestra de acuerdo con el método de Lowry modificado: Total Protein Kit TP0200 Este kit tiene un precio de 71,50 a + IVA y permite realizar alrededor de 50 ensayos. Total Protein Kit TP0300 El precio de este producto es 129,50 a + IVA y con él pueden llevarse a cabo unos 200 ensayos. Persona de contacto José Martínez Valentín Dpto. Atención al Cliente Tel.: 916 572 069 Fax: 914 905 783 Correo electrónico: jose.martinez@sial.com Solicitud de productos La propia empresa distribuye estos productos en nuestro país. A través de su página web puede accederse a un servicio de compras en línea: www.sigmaaldrich.com/area_of_interest/europe_home/spain/pedidos.html
34 - Evaluación de los métodos analíticos actuales para alérgenos del látex Pierce Biotechnology Inc. www.piercenet.com Datos de contacto 3747 N. Meridian Road, P.O. Box 117 Rockford, 61105 Illinois (EE.UU.) Tel.: +815 968 0747 Fax: +815 968 8148 Correo electrónico: cs@piercenet.com Descripción Pierce Biotechnology forma parte del Grupo multinacional Thermo Fisher Scientific dedicado a la comercialización de equipos e instrumentación analítica y diversos suministros de laboratorio. Esta compañía se centra concretamente en el desarrollo y distribución de productos para la investigación en proteómica. Productos Modified Lowry Protein Assay Kit Kit que contiene los reactivos necesarios para realizar ensayos de cuantificación de la proteína total de una muestra mediante el método de Lowry modificado. Este kit permite realizar alrededor de 480 ensayos. Su coste es de 164,45 a + IVA y para pedidos inferiores a 180 a hay que añadir 20 a + IVA de gastos de envío. Persona de contacto Elena Torres Responsable de Atención al Cliente, Cultek S.L. Tel.: 913 340 027 Fax: 913 581 761 Correo electrónico: etorres@cultek.com Solicitud de productos En España los productos de Pierce se distribuyen a través de la empresa: Cultek S.L. www.cultek.com Avda. Cardenal Herrera Oria, 63 Tel.: 917 290 333 Fax: 913 581 761 28034 Madrid Correo electrónico: info@cultek.com
Catálogo de empresas - 35 Geno Technology Inc. www.gbiosciences.com Datos de contacto 92 Weldon Parkway, St. Louis, 63043-9989 Missouri (EE.UU.) Tel.: +314 991 6034 Fax: +314 991 1504 Correo electrónico: genoteca@gbiosciences.com Descripción Geno Technology está especializada en el desarrollo de nuevos productos para la investigación en ciencias de la vida, en concreto, en los campos de proteínas y ácidos nucleicos. Entre la amplia variedad de productos que ofrecen se encuentran ensayos para proteínas, kits de electroforesis, purificación de proteínas, inhibidores de proteasas, kits para el aislamiento de plásmidos, ADN genómico y ARN, etc. Productos Lowry Protein Assay Kit formado por diversos reactivos para la determinación del contenido total de proteínas de una muestra basado en el método de Lowry modificado. Este producto se ha diseñado con fines educativos y permite el análisis de un número de muestras reducido (24 muestras/ kit). Persona de contacto Sol Recober Responsable de Ventas, S.G. Servicios Hospitalarios S.L. Correo electrónico: pedidos@sgsh.es Solicitud de productos En España los productos de Geno Technology los distribuye la empresa: S.G. Servicios Hospitalarios S.L. www.sgsh.es c/ Costa Brava, 25-29, local 6. Tel.: 93 284 97 77 Fax: 93 284 43 08 08030 Barcelona. Correo electrónico: sgsh@sgsh.es
36 - Evaluación de los métodos analíticos actuales para alérgenos del látex Bio-Rad Laboratories S.A. www.bio-rad.com Datos de contacto Edificio «M» Miniparc II C/ Caléndula, 95, Soto de la Moraleja 28109 Alcobendas (Madrid) Tel.: 915 905 200 Fax: 915 905 217 Descripción Bio-Rad Laboratories es una multinacional que lleva cincuenta años proporcionando productos y servicios para el diagnóstico clínico y la investigación en ciencias de la vida. Se dedica a la fabricación y distribución de productos para electroforesis, cromatografía, inmunoensayos, microbiología, bioinformática, etc. En nuestro país cuenta con dos sedes, una en Barcelona y otra en Madrid. Productos Dos kits que incluyen los reactivos químicos para llevar a cabo la determinación del contenido total de proteínas mediante el método Lowry modificado: DC Protein Assay Este kit permite realizar aproximadamente 450 ensayos y tiene un precio de 208 a + IVA. RC DC Protein Assay Al igual que el anterior, este kit permite analizar alrededor de 450 muestras y su precio es 331 a + IVA. Solicitud de productos Para solicitar estos productos puede contactarse por teléfono con la delegación de Bio-Rad en Madrid o bien realizar los pedidos a través de la página web.
Catálogo de empresas - 37 Nelson Laboratories Inc. www.nelsonlabs.com Datos de contacto 6280 S. Redwood Road Salt Lake City, 84123 Utah (EE.UU.) Tel.: 801 290 7500/ 800 826 2088 Fax: 801 963 2630 Correo electrónico: clientservices@nelsonlabs.com Descripción Desde el año 1985 Nelson Laboratories proporciona servicios de análisis y control de calidad de diversos productos, como equipos y dispositivos de uso médico y farmacéutico, evaluación de materiales barrera y envases, establecimiento de buenas prácticas en bancos de tejidos, etc. Servicios Modified Lowry Protein Assay Detección del contenido total de proteínas en guantes a partir del método de Lowry modificado según el protocolo estandarizado estadounidense ASTM D5712. Latex ELISA for Antigenic Protein (LEAP) Cuantificación de los alérgenos del látex mediante un test ELISA indirecto o LEAP (Latex ELISA for Antigenic Protein).
38 - Evaluación de los métodos analíticos actuales para alérgenos del látex Quattromed Ltd. www.quattromed.com Datos de contacto Nooruse 9, 50411 Tartu (Estonia) Tel.: +372 737 7070 Fax: +372 737 7077 Correo electrónico: quattromed@quattromed.com Descripción Creada en el año 1999 esta empresa biotecnológica surge como una spin-off de la Universidad de Tartu. Cuenta con unos 80 empleados y se dedica principalmente al diagnóstico molecular y la investigación farmacéutica. En 2005 adquiere las áreas de negocio relativas a anticuerpos monoclonales y kits de detección de los alérgenos del látex de la compañía finlandesa FIT Biotech (www.fitbiotech.com). Productos FITkit Serie de kits para la determinación de los alérgenos del látex Hev b 1, Hev b 3, Hev b 5 y Hev b 6.02. Éstos son los alérgenos más relevantes desde el punto de vista clínico en las reacciones alérgicas frente al látex que conservan su capacidad alergénica en el producto manufacturado. Si se adquieren por separado el precio del kit es 350 a + IVA mientras que los cuatro juntos ascienden a 1.400 a + IVA. Cada kit permite analizar un total de 40 muestras. Servicios Servicio de análisis FITkit Detección y cuantificación de los alérgenos del látex Hev b 1, Hev b 3, Hev b 5 y Hev b 6.02 en distintos productos de uso cotidiano y médico mediante los kits FITkit. El coste de este servicio es de 120 a + IVA por muestra, con descuentos especiales en función del número de muestras a analizar y en el caso de proyectos de larga duración. Persona de contacto Hardi Tamm Responsable de Ventas y Marketing Tel.: +372 737 7045 Móvil: +372 515 0857 Correo electrónico: hardi.tamm@quattromed.com