Métodos de análisis biomédicos

Métodos de análisis biomédicos 1

Aplicación de la biología molecular en medicina *Estudio y diagnóstico de enfermedades producidas por alteraciones genéticas (hereditarias ó somáticas) y aquellas producidas por patógenos (virus, bacteria, parásitos y hongos).. *Terapia (inmunoterapia, terapia génica)...... *Producción de proteínas de interés farmacológico (hormonas, vacunas). *Determinación de identidad y afiliación.. 2

Métodos moleculares de análisis biomédicos Comprende métodos de análisis a nivel molecular o sea estudios a nivel de DNA, RNA y proteínas que permitan tener un mayor conocimiento de una enfermedad dada, que puedan ser utilizados para desarrollar un diagnóstico seguro de la misma, un seguimiento de su evolución, una terapia y prevención (vacunas). 3

Dada una enfermedad, interesa determinar: El agente causante El gen afectado Los mecanismos de acción que operan en una enfermedad Los parámetros que caracterizan la enfermedad en distintos estadios El blanco para drogas Otros posibles estrategias de terapia Diseño de vacunas El efecto de la terapia sobre la progresión de la enfermedad La susceptibilidad de un individuo a tener una determinada enfermedad La susceptibilidad a tener una reacción favorable a un tratamiento 4

Historicamente el estudio de un estado patológico consistió: Observación del enfermo El desarrollo de la microscopía, el cultivo in vitro de microorganismos y la inmunología permitieron un avance en el conocimiento del agente causal Avance en el conocimiento del ADN Desarrollo de los Acs monoclonales y las técnicas de hibridación del ADN (Southern blot). Impacto en el diagnóstico, estudio de la evolución e influencia de una terapia Permitió contar con una cantidad ilimitada de Acs y con especificidad a determinado epitope Permitió detectar el total del ADN extraído de una muestra, la presencia o la alteración de una molécula de ADN determinada Avance en el desarrollo de inmunoensayos: determinación de Ag y Ac en fluídos o extractos o en el tejido in situ (Inmunohistoquímica). Citometría de flujo. También desarrollo en la tecnología de hibridación in situ (detección de ADN o ARN específico en células intactas por hibridación con sonda marcada y observación microscópica o autoradiografía) Avance en la tecnología de marcadores no isotópicos 5

El 2do anticuerpo puede estar marcado con: Fluoróforos Enzima Biotina Streptavidina conjugada a Enzima Digooxigenina Ac anti Digo conjugado a Enzima Las enzimas más usadas: peroxidasa y la fosfatasa alcalina Los sustratos pueden ser cromóforos o pueden Ser quimioluminiscentes. 6

Historicamente el estudio de un estado patológico consistió: Observación del enfermo El desarrollo de la microscopía, el cultivo in vitro de microorganismos y la inmunología permitieron un avance en el conocimiento del agente causal Desarrollo de los Acs monoclonales y las técnicas de hibridación del ADN (Southern blot). Impacto en el diagnóstico, estudio de la evolución e influencia de una terapia Permitió contar con una cantidad ilimitada de Acs y con especificidad a determinado epitope Avance en el desarrollo de inmunoensayos: determinación de Ag y Ac en fluídos o extractos o en el tejido in situ (Inmunohistoquímica). Citometría de flujo. Permitió detectar el el total del ADN extraído de una muestra, la presencia o la alteración de una molécula de ADN determinada También desarrollo en la tecnología de hibridación in situ (detección de ADN o ARN específico en células intactas por hibridación con sonda marcada y observación microscópica o autoradiografía) Avance en la tecnología de marcadores no isotópicos 7

Marcación mediada por actividad enzimática A partir de DNA o cdna: Introducción de nucleótido modificado mediante el método de Random Primer, Nick traslation, por actividad de la deoxinucleotidil transferasa ó durante la amplificación por PCR (utilizando dntp marcado o oligonucleótidos cebadores marcados). Incorporación de 32 P al extremo 5 por acción de la T4 DNA kinasa. En la obtención del cdna: introducción de nucleótido modificado durante la reacción sobre el mrna con la Transcriptasa Reversa ó durante la amplificación por RT- PCR. dntp Biotina Streptavidina-Enzima Fluoróforo Marca radioactiva Digooxigenina AntiDigo-enzima Aminohexil derivado de datp Obtención de sonda marcada Ej.: 12-dUTP o 14-dATP fluoresceína Cy3-dCTP, Cy5-dCTP, biotin11-dutp Marcación química: Marcación con Psoraleno derivatizado con grupo amino unido a biotina, fluoróforo o digooxigenina 8

Desarrollo de la Tecnología de ADN recombinante Clonado del gen en cuestión (Vectores de clonado) Clonado en vectores de expresión amplificación Técnicas de secuenciación Utilización como sonda Genoma Diagnóstico Estudio de polimorfismos Obtención de la proteína en un sistema heterólogo en grandes cantidades Obtención de Acs policlonales o monoclonales Para utilizar en inmunoensayos Utilización como Ag en inmunoensayos Producción de vacunas Otros desarrollos importantes: Detección e identificación de ARN: Northern blot Detección e identificación de proteínas: Western blot 9

Secuenciación: Método de Sanger DNA templado Oligonucleótido dntps (uno marcado) ddntp: 4 reacciones, cada una con un ddntp distinto Fragmento klenow de la ADN Polimerasa 5'-GAATGTCCTTTCTCTAAG GGAGACTTACAGGAAAGAGATTCAGGATTCAGGAGGCCTACCATGAAGATCAAG-5' 10

Automatización Oligonucleótido marcado con fluorescente Terminador de cadena marcado con fluorescente 11

Geles de acrilamida Electroforesis capilar y detección Cromatograma Desventaja: el ADN secuenciado tiene que estar en alta concentración (la amplificación puede producir errores) 12

Pirosecuenciación ADN simple cadena ADN polimerasa dntp (agregados por orden) Enzimas que permiten la emisión de luz por cada base incorporada La polimerasa elonga base por base la hebra complementaria. Por cada base incorporada se emite luz. Se controla la adición de las dntp a la reacción. A partir del patrón de luz emitido se decodifica la secuencia. 1) 2) 3) APS:adenosina 5 fosfosulfato 4) datpαs por datp Secuenciación por microarray Secuenciación por tecnología de nanoporos Microscopía de fuerza atómica 13

Tecnología de ADN recombinante Clonado del gen en cuestión amplificación Clonado en vectores de expresión Técnicas de secuenciación Utilización como sonda Genoma Diagnóstico Estudio de polimorfismos Obtención de la proteína en un sistema heterólogo en grandes cantidades Obtención de Acs policlonales o monoclonales para utilizar en inmunoensayos Utilización como Ag en inmunoensayos Producción de vacunas Otros desarrollos importantes: Detección e identificación de ARN: Northern blot Detección e identificación de proteínas: Western blot 14

1985: Gran impacto, el desarrollo de la técnica de PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) 15

PCR: amplificación específica de ADN Por su alta sensibilidad, rapidez y especificidad es el método de mayor aplicación actual tanto para la detección, identificación, tipificación y cuantificación de patógenos así como para el estudio y detección De enfermedades genéticas. También se utiliza para la obtención de sondas marcadas para ensayos de hibridación Se marca durante la reacción utilizando dntp u oligos marcados o se marca el producto de la reacción. 16

RT-PCR 17

PCR PCR in situ (IS-PCR) (IS-RT-PCR) Multiplex PCR PCR cuantitativa PCR en tiempo real 18

Otros métodos de amplificación de nucleótidos (NAT) LCR: Reacción en cadena de la ligasa 19

Amplificacion mediada por transcripcion (TMA) (amplificación de RNA) Isotérmica Oligonucleotido complementario a blanco que esta unido a secuencia que codifica para promotor del fago T7 Transcriptasa reversa que usa como molde RNA o DNA y que tiene actividad de RNAsa T7 RNA polimerasa 20

SDA (strand displacement amplification) Isotérmica 4 primers, klenow, dntps 2 de los primers tienen sitio HincII en el extremo 5 Amplificación exponencial 21

Inmunoensayo con amplificación de ADN por circulo rodante (InmunoRCA) También se puede amplificar oligo con PCR (InmunoPCR). 22

Sensores Químicos Dispositivo que responde a moléculas de un analito en particular de manera selectiva y permite detectarlo cualitativamente o cuantitativamente en una matriz compleja. Biosensores de afinidad Tecnología para estudiar interacción entre moléculas en tiempo real. Esto puede aplicarse a interacción ADN-ADN (ARN) o Ag-Ac, proteína-proteína. Permite medir velocidad de interacción, cuantificación y diagnóstico. Componentes básicos de un sensor. Eventos importantes: Reconocimiento molecular específico Transdución (Generación de una señal) Amplificación de la señal Registro de la señal 23

Se captura uno de los interactantes sobre la superficie del sensor. La muestra conteniendo el otro interactante se inyecta sobre la superficie. Una luz de determinada longitud de onda se dirige a la superficie del sensor y los eventos de unión biomolecular se detectan como un cambio en el ángulo de la luz reflejada. Este cambio es medido continuamente obteniéndose un sensograma. Se tiene así un monitoreo del progreso de una asociación o una disociación biomolecular. Se aplica a unión entre proteínas, ác. nucleicos, carbohidratos, lípidos. En esta tecnología se combina el desarrollo de microchips con el bio-material sensor unido y la medición de la interacción de las moléculas que se quieren cuantificar por monitoreo de cambios en la superficie (resonancia de superficie del plasmón / Biacore) o cambios en en el peso (microbalanza de cuarzo) que se traducen en señales ópticas, eléctricas ó acústicas en función del tiempo. Aplicaciones 24

Nanotubos de carbón o de silicio: muy sensibles a perturbaciones electrónicas Aplicación en estudios de interacción ADN-ADN. Cambios en conductividad. Los nanotubos forman una red entre los dos electrodos del chip. Se inmoviliza a los nanotubos la sonda desnaturalizada. Se agrega el ADN target. La conductancia va a cambiar (disminuir) ante la presencia de ADN doble cadena en lugar del simple cadena. 25

Era postgenómica Proteómica Microarrays Genoma Genómica Funcional Proteómica Identificación sistematizada de las proteínas contenidas en una mezcla compleja determinación de la abundancia relativa de cada proteína al comparar dos muestras (proteómica diferencial): estado sano vs enfermo en un órgano o tipo celular determinado, efecto en el proteoma de un tejido la infección con determinado patógeno. Estudio de interacción proteína-proteína Proteómica estructural 26

GELES 2D Separación por carga y masa molecular Identificación Espectrometría de masa y bases de datos de proteínas y secuencias de genes. 27

El análisis de proteínas o péptidos por MS puede ser dividido en dos metodologías : Análisis del mapa de masas peptídicas de una proteína: los péptidos obtenidos de la tripsinización de la proteína en cuestión se cargan mediante el proceso de Maldi (matrix-assisted laser desorption/ Ionization) y se someten al espectrómetro de masa (análisis TOF) obteniendose un espectro de masas peptídicas que se comparan con la masa de los péptidos que se obtendrían por la Hipotética hidrólisis de las proteínas que se encuentran en la base de datos. Análisis de aminoácidos:conocido como espectrometría de masa en tandem, MS-MS o espectrometría de masa por nanoelectrospray Cada uno de los peptidos se fragmentaen péptidos más pequeños Y a partir de las masas obtenidas se deduce la secuencia de aa. La metodología de Maldi-TOF también se puede usar para análisis de ácidos nucleicos 28

Geles 2D Sirve para resolver proteínas que sufrieron modificaciones post-traduccionales Desventajas: Proteínas muy hidrofóbicas no entran al gel No resuelve proteínas muy ácidas o muy básicas (pi 3 o 10) No detecta proteínas poco abundantes LC o EC y MS 29

Método de Proteómica diferencial Determinación diferencial por Electroforesis bidimensional 2D-DIGE ICAT (isotope-coded affinity tag) 30

SILAC (Stable isotop labeling with amino acid in celll culture 31

Interactoma: 2 estrategias Purificación del complejo y estudio del proteoma / co-inmunoprecipitación Proteómica reversa: se prepara una proteína a partir de la expresión del gen o un set completo de proteínas a partir de la expresión de todos los genes del genoma y se examina su interacción con otras proteínas. Estudio de interacción por técnicas in vitro Pull down: proteína bait Mezcla por purificación proteína prey Por expresión en sistema heterólogo Etiquetar con moléculas marcadoras reactivas Expresar la proteína como Proteína de fusión Transcripción-traducción in vitro TAP (etiquetado en tandem) Muestra (pray) bait BIA-MS-MS (Biacore-espectrometría de masa en tandem) 32

Técnicas que se adaptan a la identificación de interacciones desconocidas en gran escala Doble híbrido 33

Phage Display Microarrays 34

Aplicaciones de estudios de interacción Importancia para la identificación de interacciones entre componentes del organismo huésped y del patógeno que puede constituir un blanco para una posible terapia Identificación de epitopes que reaccionan con los anticuerpos generados ante una infección, para diagnóstico. Identificación de epitopes o anticuerpos que reaccionan con moléculas expuestas en células cancerosas: para ser utilizadas en terapia o diagnóstico. Proteómica estructural: Determinación de estructura y conformación tridimensional de las proteínas identificadas. En base a modelos se pueden predecir estructuras a partir de la secuencia de aa. La proteómica estructural permite estudiar la relación estructura-función y diseñar inhibidores en base a la estructura. 35

Microarrays Microarray o biochips: Arreglo ordenado de muestras biológicas tales como ADN genómico, cadns, oligonucleótidos, proteínas o tejidos sobre una superficie (matriz bidimensional.) Aplicación: en determinación de polimorfismos y mutaciones en ADN, tipificación, en estudio de expresión de genes y en proteómica 36