Análisis de Progenies para la identificación de Progenitores Múltiplex con resistencia extrema al PVY o PVX Mihovilovich, E.; Bonierbale, M. CIP 2009
La identificación de progenitores múltiplex con resistencia extrema al PVY o PVX se realiza a través del análisis de sus progenies generadas en una cruza de prueba. La progenie de una cruza de prueba resulta del cruce de un clon fenotípicamente con resistencia extrema con otro susceptible al PVY o PVX, según sea el caso. Tomando como ejemplo la herencia monogénica de la resistencia extrema al PVY, en el cuadro 1 se muestra las frecuencias esperadas en plantas tetraploides para diferentes dosis del alelo Ry. Cuadro 1 Frecuencias esperadas para diferentes dosis del alelo de resistencia extrema al virus Y, Ry, en cruzas de prueba de papas tetraploides Cruce de Prueba Genotipo Clon Resistente X Clon Susceptible Frecuencias Esperadas Segregación por cromosomas al azar Segregación por cromátidas al azar Símplice Ryryryry X Nulíplice ryryryry 1 R : 1 S 0.86 R : 1 S Dúplice RyRyryry X Nulíplice ryryryry 5 R : 1 S 3.7 R : 1 S Tríplice RyRyRyry X Nulíplice ryryryry 1 R : 0 S 27 R : 1 S Cuadrúplice RyRyRyRy X Nulíplice ryryryry 1 R : 0 S 1 R : 0 S Si el clon con resistencia extrema presenta el alelo en una sola dosis, su genotipo para el locus de resistencia extrema al PVY será símplice, y la frecuencia esperada de resistentes y susceptibles en su progenie de cruza de prueba será de un resistente por cada susceptible bajo segregación de cromosomas al azar, mientras que una frecuencia ligeramente menor de resistentes se esperará bajo segregación por cromátidas al azar. La segregación por cromátidas al azar es un fenómeno común en poliploides que tiene lugar cuando el locus en cuestión se encuentra lejos del centrómero, tal es el caso del locus del gen Ry proveniente de Solanum tuberosum ssp andigena. Asimismo, cuando el clon presenta el alelo en doble dosis, su genotipo será dúplice y la frecuencia esperada será de 5 resistentes por cada susceptible, y una proporción ligeramente menor de resistentes bajo segregación por cromátidas al azar. Finalmente, cuando el alelo está en triple o cuádruple dosis, el genotipo será tríplice o cuadrúplice y se esperará que toda la progenie sea resistente. Sin embargo, bajo segregación por cromátidas al azar, se espera que los tríplices segreguen unos cuantos individuos susceptibles. Cálculos Estos podrán realizarse con datos propios, utilizando el archivo en EXCEL adjunto con el mismo nombre. 2
Cálculo de Frecuencias Observadas. (Para realizar el análisis con datos propios, utilizar la hoja denominada Frecuencias Observadas del archivo en EXCEL) Como primer paso del análisis, se calculará el total de individuos susceptibles a partir de los datos de las evaluaciones de las progenies inoculadas. Para ello, se suman los totales de plántulas con mosaicos, necrosis o con ambos síntomas. Se calcula también, el total de plántulas evaluadas, sumando el total de plántulas susceptibles con el total de plántulas sanas 3
. Arrastramos el Mouse de la celda de las columnas donde se hizo el cálculo de total de individuos susceptibles y total de plántulas evaluadas, para que se realice automáticamente los mismos cálculos para las progenies de los genotipos restantes. El total de plántulas susceptibles y sanas serán las frecuencias de individuos susceptibles y resistentes observados, respectivamente, que se utilizarán en los análisis de Chi-Cuadrado para la identificación de progenitores múltiplex 4
Análisis de chi-cuadrado para la identificación de progenitores símplices (Para realizar el análisis con datos propios, utilizar la hoja denominada Chi-Cuadrado Símplice del archivo en EXCEL). Para realizar este análisis, debe calcularse previamente las frecuencias esperadas de segregación de un progenitor símplice para el total de plántulas evaluadas por progenie en nuestro experimento. Para ello, multiplicamos el total de plántulas evaluadas, por la probabilidad de susceptibles esperados (p=0.5), y por la probabilidad de resistentes (p=0.5) esperados para un símplice bajo segregación de cromosomas al azar. 5
Inmediatamente después, nos colocamos en la celda donde realizaremos la prueba de chicuadrado y seleccionamos dentro de la categoría Statistical del EXCEL, la función CHITEST, y luego hacemos clic en OK. 6
Se abrirá una nueva ventana en la que se nos pedirá el rango de las frecuencias observadas en la primera línea (actual range) y de las frecuencias esperadas, en la segunda línea (expected range). Seleccionamos cada uno de los rangos con ayuda del Mouse y luego hacemos clic en OK. Obtendremos un valor de probabilidad. Arrastramos el Mouse para repetir el cálculo y obtener los valores de probabilidad en las progenies de los genotipos restantes. 7
Repetimos el procedimiento ya descrito, para llevar a cabo la prueba de Chi-Cuadrado para identificar genotipos símplices bajo segregación por cromátidas al azar, en la que se espera un 54% (p=0.54) de individuos resistentes y un 46% (p=0.46) de individuos susceptibles; (continuar con la hoja de Chi-Cuadrado Símplice del archivo EXCEL para hacer este cálculo con datos propios). Se calculan las frecuencias esperadas: 8
Llevamos a cabo la prueba de Chi-Cuadrado en la celda correspondiente utilizando de la categoría Statistical del EXCEL, la función CHITEST, y luego hacemos clic en OK. Seleccionamos los rangos de frecuencias observadas (actual range) y esperadas (expected range) con ayuda del Mouse y luego hacemos clic en OK. 9
Arrastramos el Mouse para repetir el cálculo y obtener los valores de probabilidad en las progenies de los genotipos restantes 10
Eligiendo como umbral, un valor de significación de 0.05, buscamos aquellos valores de probabilidad mayores o igual a dicho valor (valores resaltados en amarillo en la figura de abajo). Tales valores corresponderán a progenies segregantes de genotipos símplices, en las que sus frecuencias observadas no fueron estadísticamente diferentes a las esperadas, bajo segregación por cromosomas o por cromátidas al azar. Análisis de chi-cuadrado para la identificación de progenitores dúplices (Para realizar el análisis con datos propios, utilizar la hoja denominada Chi-Cuadrado Dúplice del archivo en EXCEL). Se procede de la misma forma como se realizó la identificación de clones símplices. Se calcula en primer lugar las frecuencias esperadas utilizando las probabilidades de resistentes y susceptibles para un genotipo dúplice. Estas son 83% de resistentes (p=0.83) y 17% de susceptibles (p-0.17) bajo segregación de cromosomas al azar, y 79% de resistentes (p=0.79) y 21% de susceptibles (p=0.21) bajo segregación de cromatides al azar. 11
Luego procedemos a realizar la prueba de chi-cuadrado, utilizando la función CHITEST de la categoría STATISTICAL del EXCEL. En la ventana correspondiente a los rangos de frecuencias, seleccionamos las frecuencias observadas, las esperadas, y obtenemos el valor de probabilidad al hacer clic en OK. 12
Se selecciona la fila donde se han hecho los cálculos y se arrastra el Mouse para obtener los valores de probabilidad para las progenies de los genotipos restantes. Ubicamos aquellos valores de probabilidad mayores o igual a 0.05, para identificar los genotipos dúplices, sean éstos bajo segregación por cromosomas o por cromatides (valores resaltados en amarillo en la figura de abajo). 13
Análisis de chi-cuadrado para la identificación de progenitores tríplices (Para realizar el análisis con datos propios, utilizar la hoja denominada Chi-Cuadrado Tríplice del archivo en EXCEL). Los genotipos tríplices y cuadrúplices no deben segregar individuos susceptibles bajo segregación de cromosomas al azar, y por ello se espera que toda la progenie de la cruza de prueba sea resistente (todas las plántulas sanas). Esto significa que no procede una prueba de Chi-Cuadrado. Sin embargo, bajo segregación por cromátidas al azar, es posible en el caso de genotipos tríplices los cuales llevan el alelo Ry de resistencia extrema en triple dosis, i.e., RyRyRyry- que cromátidas hermanas del cromosoma que carga el alelo recesivo terminen en el mismo gameto, dando lugar a la presencia de individuos susceptibles con una frecuencia esperada de 4% (p=0.04) cuando la probabilidad de doble reducción o que dos cromátidas termine en el mismo gameto es igual a 1/7 (Bradshaw. 1994). La prueba de Chi-Cuadrado tiene lugar solamente para la identificación de genotipos tríplices bajo segregación por cromátidas al azar. Se procederá de la misma manera que se ha venido haciendo para la identificación de símplices y dúplices, para finalmente ubicar aquellos genotipos cuyas progenies segregaron de acuerdo a las proporciones esperadas para un tríplice bajo segregación por cromátidas al azar, es decir aquellas cuyo valor de probabilidad en la prueba de Chi-Cuadrado no fue menor a 0.05, nivel de significación escogido para esta prueba. A continuación se muestra el resultado de la prueba para los genotipos escogidos en este manual (el genotipo tríplice encontrado está resaltado en amarillo) 14
Referencia Bradshaw, J. E. 1994. Quantitative genetics theory for tetrasomic inheritance. En Potato Genetics. Bradshaw, J. E.; Mackay, G. R. (eds). CAB International. Wallingford, Reino Unido. pp. 71 100. 15