Introducción n a la Espectrometría a de Masa Algunas aplicaciones de la Espectrometría de Masa en biología y biomedicina
Espectrometría de Masa La Espectrometría de Masa es una técnica que permite determinar la masa de moléculas por medio de la medida de la relación masa/carga (m/z). La medida de masas moleculares involucra la producción, separación y detección de iones moleculares en fase gaseosa. Cada molécula puede originar iones moleculares con distinto número de cargas ( y distintas m/z). La masa molecular es una propiedad física fundamental e inalterable de la materia
Bioespectrometría Aplicación de la Espectrometría de Masa al estudio de bio-moléculas: identificación, niveles, modificaciones. Incluye la combinación de herramientas de la Bioquímica (cromatografía, electroforesis, bioafinidad y digestiones enzimáticas, entre otras) con la Espectrometría de Masa.
Espectrometría a de masa y Biología Las medidas de masa de péptidos y proteínas (...y de otras macromoléculas) eran extremadamente difíciles de realizar hasta fines de los años 80, cuando aparecieron dos nuevos métodos para producir iones en fase gaseosa: Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI), para muestras sólidas Ionización por Electrospray (ESI) para muestras líquidas
Espectrometría de masa: equipos de tipo MALDI-TOF Espectrómetro de masa MALDI-TOF (Applied Biosystems Voyager DE-PRO) Espectrómetro de masa MALDI TOF/TOF (Applied Biosystems 4800 Analizer)
ESQUEMA: Instrumento de tecnología MALDI-TOF plate Extraction grids Laser Timed ion selector Reflector detector Reflector Linear detector Pumping Camera Beam guide Pumping
4000 Series MALDI TOF/TOF Analyzer Training Analizador de masa TOF Aceleración post-irradiación láser Región de deriva (Tubo de vuelo) Detector +20 kv 7 Iones de masas diferentes L os iones se separan de acuerdo a sus relaciones de m/z, de manera que los iones más livianos reciben una mayor aceleración. Los iones más livianos llegan al detector antes que los iones de masas mayores. La medida del tiempo de vuelo (TOF) de cada uno se puede usar para calcular su masa. 2007 Applera Corporation and MDS Inc.
Espectro de masa por MALDI-TOF de péptidos generados por digestión con tripsina in gel de una proteína de membrana de 91 kda. Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81
Elemento Masa % 1 H 1.0078 99.985 2 H 2.0141 0.015 12 C 12.0000 98.90 13 C 13.0034 1.10 14 N 14.0031 99.634 15 N 15.0001 0.366 16 O 15.9949 99.762 17 O 16.9991 0.038 18 O 17.9992 0.200 31 P 30.9738 100.00 32 S 31.9721 95.02 33 S 32.9715 0.75 34 S 33.9679 4.21 36 S 35.9671 0.02 79 Br 78.9183 50.69 81 Br 80.9163 49.31
Resolución en MALDI-TOF 100 90 80 70 Voyager Spec #1=>BC=>RSM10000=>MC=>MC=>MC[BP = 1672.8, 3222] 1672.917 1672.92 3222.3 % Intensity 60 50 40 30 20 10 Modo lineal Resolucion: 2467 (FWHM) 0 0 1655.0 1662.2 1669.4 1676.6 1683.8 1691.0 Mass (m/z) 100 90 80 70 Voyager Spec #1=>BC=>NR(2.00)=>MC=>MC[BP = 1672.9, 16255] 1672.918 1.6E+4 % Intensity 60 50 40 30 20 10 Modo reflector Resolucion:8500 (FWHM) 0 0 1655.0 1662.2 1669.4 1676.6 1683.8 1691.0 Mass (m/z)
Voyager Spec #1=>MC[BP = 2469.5, 12005] 100 90 80 70 C 13 2xC 13 2093 % Intensity 60 50 40 30 20 C 12 10 0 5725 5729 5733 5737 5741 5745 Mass (m/z) 0 Espectro de masa con resolución isotópica de insulina bovina. (aprox. 0.15 pmoles, 0.8 ng, en 1 µl de muestra; matriz: CHCA; R= 13800 FWHM)
Algunas aplicaciones...
CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS POR ESPECTROMETRÍA DE MASA Identificación de proteínas comparación correlativa en una base de datos de secuencias Control de calidad proteínas recombinantes, reacciones de modificación Modificaciones postraduccionales fosforilación, glicosilación, metilación, etc. Identificación de dominios dominios estructurales funcionales, pro-enzima vs. enzima Niveles de expresión métodos cuantitativos
Espectro de masa del citocromo c de caballo A. Molécula entera. Matriz: ácido sinapínico Voyager Spec #1=>BC=>NF0.9[BP = 12364.9, 60367] 100 12366.46 6.0E+4 90 80 6187.17 70 12583.58 % Intensity 60 50 40 12326.17 30 20 6292.68 10 12784.48 0 0 5000 7000 9000 11000 13000 15000 Mass (m/z)
Mapeo peptídico por EM (Peptide Mass Fingerprinting/MS) proteína intacta enzima proteolítica péptidos MEMEKEFEQIDKSGSWAAIYQDIRHEASDFPCRVAKLPKNKNRNRYRDVS PFDHSRIKLHQEDNDYINASLIKMEEAQRSYILTQGPLPNTCGHFWEMVW EQKSRGVVMLNRVMEKGSLKCAQYWPQKEEKEMIFEDTNLKLTLISEDIK SYYTVRQLELENLTTQETREILHFHYTTWPDFGVPESPASFLNFLFKVRE SGSLSPEHGPVVVHCSAGIGRSGTFCLADTCLLLMDKRKDPSSVDIKKVL LEMRKFRMGLIQTADQLRFSYLAVIEGAKFIMGDSSVQDQWKELSHEDLE PPPEHIPPPPRPPKRILEPHNGKCREFFPNHQWVKEETQEDKDCPIKEEK GSPLNAAPYGIESMSQDTEVRSRVVGGSLRGAQAASPAKGEPSLPEKDED HALSYWKPFLVNMCVATVLTAGAYLCYRFLFNSNT
B. Molécula digerida con tripsina. Matriz: ácido α-ciano hidroxicinámico Voyager Spec #1=>MC=>BC[BP = 1633.6, 19883] 100 1168.61 1633.82 2.0E+4 90 80 70 % Intensity 60 50 40 1190.54 30 1212.53 1433.76 20 10 1046.18 1170.181213.53 1152.36 1124.52 1230.50 1296.68 1350.70 1478.82 1631.62 1655.59 0 0 1000 1160 1320 1480 1640 1800 Mass (m/z) Masa Teorica Masa Medida Error (Da) Residuos Secuencia (Da) (Da) 1168.61 1168.61 0.00 28-38 TGPNLHGLFGR 1296.71 1296.68 0.03 28-39 TGPNLHGLFGRK 1350.72 1350.69 0.03 89-99 TEREDLIAYLK 1433.77 1433.76 0.01 26-38 HKTGPMLHGGLFGR 1470.68 1470.67 0.01 40-53 TGQAPGFTYTDANK 1478.82 1478.82 0.00 89-100 TEREDLIAYLKK 1478.82 1478.82 0.00 88-99 KTEREDLIAYLK 1633.81 1633.82 0.01 9-22 IFVQKCAQCHTVEK
RESUMEN: Niveles de información en la caracterización de proteínas por MS. medida de masa de una molécula entera 1 valor experimental medidas de masas en mapeo peptídico 5-20 valores experimentales secuenciado de péptidos por MS/MS más de 100 valores experimentales mejora en cantidad y calidad de la información
El Proteoma es dinámico Estado metabólico Drogas Condiciones ambientales Estadío de Desarrollo Proteoma Interacciones Proteína-Proteína Estrés Control traduccional y post-traduccional ADN Genoma marn Control transcripcional
Análisis por electroforesis 2D
Identificación de proteínas Separación en gel 2D m/z 1000 1500 2000 Mass (m/z) Extracción de péptidos y análisis de masas Selección de la muestra Tratamiento con una enzima proteolítica Búsqueda en banco de datos
Protein Prospector Homepage MS-Fit Search
ProFound Search for Protein Identification Set Kingdom Enzyme used for digestion Cys Modificatition (reduced, alkylated) Set Charge state
Search Result after Peptide Mass Fingerprinting The result showed that in fact the spot contained 2 proteins. Both were identified, Vimentin and Tubulin. Up to 5 proteins in the same spot could potentially be identified. Note that the genome of CHO-cells (hamster) is not sequenced. Therefore the most homologues proteins of related species are scored.
Detailed Search Results View
Identificación n de una proteína regulada por hierro en membrana externa de Sinorhizobium meliloti Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81
FIG. 1. SDS-PAGE analysis of S. meliloti 242 outer membrane proteins. S. meliloti 242 was grown in M3 medium containing 37 µm FeCl 3 (lanes 1 and 2), 500 µm EDDHA (lanes 3 and 4), 500 µm EDDHA and 4 µm hemoglobin (lanes 5 and 6), or 500 µm EDDHA and 16 µm hemin (lanes 7 and 8). Outer membrane proteins were extracted as described in the text, electrophoresed in a 10% acrylamide gel, and stained with 0.1% Coomassie brilliant blue. The bracket indicates the position of IROMPs. The positions of molecular mass standards (in kilodaltons) (lane 0) are indicated on the left. St, standards; Hb, hemoglobin; Hm, hemin. Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81
FIG. 3. Mass spectrum of the 91-kDa outer membrane protein digested in-gel with trypsin obtained by MALDI-TOF mass spectrometry. Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81
Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81
Identificación de proteínas por MALDI-TOF Proteína aislada Proteína identificada por la masa de los péptidos (PMF), generados por un método específico: Enzimático o químico Para su identificación, la secuencia de la proteína debe estar en una base de datos La identificación es probabilística: según criterios estadísticos
Caracterización de proteínas por espectrometría de masa Identificación de proteínas comparación correlativa en una base de datos de secuencias Control de calidad proteínas recombinantes, reacciones de modificación Modificaciones postraduccionales fosforilación, glicosilación, metilación, etc. Identificación de dominios dominios estructurales funcionales, pro-enzima vs. enzima Niveles de expresión métodos cuantitativos
Identificación de Proteínas de Células Huésped en materia prima del Factor G-CSF Pureza/SDS-PAGE/ GCSF Pureza/HPLC/GCSF 36 29 24 A 20 B 14 B A
Identificación de Proteínas de Células Huésped en materia prima del Factor G-CSF 28.952 Da muestra A A B Espectro de masa por MALDI-TOF, del contaminante proteico (spot A en gel 2D). Electroforesis 2D de la materia prima
Identificación de Proteínas de Células Huésped en materia prima del Factor G-CSF Digestión tríptica: muestra A Voyager Spec #1=>BC[BP = 1286.8, 20135] % Intensity 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 988.45 1029.53 1086.56 1242.66 1297.67 1286.77 1351.78 1414.87 1740.84 1783.87 2021.94 2083.09 2178.06 0 0 867.0 1191.6 1516.2 1840.8 2165.4 2490.0 Mass (m/z) 2.0E+4 MOW SE Score 1 4.709e +06 2 4.709e +06 3 3.603e +06 #/13( %) Mass es Matc hed 13 (100) 13 (100) 13 (100) % Co v 60. 0 60. 0 55. 0 % TIC 100. 0 100. 0 100. 0 Mea n Err Da - 0.011 2-0.011 2-0.011 2 Data Tol Da 0.03 58 0.03 58 0.03 58 MS- Digest Index # Protein MW (Da)/pI Accessi on # Species Protein Name 93727 28949/5.5 999812 UNREADABL gi 999812 pdb 1BTL Beta-Lactamase Tem1 M E (E.C.3.5.2.6) 377118 28950/5.3 925716 gi 9257166 pdb 1CK3 A Chain A, N276d UNREADABL Mutant Of Escherichia Coli Tem-1 Beta- 6 E Lactamase 590830 31530/5.7 299595 EXPRESSION VECTOR beta-lactamase 9 M PPK113 Realizado por la Unidad de Bioquímica Analítica del IIBCE/ Laboratorios CLAUSEN
Caracterización de proteínas por espectrometría de masa Identificación de proteínas comparación correlativa en una base de datos de secuencias Control de calidad proteínas recombinantes, reacciones de modificación Modificaciones postraduccionales fosforilación, glicosilación, metilación, etc. Identificación de dominios dominios estructurales funcionales, pro-enzima vs. enzima Niveles de expresión métodos cuantitativos
Identificación de Modificaciones Postraduccionales Fosforilación? NO 2?
Common Protein Post-Translational Modifications (monoisotopic) modification -17 pyrrolidone carboxylic acid -2 disulfide formation (thiol oxidation) -0.98 amidation 0.98 deamidation 2 disulfide reduction (thiol formation) 14 methylation 16 oxidation (e.g. sulfoxide formation) 28 formylation 42 acetylation 43 carbamylation 44 γ-carboxyglutamic acid 71 Cys-propionamide 79.9568 sulfation 79.9663 phosphorylation Some modifications are natural. Many are the result of handling. disulfide vs. two thiols phosphate group vs. sulfate group good mass spectrometer needed especially with large molecules M. R. Wilkins et al., J. Mol. Biol. 289: 645-657 (1999). Delta Mass at http://www.abrf.org
Identificación n de sitios de fosforilación PknB de Mycobaterium tuberculosis 1 GSSHHHHHHSSGLVPRGSHMTTPSHLSDRYELGEILGFGGMSEVHLARDLRLH 51 RDVAVKVLRADLARDPSFYLRFRREAQNAAALNHPAIVAVYDTGEAE 101 TPAGPLPYIVMEYVDGVTLRDIVHTEGPMTPKRAIEVIADACQALNFSHQ 151 NGIIHRDVKPANIMISATNAVKVMDFGIARAIADSGNSVTQTAAVIGTAQ 201 YLSPEQARGDSVDARSDVYSLGCVLYEVLTGEPPFTGDSPVSVAYQHVR 251 EDPIPPSARHEGLSADLDAVVLKALAKNPENRYQTAAEMRADLVRVHNGEP 301 PEAPKVLTDAERTSLLSSAAGNLSGPRTDPLPRQDLDDTDRDRSIGSVGR
1 GSSHHHHHHSSGLVPRGSHMTTPSHLSDRYELGEILGFGGMSEVHLARDLRLH 51 RDVAVKVLRADLARDPSFYLRFRREAQNAAALNHPAIVAVYDTGEAE 101 TPAGPLPYIVMEYVDGVTLRDIVHTEGPMTPKRAIEVIADACQALNFSHQ 151 NGIIHRDVKPANIMISATNAVKVMDFGIARAIADSGNSVpTQpTAAVIGTAQ 201 YLSPEQARGDSVDARSDVYSLGCVLYEVLTGEPPFTGDSPVSVAYQHVR 251 EDPIPPSARHEGLSADLDAVVLKALAKNPENRYQTAAEMRADLVRVHNGEP 301 PEAPKVLTDAERTSLLSSAAGNLSGPRTDPLPRQDLDDTDRDRSIGSVGR
Caracterización de proteínas por espectrometría de masa Identificación de proteínas comparación correlativa en una base de datos de secuencias Control de calidad proteínas recombinantes, reacciones de modificación Modificaciones postraduccionales fosforilación, glicosilación, metilación, etc. Identificación de dominios dominios estructurales funcionales, pro-enzima vs. enzima Niveles de expresión métodos cuantitativos
2-D DE T. cruzi- RESULTADOS PRELIMINARES A) ph 3 10 B) ph 3 10 Epimastigotes CL-Brener (vista parcial) A) y B) tratados y no tratados con H2O2 respectivamente
ESTRATEGIA GENERAL PARA EL ANÁLISIS DE PROTEÍNAS POR ESPECTROMETRÍA DE MASA Proteína Enzima Mezcla de péptidos Espectrómetro de masa Masa de los péptidos Alternativamente, secuenciación de cada péptido Búsqueda en bancos de datos; Identificación de la proteína Verificación de secuencia y detección de modificaciones postraduccionales. MS/MS
MS/MS Mezcla de péptidos 1 péptido seleccionado para MS/MS MS/MS + + + + + + Espectro MS Espectro MS/MS: masa de los fragmentos
b ions y ions
Del Genoma al Proteoma Secuencia ADN marn Proteínas Proteínas Funcionales Control Transcripcional Control Traduccional Control post-traduccional Algunas propiedades VITALES de las proteínas no pueden ser predecidas de su secuencia de ADN
Proyectos de Proteoma Humano ~40,000 Proteinas ~>1,000,000 Proteinas Variantes ~>5,000,000 Complejos?
APLICACIONES DE LA PROTEOMICA Estudios de la funcion y organización Molecular de la celula Investigaciones en Fisiopatologia Descubrimiento de nuevas actividades Biologicas y drogas Predecir respuestas individuales a drogas Marcadores para diagnostico de enfermedades Estudio de modo de accion de drogas y toxicidad Descubrimiento de nuevas moleculas blanco de drogas
4800 MALDI TOF/TOF Analyzer Schematic Mirror Deflectors Collision Cell CID Lens (Lens 2) Lens 3 Linear Detector 2-Stage Mirror Metastable Suppressor Source 2 Decel Stack TIS Decel Deflectors Lens 1 Laser Lamp Camera X 2,Y 2 Deflectors Reflector Detector X 1,Y 1 Deflectors Sample Loading Chamber Source 1 Lens Attenuator Mirrors Source 1 Sample Plate and Stage
4-25 kv Tubo de vuelo Detector Los iones se separan de acuerdo a sus relaciones de m/z, de manera que los iones más livianos reciben una mayor aceleración. Los iones más livianos llegan al detector antes que los iones de masas mayores. La medida del tiempo de vuelo (TOF) de cada uno se puede usar para calcular su masa.
Espectrómetro de masa MALDI TOF/TOF (Applied Biosystems 4800 Analizer)
Time-of-Flight Mass Analyzer Source Acceleration Drift Region (Flight Tube) Detector +20 kv Ions will separate according to their mass-to-charge ratios: light ions accelerated to a higher velocity that heavy ions. The lighter ions strike the detector before the heavier ions. The time of flight (TOF) can be used to calculate the mass-to-charge ratio.
Modelo: Voyager DE-PRO (Applied Biosystems, USA). Datos técnicos: - Laser de nitrógeno (λ 337 nm) - Voltaje de aceleración: hasta ± 25 kv - Tubo de vuelo: 1.3 m (modo lineal); 2.0 m (modo reflector) - Sistema alto vacío: 2 bombas turbo-moleculares (10-8 Torr) - Rango de masa: 500 Da hasta > 400 kda - Exactitud de masa : hasta 0.002% (20 ppm) - Sensibilidad (péptidos): subpicomolar Posibilidades de operación: - Modo lineal - Modo reflector - "Delay extraction" (DE) - "Post Source Decay (PSD) - "Collision-Induced Dissociation (CID)