RECUENTO BACTERIANO Lic. Leticia Diana Área de Bacteriología. Departamento de Ciencias Microbiológicas Facultad de Veterinaria UdelaR 2015
Generalidades Replicación bacteriana: fisión binaria (bipartición).
Aumento exponencial en el número de células de la población
Tipos de crecimiento CRECEIMIENTO INDIVIDUAL: La bacteria alcanza un tamaño y peso fijo. Constituye el paso previo a la división celular. CRECEIMIENTO POBLACIONAL: Es el incremento en el numero de células como consecuencia del crecimiento y división celular
Métodos de evaluación del crecimiento 1. Determinación del nº de microorganismos (m.o): A. Recuento microscópico directo (Cámara de Neubauer) B. Conteo electrónico (Citometría de flujo) C. Recuento en placa D. Recuento por filtración en membrana E. Número más probable (NMP), en medio líquido
Métodos de evaluación del crecimiento 2. Determinación de la masa celular: A. Medida de la masa B. Medida del volumen C. Determinación del contenido de C, N, P, etc. D. Turbidimetría
Métodos de evaluación del crecimiento 2. Determinación de la actividad celular: A. Actividad enzimática B. Concentración de determinado metabolito C. Medida de respiración.
Determinación del nº de m.o: Recuento microscópico directo (Cámara de Neubauer) Determinar el número total de organismos de una muestra: Se utilizan cámaras de recuento (cámara de Petroff-Hauser o Neubauer) y se visualiza al microscopio. Es un método rápido, pero no distingue entre viables o no viables Células muy pequeñas no se ven bien No es útil para muestras con baja carga celular Pueden contarse materiales del cultivo de manera errónea
Determinación del nº de m.o: Recuento microscópico directo (Cámara de Neubauer) BROCK. BIOLOGIA DE LOS MICROORGANISMOS (12ª EDICION) JOHN MARTINKO, ADDISON-WESLEY, 2009
Determinación del nº de m.o: Conteo electrónico (Citometría de flujo) La citometría de flujo es una tecnología biofísica basada en la utilización de luz láser, empleada en el recuento y clasificación de células según sus características morfológicas, presencia de biomarcadores. Las células suspendidas en un fluido atraviesan un finísimo tubo transparente sobre el que incide un delgado rayo de luz láser, la luz transmitida y dispersada por el pasaje de las células a través del tubo se recoge por medio de unos dispositivos de detección, permitiendo hacer inferencias en cuanto a tamaño y complejidad de las células.
Determinación del nº de m.o: Recuento en placa Es un método muy utilizado cuando se necesita determinar el tamaño de la población bacteriana de una muestra (alimento, productos farmacéuticos, aguas, producción de vacunas). Se basa en que cada uno de los microorganismos presentes en la muestra desarrollará una colonia visible Cada colonia observada se formó a partir de por lo menos un microorganismo. Entonces la colonia es considera una unidad formadora de colonia (ufc) a los efectos de los cálculos.
Determinación del nº de m.o: Recuento en placa Determinación de las ufc Método de recuento incorporado Método de recuento en superficie
Determinación del nº de m.o: Recuento en placa Método de recuento en superficie (recuento por extensión en placa): Preparar diluciones seriadas de 1/10, 1/ 100, 1/ 1.000, 1/ 10.000 y 1/ 100.000 de la muestra anterior respetando un volumen final de 5 a 9 ml. Se rotulan 5 placas (una para cada dilución) sembrar 0.1 ml (con pipeta limpia en cada una) de cada dilución en una placa de Petri con Agar Nutritivo o TSA y con ayuda de un rastrillo extenderlo por toda la placa. Incubar a 37 C durante 24 a 48 hs.
Determinación del nº de m.o: Recuento en placa Una vez pasado el tiempo de incubación se cuentan las colonias crecidas en la superficie. Solo se cuentan las placas que tienen entre 30 a 300 colonias y luego se realiza un promedio. Como calcular las ufc/ml: Ufc/ ml de muestra = Nº de colonias contadas x Factor de dilución ml de la muestra sembrada Factor de dilución: Inversa de la dilución
Veamos un ejemplo con números. Ufc/mL= 159(colonias contadas) x 1000 (inverso del factor de dilución que es 10-3 ) 1mL (volumen que sembré en la placa) Ufc/mL = 159000 = 1,59 x 10 5 ufc/ml BROCK. BIOLOGIA DE LOS MICROORGANISMOS (12ª EDICION) JOHN MARTINKO, ADDISON-WESLEY, 2009
Para pensar: Problema 1: Nº de colonias contadas: 280 Dilución: 10-3 Volumen sembrado: 1 ml Ufc/mL:???????? Problema 2: Nº de colonias: 56 Dilución: 10-4 Volumen sembrado: 0,2 ml Ufc/mL:????????? 280 x 1000 / 1mL = 280.000 =2,8 x 10 5 ufc/ml 56 x 10000 / 0,2 ml =2.800.000 =2,8 x 10 6 ufc/ml
Determinación del nº de m.o: Recuento en placa Método de recuento incorporado (recuento por inclusión o recuento por vertido en placa): Preparar diluciones seriadas de 1/10, 1/ 100, 1/ 1.000, 1/ 10.000 y 1/ 100.000 de la muestra anterior respetando un volumen final de 5 a 9 ml. Se rotulan 5 placas (una para cada dilución) sin medio de cultivo. Fundir el medio a utilizar y termostatizarlo a 45ºC no más. Sembrar en cada placa cada una de las diluciones (1mL) y luego colocar el medio de cultivo termostatizado. Agitar suavemente (homogenizar), esperar que solidifique el medio e incubar a 37ºC durante 24 a 48 hs.
1/10000 (10-4 ) 1 ml 1/100000 (10-5 ) 1 ml 1/1000000 (10-6 ) 1mL 142 colonias 30 colonias 17 colonias Ufc/mL= 142(colonias contadas) x 10000(inverso del factor de dilución que es 10-4 ) 1mL (volumen que sembré en la placa) Ufc/mL = 1420000 = 1,42 x 10 6 ufc/ml
Determinación del nº de m.o: Recuento por filtración en membrana Se realiza por filtración de un volumen de la muestra a través de un filtro de membrana de tamaño adecuado para retener a las bacterias (0.22-0.45 µm) El filtro se coloca sobre un medio de cultivo sólido y se incuba. Luego se cuentan las colonias que crecieron en el filtro. Se utiliza con frecuencia para determinar el número de bacterias en agua.
Determinación del nº de m.o: Numero mas probable (NMP) Nos proporciona un recuento de viables Se basa en el principio de que una única célula viva puede desarrollarse y producir un cultivo turbio Requiere la realización una serie de diluciones seriadas al décimo de la muestra de cultivo, en un medio líquido adecuado para el crecimiento de dicho organismo Puede emplearse para determinar la contaminación del agua potable o de alimentos
5 3 1 Ir a la tabla de NMP y buscar la cifra 531
CÁLCULO: factor de dilución (primero usado) x NMP (tabla) = N de células /ml 1000 x 11,0 = 11.000 células /ml=11 x 10 3 celulas/ml
Para pensar: Se siembra un NMP con las siguientes diluciones : 1/ 10.000, 1/100.000 y 1/1.000.000 y el resultado al saca los tubos de la estufa es el siguiente: 4 2 1 Indique cual es el resultado / ml de muestra
MUCHAS GRACIAS!!