MÉTODOS DE ESTUDIO DE LAS ENTEROPARASITOSIS

MÉTODOS DE ESTUDIO DE LAS ENTEROPARASITOSIS

IMPORTANCIA Diagnóstico de enteroparasitosis sintomáticas, asintomáticas. Diagnóstico diferencial de infecciones entéricas. Diagnóstico diferencial con otras patologías del aparato digestivo. Tratamiento específico. Valoración de respuesta al tratamiento. Prevención.

DIAGNÓSTICO DE ENTEROPARASITOSIS ETAPAS DEL DIAGNÓSTICO Pre-analítica Analítica Post-analítica

DIAGNÓSTICO DE ENTEROPARASITOSIS MÉTODOS DIRECTOS: Coproparasitario Coloraciones Método de Graham - Espátula adhesiva Sondeo Duodenal Biopsia duodenal Coproantígenos MÉTODOS INDIRECTOS: En suero: anticuerpos séricos Amibiasis invasiva, estrongiloidiasis,fasciolosis,esquistosomiasis, etc

ETAPA PRE-ANALÍTICA

ETAPA PRE-ANALÍTICA Indicaciones del examen parasitario Pacientes con sintomatología sugestiva; pacientes asintomáticos con antecedentes epidemiológicos relevantes; control o control posttratamiento Solicitud del examen parasitario Datos filiatorios del paciente Datos clínicos (síntomas y signos, diagnóstico clínico presuntivo) Antecedentes personales: inmunosupresión, viajes al exterior Antecedentes familiares Antecedentes ambientales (agua potable, saneamiento) Tratamientos previos anti diarreicos, antiparasitarios, antibióticos etc.

ETAPA PRE-ANALÍTICA Indicación de Régimen alimentario 48 a 72 hs antes de realizarse el estudio (libre de frutas, verduras y grasas dado que estas preparaciones obstaculizan la visualización microscópica lo que puede conducir a resultados Falsos Negativos o Falsos Positivos). Necesario? Emisión Espontanea. No en periodo menstrual, ni posterior a realización de estudio radiológico con bario.

ETAPA PRE-ANALÍTICA Muestra de materia fecal Aproximadamente 50 grs (tamaño de una nuez) si heces formadas o 10 a 15 ml si heces líquidas. Rotular adecuadamente. En recipiente de boca ancha, transparente y con tapa de rosca. Emitidas recientemente o conservadas en heladera hasta 24 horas. Evitar contaminación con orina para evitar deterioro de los parásitos.

ETAPA ANALÍTICA

COPROPARASITARIO DEFINICIÓN Conjunto de técnicas diagnósticas complementarias que permiten la identificación de la mayoría de las enteroparasitosis causadas por protozoarios y helmintos intestinales o de aquellos que si bien tienen una localización tesidual sus huevos se eliminan en las materias fecales. Se debe tener en cuenta a la hora de su indicación que esta metodología es útil para protozoarios y helmintos cuyas formas evolutivas se eliminan con las materias fecales: Trofozoítos Quistes Ooquistes Huevos Larvas Adultos

EXAMEN COPROPARASITARIO SERIADO Se considera que muestras únicas solo permiten un diagnóstico positivo en un 40%-60% aprox. de las materias fecales con parásitos (ciclos de los parásitos alternan períodos negativos de eliminación de quistes) * Existen diferentes esquemas sobre la secuencia de recolección de materia fecal para realizar el examen coproparasitario. Los más usados son: 3 muestras seriadas en días alternos 3 muestras separadas por intervalos de una semana entre si * Manual de Toma de muestras para estudio Bacteriológico y Micológico. Departamento de Laboratorio Clínico. Hospital de Clínicas. 2004

EXAMEN MACROSCÓPICO Consistencia: moldeada, pastosa, semilíquida, inhomogénea Color: marrón, amarillo, macilla, negruzco, verdoso Olor: sui generis, fétido, butírico Presencia de elementos anormales: sangre, mucus, pus Presencia de seudoparásitos Búsqueda de parásitos macroscópicos

EXAMEN MACROSCÓPICO

EXAMEN MACROSCÓPICO En el caso de hallar proglótides de Taenia: Dejar en agua destilada durante 24hs Colocar el segmento sobre un recuadro de papel Comprimir entre dos láminas Observar las ramificaciones del útero También se pueden teñir con Carmín Clorhídrico

EXAMEN MICROSCÓPICO Examen directo de una pequeña porción de heces frescas Examen después de aplicar un método de concentración Examen de frotis o preparaciones permanentes EXAMEN DIRECTO Suero Fisiológico Lugol Objetivo 10 x Objetivo 25-40 x Habitualmente no se emplea objetivo de inmersión Importante: No diluir demasiado las muestras

EXAMEN MICROSCÓPICO DIRECTO EN FRESCO CON SUERO FISIOLÓGICO Y LUGOL Inconvenientes: Escaso material, por lo que es necesario la realización de técnicas de Enriquecimiento o Concentración (Ritchie, Faust, Sheater) Ventajas: Movilidad de trofozoítos, células intestinales, células inflamatorias, mala absorción.

MÉTODOS DE ENRIQUECIMIENTO O CONCENTRACIÓN Aumentan el número de parásitos a partir de un volumen conocido. Procedimientos por Sedimentación Procedimientos por Flotación Procedimientos Biológicos

TÉCNICAS DE ENRIQUECIMIENTO O CONCENTRACIÓN MÉTODOS FÍSICOS o Dilución minuciosa de heces en líquido o solución de densidad: o o Inferior a la de los parásitos (Técnicas de sedimentación) Superior a la de los parásitos (Técnicas de flotación) o Ventajas: o o Realización muy simple Precisan poco material o Inconvenientes: o Procesos largos o o Exigen mucha manipulación No aplicables a series grandes de muestras

MÉTODOS FÍSICOS SEDIMENTACIÓN SIMPLE Espontanea SEDIMENTACIÓN - CENTRIFUGACIÓN Ritchie (formol-éter) Telemann (éterácido clorhídrico) Carles y Barthélémy (éter-ácido cítrico)

TÉCNICAS DE ENRIQUECIMIENTO POR SEDIMENTACIÓN Basados en la utilización de suero fisiológico (SF) y otras soluciones de baja densidad. Se recuperan huevos, larvas, ooquistes y quistes del fondo de un tubo en el que se depositan por ser más densos. SEDIMENTACIÓN SIMPLE Lentos y poco prácticos Mayor utilidad para huevos de trematodos SEDIMENTACIÓN /CENTRIFUGACIÓN Se destaca el método de Ritchie (con formol y éter o acetato de etilo), que es el más usado en los laboratorios de nuestro medio

SEDIMENTACIÓN SIMPLE o Homogeneizar 2 a 5 gr de heces (10-20 gr) en 10 ml de SF o agua. o Colocar la dilución en tubo cónico de 50 ml, filtrando a través de gasa. o Completar el volumen con SF o agua de la canilla. o Agitar y dejar reposar por 45 minutos. o Desechar sobrenadante. o Resuspender con SF o agua de la canilla. o Dejar sedimentar 45 minutos. o Desechar sobrenadante. o Repetir esta operación varias veces, hasta que el sobrenadante quede transparente. o Tomar con pipeta el material sedimentado. o Hacer tres tomas: o Superficie o Media altura o Fondo Sensibilidad 55%

MÉTODO DE RITCHIE SEDIMENTACIÓN-CENTRIFUGACIÓN o Homogeneizar materia fecal con SF (aprox. 25 ml). o Filtrar suspensión por embudo con triple gasa a tubo de centrífuga de fondo cónico. o Centrifugar a 2300 rpm por 1 min, descartar sobrenadante, resuspender con SF y agitar con varilla de vidrio. o Centrifugar nuevamente a 2300 rpm por 1 min, repitiendo hasta 3 veces o hasta obtener un sobrenadante límpido. o Agregar al sedimento obtenido 3 a 5 ml de formol al 10%, homogeneizando con varilla o pipeta Pasteur. o Dejar reposar por 5 min con fines de fijación. o Agregar 1 ml de éter o acetato de etilo, agitar vigorosamente el tubo tapado para extraer las grasas. o Centrifugar tubo a 1500 rpm durante 2 min. o Descartar sobrenadante y limpiar la boca del tubo con hisopo de algodón. o Tomar con pipeta el sedimento obtenido. o Depositar sobre lamina y laminilla con SF y lugol parasitológico.

MÉTODO DE RITCHIE Éter Restos vegetales y grasa Formol 10% Sedimento (Parásitos)

KITS COMERCIALES DE SEDIMENTACIÓN - CENTRIFUGACIÓN Aspectos comunes Unidades de filtración Limpios Bioseguridad Diferencias Tubos Con o sin conservantes Con o sin surfactante Cucharitas Hisopos Bolsas

FECAL PARASITE CONCENTRATOR JUMBO EVERGREEN Remplaza embudo y gasa. Los orificios del filtro permiten pasar larvas, huevos, quistes y retienen la mayor parte de los desechos fecales. Surfactante Tritón x-100, disuelve y disgrega las heces y el mucus.

TÉCNICAS DE ENRIQUECIMIENTO POR FLOTACIÓN FLOTACIÓN SIMPLE Bass FLOTACIÓN - CENTRIFUGACIÓN Faust (Sulfato de Zinc) Sheater modificado (azúcar). Para coccidios Bailinger (Éter y Sulfato de Zinc) Quinn (Sulfato de Magnesio)

TÉCNICAS DE CONCENTRACIÓN FLOTACIÓN Los elementos parasitarios se recogen de la superficie de un líquido denso al cual ascienden por su menor peso específico. Características a considerar: Densidad solución empleada, densidad de parásitos, concentración en superficie. Importante: Manipular rápidamente Posible alteración en la morfología de los huevos Película superficial Sulfato Zinc Sedimento

MÉTODO DE BAERMANN TÉCNICAS BIOLÓGICAS DE CONCENTRACIÓN Basados en el conocimiento del ciclo vital del parásito MÉTODO DE BAERMANN Apropiado para el diagnóstico de Estrongiloidiasis (aprovechando la termofilia e hidrofilia de las larvas de Strongyloides stercoralis)

MÉTODO HARADA - MORI TÉCNICAS BIOLÓGICAS DE CONCENTRACIÓN Busca embrionar huevos de trematodes y cestodes. Larvas de nematodes. Strongyloides stercoralis

TÉCNICAS PARA RECUENTO DE HUEVOS Intensidad de infección de helmintos transmitidos por el suelo. Cuantifican el número de huevos por gramo de materia fecal. Recuento en placa microscópica. Técnica de Kato Katz.

COLORACIONES Coloraciones temporarias Lugol, Negro de Clorazol, Azul de Tionina Coloraciones permanentes (Frotis) Ziehl Neelsen modificado o Kinyoun para diagnóstico de coccidiosis intestinales (Criptosporidiosis, Isosporosis, Ciclosporosis) Hematoxilina Férrica para amibiasis Tricrómica y Gram Cromotrope para microsporidiosis

COLORACIÓN DE KINYOUN ZIEHL NEELSEN MODIFICADO EN FRÍO PARA COCCIDIOS INTESTINALES Fijación frotis: Metanol por 30 seg Tinción: 5 min (frío) con solución de Fucsina básica Fucsina básica 4 g Fenol 8 g Etanol (95%) 90 ml Agua destilada 100 ml Lavado Etanol 50%: 3-5 min Agua corriente Decoloración: Ácido sulfúrico 1% por 2 min Contracoloración: Verde de Malaquita o Azul de Metileno por 1-2 min

OTROS EXAMENES DIRECTOS PARA DIAGNÓSTICO DE ENTEROPARASITOSIS EXAMEN DIRECTO DE LÍQUIDO DUODENAL o Se obtiene por sondeo duodenal o con cápsula entérica o test del cordón o Enterotest o Observación o o Fresco (directo o tras centrifugación) Frotis coloreados o Utilidad / Rendimiento o Trofozoítos de Giardia lamblia o Ooquistes de Isospora y Cryptosporidium o Huevos de Fasciola hepatica o Larvas de Strongyloides stercoralis

ELEMENTOS NO PARASITARIOS EN LAS HECES o Restos alimenticios semi-digeridos o Células epiteliales (mucosa intestinal) o Células sanguíneas Leucocitos (úlceras intestinales) Macrófagos amebas patógenas Hematíes o Bacterias o Hongos

ELEMENTOS NO PARASITARIOS EN LAS HECES Restos alimenticios o Tejido conjuntivo o Fibras musculares estriadas (carne) o Grasas neutras Glóbulos refringentes tamaño variable o Ácidos grasos Agujas finas o Almidón o Crudo: Granos en capas concéntricas o Células reserva amilácea o Celulosa o Digerible: Masas celulósicas (células reserva) o No digerible: Traqueadas, pelos vegetales, polen etc.

ELEMENTOS NO PARASITARIOS EN LAS HECES Cristales o Origen alimentario (oxalato de calcio) o Endógeno: o Oxalato de calcio o Fosfato amónico-magnésico o de Charcot-Leyden o Medicamentos

MÉTODO DE ESPÁTULA ADHESIVA TÉCNICA DE GRAHAM o Oxiurosis o Enterobiosis (Enterobius vermicularis) o o o o Observación microscópica del material recogido de la zona perianal, por aplicación de una superficie adhesiva La cinta se dispone sobre un soporte rígido, con la superficie adhesiva hacia el exterior Se aplica varias veces sobre la piel de la región perianal sin introducir en el recto Se envía al laboratorio y se observa al microscopio (10X) IMPORTANTE o Realizar la toma de muestra a 1ª hora por la mañana, antes de levantarse de la cama, durante 3 mañanas consecutivas

MÉTODO DE GRAHAM DIAGNÓSTICO OXIUROSIS

ETAPA POST-ANALÍTICA

ETAPA POST-ANALÍTICA Validación Informe de resultados Importancia de relación con el médico clínico Observaciones, orientaciones y sugerencias

METODOLOGÍA COLORACIONES Ziehl Neelsen Tricrómica H. férrica MACROSCÓPICO Nematodes Platelmintos ENRIQUECIMIENTO Quistes de patógenos: Primarios Oportunistas Discutidos Huevos Larvas COPROPARASITARIO EXAMEN DIRECTO Trofozoítos B. hominis COPROANTÍGENOS G. lamblia Crypto. spp E. histolytica ESPÁTULA ADHESIVA

ORIENTACIÓN CLÍNICA EOSINOFILIAS: CPs+EA DOLOR ABDOMINAL: CPs+EA SÍNTOMAS INESPECÍFICOS: CP+EA DIARREA DEL ADULTO: CP CUADROS CLÍNICOS VINCULADOS A ENTEROPARASITOSIS DIARREA CRÓNICA CON MALABSORCIÓN: CPs+CAg DIARREA DEL VIAJERO: CP+ZN DIARREA AGUDA INFANTIL,DIARREA PROLONGADA: CP+ZN INMUNODEPRIMIDOS CON DIARREA: CPs+ZN+TRIC+CAg+CA cp