MetCombi Plasma ELISA

Instrucciones de Uso MetCombi Plasma ELISA Inmunoensayo enzimático para la determinación quantitativa de metanefrina y normetanefrina libre en plasma humano. RE59202 2 x 96 2-8 C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0)40-53 28 91-0 IBL@IBL-International.com D-22335 Hamburg, Germany Fax: +49 (0)40-53 28 91-11 www.ibl-international.com

1. USO PROPUESTO Inmunoensayo enzimático para la determinación quantitativa de metanefrina y normetanefrina libre en plasma humano. 2. IMPLICACIONES CLÍNICAS Las catecolaminas adrenalina, noradrenalina y dopamina se sintetizan en la médula adrenal, el sistema nervioso simpático y el cerebro. Ellas influyen prácticamente sobre todos los tejidos y están involucradas, junto con otros sistemas hormonales y neuronales, en la regulación de una amplia variedad de procesos fisiológicos. Las catecolaminas y sus metabolitos metanefrina y normetanefrina pueden ser empleadas con propósitos de diagnóstico ya que son secretadas en grandes cantidades en diversas patologías. En este contexto, el diagnóstico y seguimiento de las enfermedades tumorales del sistema nervioso es de importancia vital. Esto es aplicable fundamentalmente al feocromocitoma pero también al neuroblastoma y el ganglioneuroma. El crecimiento maligno se describe en el 10% de los feocromocitomas. Es más, la elevación de las catecolaminas y sus metabolitos metanefrina y normetanefrina puede observarse en los carcinoides. Datos de los últimos años han mostrado que las metanefrinas en el plasma son los mejores marcadores para el diagnostico y el seguimiento de la feocromocitoma. 3. PRINCIPIO DEL ENSAYO Después de la precipitación de proteínas y de la acilación, las metanefrinas son medidas por el ELISA. Las nor-/metanefrinas aciladas de la muestra compiten con las nor-/metanefrinas ligadas a la fase sólida por un número fijo de uniones en el antisuero. Si el sistema está en equilibrio, antígenos libres y complejos de antígeno-anti-suero libres son removidos por el lavado. El anticuerpo ligado a la nor-/metanefrina de fase sólida es detectada por una immunoglobulina conjugada anti-conejo-igg-peroxidasa. La concentración de los anticuerpos ligados a las catecolaminas de fase sólida es invertidamente proporcional a la concentración de las catecolaminas de la muestra. 4. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES 1. Sólo para uso en diagnóstico in-vitro. Sólo para uso profesional. 2. Antes de comenzar el ensayo lea las instrucciones completa y cuidadosamente. Use la versión válida del prospecto que se ofrece con el juego de reactivos. Asegúrese de entenderlo todo. 3. En caso de daño severo del estuche del juego de reactivos, contacte por favor a IBL o a su suministrador en forma escrita antes de transcurrida una semana de la recepción. No utilice los componentes dañados en los ensayos pero guárdelos en forma segura para la reclamación. 4. Tome en cuenta el número de lote y la fecha de caducidad. No mezcle reactivos de diferentes lotes. No use reactivos vencidos. 5. Cumpla con las buenas prácticas de laboratorio y las pautas de seguridad. Use bata de laboratorio, guantes de látex desechables y gafas de protección cuando sea necesario. 6. Los reactivos de este juego que contienen materiales peligrosos pueden causar irritación ocular y cutánea. Vea MATERIAL SUMINISTRADO y las etiquetas para los detalles. Las Hojas de Datos de Seguridad de los materiales para este producto están disponibles en la página de internet de IBL o mediante solicitud directa a IBL. 7. Los reactivos químicos y los reactivos preparados o usados deben ser tratados como desechos peligrosos de acuerdo con las regulaciones nacionales sobre bioseguridad y pautas de seguridad. 8. El personal de limpieza debe ser capacitado por profesionales para el manejo de residuos peligrosos. 9. Evite el contacto con la solución de Paro y Reactivo de Precipitación. Puede causar irritaciones y quemaduras en la piel. 10. Todos los reactivos de este juego que contienen suero o plasma humano han sido ensayados y encontrados negativos para anti-hiv I/II, HBsAg and anti-hcv. Sin embargo, la presencia de estos u otros agentes infecciosos no puede ser excluída en forma absoluta, por lo que estos reactivos deben ser tratados como potencialmente biopeligrosos a los efectos de su manipulación y eliminación. Version 2014-11 1 / 9

5. ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD El juego de reactivos es enviado a temperatura ambiente y debe ser almacenado a 2-8 C. Manteniéndose alejado del calor o de la luz solar directa. El almacenamiento y estabilidad de muestras y reactivos preparados se detalla en los capítulos correspondientes. La placa de microtitulación es estable hasta la fecha de caducidad del juego de reactivos aún cuando la bolsa haya sido abierta, siempre que se vuelva a cerrar herméticamente y se almacene a 2-8 C. 6. TOMA Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS La liberación in-vivo de catecolaminas y metanefrinas está influenciada por varios medicamentos y alimentos. La Vitamina B, el café y los plátanos, la alfa metildopa, los inhibidores de la MAO y la COMT así como los medicamentos relacionados con la hipertensión deben descontinuarse al menos 72 horas antes de la toma de muestra. Plasma (EDTA) La separación de plasma de la muestra de sangre mediante centrifugación debe llevarse a cabo antes de transcurridas las 2 horas desde la toma de la muestra. La muestra debe almacenarse a 2-8 C. Se deben observar las precauciones usuales para la venipuntura. Es importante preservar la integridad química de la muestra de sangre desde el momento de su toma hasta el ensayo. No emplee muestras fuertemente hemolizadas, lipémicas o ictéricas. Almacenamiento: 2-8 C -20 C (Alícuotas) -70 C (Alícuotas) Estabilidad: 24 h 3 meses 1 año 7. MATERIALES SUMINISTRADOS Manténgase alejado del calor o de la luz solar directa. Evite congelar y descongelar repetidamente. Para su embarque las muestras deben congelarse. Los reactivos provistos en este kit son suficientres para la precipitación de 96 muestras individuales: 88 muestras de pacientes, 6 estándares y 2 controles. Para la determinación doble en Metanefrina y Normetanefrina se recomienda de realizar una acilación doble. En este caso, los reactivos son suficientes para para 40 muestras de pacientes, 6 estándares y 2 controles. Reactivos adicionales están disponibles bajo pedido. Cantidad Símbolo Componente 1 x 12 x 8 MTP MN 1 x 12 x 8 MTP NMN 2 x 1.5 ml CAL A LYO 1 x 5 x 1.5 ml CAL B-F LYO 1 x 2 x 1.5 ml CONTROL 1+2 LYO 1 x 2 x 3.5 ml PREC REAG 1+2 Placa de Microtitulación Metanefrina, (azul) Tiras separables. Recubierto con: Metanefrina. Placa de Microtitulación Normetanefrina, (amarillo) Tiras separables. Recubierto con: Normetanefrina. Estándar A, liofilizado 0 pg/ml Contenido: plasma humano. Estándar B-F, liofilizado Por concentraciones exactas vea las etiquetas de las ampollas o el certificado Control de Calidad. Contenido: plasma humano. Control 1+2, liofilizado Por concentraciones / rangos de aceptancia vea las etiquetas. Contenido: plasma humano. Reactivo de Precipitación 1 + 2 Listo para usar. 3 x 2.5 ml ACYL REAG LYO Reactivo de Acilación, liofilizado 1 x 450 µl ANTISERUM MN CONC 1 x 4 ml ANTISERUM NMN 2 x 13 ml ENZCONJ 2 x 5.5 ml SOLVENT 1 x 6 ml ACYL BUF Metanefrina Antisuero Concentrado (10x) Coloreado en azul. Contenido: Antisuero (conejo). Normetanefrina Antisuero Listo para usar. Coloreado en Amarillo. Contenido: Antisuero (conejo). Conjugado Enzimático Listo para usar. Contenido: anti-conejo IgG POD Conjugado. Solvent Listo para usar. Contenido: acetona. Solución buffer de Acilación Listo para usar. Contenido: Tris-HCl-Solución buffer. 1 x 100x PREC TUBES Tubos de Precipitación Version 2014-11 2 / 9

Cantidad Símbolo Componente 2 x 20 ml WASHBUF CONC Solución Buffer de Lavado, Concentrado (50x) 2 x 13 ml TMB SUBS Solución de Substrato TMB Listo para usar. Contenido: 3,3,5,5 -Tetramethylbenzidine, H 2 O 2. 2 x 13 ml TMB STOP Solución de Parada Listo para usar. Contenido: 0.3 M H 2 SO 4. 4 x FOIL Folio Adhesivo 8. MATERIALES REQUIRIDOS PERO NO SUMINISTRADOS 1. Micropipetas (Multipette Eppendorf o dispositivos similares, < 3 % CV). Volúmenes: 20; 25; 50; 100 y 200 µl. 2. Procesador Dynex DSX y tubos DSX (versión automática). 3. Centrífuga; 4000 x g 4. Agitador orbital (400-600 rpm) 5. Vortex 6. Mezclador de rodillo 7. Micropipeta multicanal de 8 canales con reservorio de reactivo 8. Frasco lavador, sistema automatizado o semi-automatizado de lavado de placas de microtitración 9. Fotómetro para placas de microtitulación capaz de leer absorbancias a 450 nm (longitud de onda de referencia 600-650 nm) 10. Agua bidestilada o desionizada 11. Toallas de papel, puntas para las micropipetas y cronómetro 9. INDICACIONES PARA EL PROCEDIMIENTO 1. Cualquier manipulación inadecuada de las muestras o modificación del procedimiento de ensayo puede alterar los resultados. Los volúmenes a pipetear, los tiempos de incubación, las temperaturas y etapas de pretratamientos tienen que ser efectuados estrictamente siguiendo las instrucciones. Use sólo pipetas u otros dispositivos calibrados. 2. Una vez comenzado el ensayo, se deben completar todas las etapas sin interrupción. Asegúrese de que los reactivos, materiales y dispositivos necesarios estén listos en el momento adecuado. Permita que todos los reactivos y muestras alcancen la temperatura ambiente (18-25 C) y agite suavemente por rotación cada vial de reactivo líquido o muestra antes del uso. Evite la formación de espuma. 3. Evite la contaminación de los reactivos, pipetas pocillos y/o tubos. Emplee una punta desechable nueva para cada reactivo, estándar o muestra. No intercambie las tapas. Tape siempre los viales que no estén en uso. No reutilice los pocillos, tubos o reactivos. 4. Se recomienda ensayar las muestras por duplicado para poder identificar errores potenciales de pipeteo. 5. Emplee un esquema de pipeteo según las dimensiones de la placa. Un esquema de pipeteo que cubre tanto el pretratamiento de las muestras como el ensayo está disponible en la página inicial del sitio web de IBL. 6. El tiempo de incubación afecta los resultados. Todos los pocillos deben manipularse en el mismo orden y respetando las secuencias de tiempo. Se recomienda el empleo de una micropipeta de 8 canales para pipetar las soluciones en todos los pozos. 7. El lavado de las placas de microtitulación es importante. Los pocillos lavados inadecuadamente darán resultados erróneos. Se recomienda el empleo de una micropipeta multicanal o de un sistema de lavado automático. No deje secar los pocillos entre incubaciones. No dañe el recubrimiento de los pocillos durante los procesos de aspiración y enjuague. En el enjuague chequee que todos los pocillos estén totalmente llenos de buffer de enjuague y de que no queden residuos en ellos. 8. La humedad afecta los pocillos y tubos recubiertos. No abra la bolsa hasta que alcance la temperatura ambiente. Los pocillos o tubos que no se empleen deben guardarse inmediatamente en la bolsa resellada con desecante. 10. INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO Este inmunoanálisis de enzima se evalúa para uso manual y, especialmente, para el uso automático con el procesador ELISA DSX de Dynex para la determinación de Normetanefrina y Metanefrina en plasma. Por lo tanto, el manual contiene diferentes procedimientos de trabajo. Version 2014-11 3 / 9

El contenido del kit para 96 determinaciones puede ser dividido en 3 ensayos separados. Los volúmenes declarados más abajo son para un ensayo con 2 x 6 tiras (2 x 48 determinaciones) Metanefrina y Normetanefrina. Reactivos de Acilación y Solventes adicionales pueden ser ordenados en IBL bajo el número de referencia REF ACYL REAG: KEWP 751 o REF SOLVENT: KEWP 551 10.1. Preparación de componentes liofilizados o concentrados Diluya / Componente con Diluyente Notas Almacenamiento Estabilidad disuelva 6 frascos CAL A-F hasta fecha de Mezlar con vortex todos caducidad. agua los tubos y mezcle -20 C 1.5 ml Evite congelar y 2 frascos CONTROL 1+2 bidest. durante 20 minutos con (Alícuotas) descongelar un mezclador de rodillo. repetidamente. 20 ml WASHBUF ad 1000 ml 200 µl ANTISERUM MN 1800 µl Diluya / disuelva agua bidest. agua bidest. Relación: 1:50 Para disolver los cristales, temple hasta 37 C. Relación: 1:10 Mezclar cuidadosamente Reactivo de Acilación: Prepare fresco y use sólo una vez. 2-8 C 18-25 C 4 semanas Tener en cuenta que el solvente reacciona con muchos materiales plásticos, incluidas las bandejas plásticas; el solvente no reacciona con puntas de pipetas normales ni con productos de vidrio. El solvente es volátil, y el reactivo de acilación disuelto se evapora rápidamente. Por consiguiente, no usar una bandeja con una gran superficie junto con una pipeta multicanal para transvasar el reactivo de acilación. Componente con Diluyente Notas Almacenamiento Estabilidad 1 frasco ACYL REAG 2.5 ml SOLVENT Mezcle durante 15 minutos con un mezclador de rodillo. 10.2. Paso de precipitación y acilación en Tubos de Precipitación 18-25 C Observar el procesamiento automático: Para la preparación de los estándares y controles con la versión automatizada de la pipeta de 200 µl en tubos DSX de 1.8 ml. Usar los tubos de precipitado incluidos en el kit solo para las muestras. Dilución de Muestras: Las muestras, cuya concentración se sospecha mayor a la del mayor estándar deben ser diluidas con el estándar A antes de ser precipitadas. 1. Rotule los Tubos de Precipitación y pipetee 200 µl de cada Estándar, Control y Muestra en los tubos respectivos. 2. Pipetee 25 µl de reactivo de precipitación 1 en cada tubo. 3. Pipetee 25 µl de reactivo de precipitación 2 en cada tubo y vortex (5 10 sec.). 4. Centrifuge los Tubos de Precipitación por 15 min 4000 x g. 5. Pipetee 50 µl de Solución buffer de Acilación en cada tubo. 6. En cambio, usar una multipipeta Eppendorf (o un dispositivo similar), llenar la jeringa directamente desde la ampolla con el reactivo de acilación disuelto. 7. Pipetee 40 µl de Reactivo de Acilación recién preparada en cada tubo. Mezclar con vortex cada tubo inmediatemente después de pipetear (2-4 sec.). No es necesario resuspender el sedimento. 8. Centrifuge los Tubos de Precipitación por 15 min 4000 x g. 11. PROCEDIMIENTO DE ENSAYO El siguiente proceso se lleva a cabo en la placa de microtitulación. Placa de Microtitulación azul, para la determinación de metanefrina: Placa de Microtitulación amarilla, para la determinación de normetanefrina. 1 día 3 h Version 2014-11 4 / 9

11.1. Manual versión corta 11.1.1. Metanefrina (Placa de Microtitulación azul) manual versión corta microtitulación. No Cubra la placa. 2. Incube 60 min a TA (18-25 C) en un agitador orbital (500 rpm). 3. Pipetee 25 µl de Antisuero Metanefrina diluída en cada pozo. El color cambia a azul. 4. Cubra la placa con el folio adhesivo. Incube 120 min a TA (18-25 C) en un agitador orbital (500 rpm). 5. Remueva el folio adhesivo. Descargue la solución de incubación. Lave la placa 4 x 300 μl con Buffer de Lavado diluído. Remueva totalmente el exceso de solución golpeando cuidadosamente la placa invertida sobre una toalla de papel. 6. Pipetee 100 µl de Conjugado Enzimático en cada pozo. 7. Cubra la placa con un nuevo folio adhesivo. Incube 30 min a TA (18-25 C) en un agitador orbital (500 rpm). 8. Remueva el folio adhesivo. Descargue la solución de incubación. Lave la placa 4 x 300 μl con Buffer de Lavado diluído. Remueva totalmente el exceso de solución golpeando cuidadosamente la placa invertida sobre una toalla de papel. 9. Para la adición de la Solución de Substrato y de Paro utilice, de ser posible, una pipeta de 8 canales. La adición de sustrato y solución de paro debe llevarse a cabo en intervalos de tiempo iguales. 10. Pipetee 100 µl de Solución de Substrato TMB en cada pozo. 11. Incube 25-35 min a TA (18-25 C) en un agitador orbital (500 rpm). 12. La reacción del substrato depende del tiempo y de la temperatura. Manténgase alejado del calor o de la luz solar directa. 13. Detenga la reacción del substrato añadiendo 100 μl de Solución de Paro TMB en cada pozo. Mezcle el contenido brevemente agitando cuidadosamente la placa. El color cambia de azul a amarillo. 14. Mida la densidad óptica con un fotómetro a 450 nm (Longitud de onda de referencia: 600-650 nm) dentro de los 15 min de haber agregado la Solución de Paro. 11.1.2. Normetanefrina (Placa de Microtitulación amarillo) manual versión corta microtitulación. No Cubra la placa. 2. Incube 60 min a TA (18-25 C) en un agitador orbital (500 rpm). 3. Pipetee 25 µl de Antisuero Normetanefrina en cada pozo. El color cambia a naranja. 4. Cubra la placa con el folio adhesivo. Incube 120 min a TA (18-25 C) en un agitador orbital (500 rpm). 5. Remueva el folio adhesivo. Descargue la solución de incubación. Lave la placa 4 x 300 μl con Buffer de Lavado diluído. Remueva totalmente el exceso de solución golpeando cuidadosamente la placa invertida sobre una toalla de papel. 6. Pipetee 100 µl de Conjugado Enzimático en cada pozo. 7. Cubra la placa con un nuevo folio adhesivo. Incube 30 min a TA (18-25 C) en un agitador orbital (500 rpm). 8. Remueva el folio adhesivo. Descargue la solución de incubación. Lave la placa 4 x 300 μl con Buffer de Lavado diluído. Remueva totalmente el exceso de solución golpeando cuidadosamente la placa invertida sobre una toalla de papel. 9. Para la adición de la Solución de Substrato y de Paro utilice, de ser posible, una pipeta de 8 canales. La adición de sustrato y solución de paro debe llevarse a cabo en intervalos de tiempo iguales. 10. Pipetee 100 µl de Solución de Substrato TMB en cada pozo. 11. Incube 25-35 min a TA (18-25 C) en un agitador orbital (500 rpm). 12. La reacción del substrato depende del tiempo y de la temperatura. Manténgase alejado del calor o de la luz solar directa. 13. Detenga la reacción del substrato añadiendo 100 μl de Solución de Paro TMB en cada pozo. Mezcle el contenido brevemente agitando cuidadosamente la placa. El color cambia de azul a amarillo. 14. Mida la densidad óptica con un fotómetro a 450 nm (Longitud de onda de referencia: 600-650 nm) dentro de los 15 min de haber agregado la Solución de Paro. Version 2014-11 5 / 9

11.2. Versión Alternativa con incubación durante la noche 11.2.1. Primer día: Versión manual Metanefrina (Placa de Microtitulación azul) microtitulación. No Cubra la placa. 2. Incube 60 min a TA (18-25 C) en un agitador orbital (500 rpm). 3. Cubra la placa con el folio adhesivo. Incube Toda la noche (12-20 h) a 2-8 C. 11.2.2. Primer día: Versión manual Normetanefrina (Placa de Microtitulación amarillo) microtitulación. No Cubra la placa. 2. Incube 60 min a TA (18-25 C) en un agitador orbital (500 rpm). 3. Cubra la placa con el folio adhesivo. Incube Toda la noche (12-20 h) a 2-8 C. 11.2.3. Segundo Día: Versión manual Metanefrina (Placa de Microtitulación azul) 1. Remueva el folio adhesivo. Pipetee 25 µl de Antisuero Metanefrina diluída en cada pozo. El color cambia a azul. 2. Cubra la placa con el folio adhesivo. Incube 120 min a TA (18-25 C) en un agitador orbital (500 rpm). 3. Remueva el folio adhesivo. Descargue la solución de incubación. Lave la placa 4 x 300 μl con Buffer de Lavado diluído. Remueva totalmente el exceso de solución golpeando cuidadosamente la placa invertida sobre una toalla de papel. 4. Pipetee 100 µl de Conjugado Enzimático en cada pozo. 5. Cubra la placa con un folio adhesivo. Incube 30 min a TA (18-25 C) en un agitador orbital (500 rpm). 6. Remueva el folio adhesivo. Descargue la solución de incubación. Lave la placa 4 x 300 μl con Buffer de Lavado diluído. Remueva totalmente el exceso de solución golpeando cuidadosamente la placa invertida sobre una toalla de papel. 7. Para la adición de la Solución de Substrato y de Paro utilice, de ser posible, una pipeta de 8 canales. La adición de sustrato y solución de paro debe llevarse a cabo en intervalos de tiempo iguales. 8. Pipetee 100 µl de Solución de Substrato TMB en cada pozo. 9. Incube 25-35 min a TA (18-25 C) en un agitador orbital (500 rpm). 10. La reacción del substrato depende del tiempo y de la temperatura. Manténgase alejado del calor o de la luz solar directa. 11. Detenga la reacción del substrato añadiendo 100 μl de Solución de Paro TMB en cada pozo. Mezcle el contenido brevemente agitando cuidadosamente la placa. El color cambia de azul a amarillo. 12. Mida la densidad óptica con un fotómetro a 450 nm (Longitud de onda de referencia: 600-650 nm) dentro de los 15 min de haber agregado la Solución de Paro. 11.2.4. Segundo Día: Versión manual Normetanefrina (Placa de Microtitulación amarillo) 1. Remueva el folio adhesivo. Pipetee 25 µl de Antisuero Normetanefrina en cada pozo. El color cambia a naranja. 2. Cubra la placa con el folio adhesivo. Incube 120 min a TA (18-25 C) en un agitador orbital (500 rpm). 3. Remueva el folio adhesivo. Descargue la solución de incubación. Lave la placa 4 x 300 μl con Buffer de Lavado diluído. Remueva totalmente el exceso de solución golpeando cuidadosamente la placa invertida sobre una toalla de papel. 4. Pipetee 100 µl de Conjugado Enzimático en cada pozo. 5. Cubra la placa con un folio adhesivo. Incube 30 min a TA (18-25 C) en un agitador orbital (500 rpm). 6. Remueva el folio adhesivo. Descargue la solución de incubación. Lave la placa 4 x 300 μl con Buffer de Lavado diluído. Remueva totalmente el exceso de solución golpeando cuidadosamente la placa invertida sobre una toalla de papel. 7. Para la adición de la Solución de Substrato y de Paro utilice, de ser posible, una pipeta de 8 canales. La adición de sustrato y solución de paro debe llevarse a cabo en intervalos de tiempo iguales. 8. Pipetee 100 µl de Solución de Substrato TMB en cada pozo. 9. Incube 35-45 min a TA (18-25 C) en un agitador orbital (500 rpm). 10. La reacción del substrato depende del tiempo y de la temperatura. Manténgase alejado del calor o de la luz solar directa. 11. Detenga la reacción del substrato añadiendo 100 μl de Solución de Paro TMB en cada pozo. Mezcle el contenido brevemente agitando cuidadosamente la placa. El color cambia de azul a amarillo. 12. Mida la densidad óptica con un fotómetro a 450 nm (Longitud de onda de referencia: 600-650 nm) dentro de los 15 min de haber agregado la Solución de Paro. Version 2014-11 6 / 9

11.3. versión automática Metanefrina (Placa de Microtitulación azul) microtitulación. 2. Incube 3 minutos (max 5 minutos) a 30 C en un agitador orbital (agitación a velocidad media). 3. Incube 60 minutos (max 70 minutos) a TA (temperatura ambiente). 4. Pipetee 25 µl de Antisuero Metanefrina diluída en cada pozo. 5. Incube 120 minutos (max 130 minutos) a TA en un agitador orbital (agitación a velocidad media). 6. Lave la placa 5 x 300 μl con Buffer de Lavado diluído. Aspirar el contenido de cada pocillo. 7. Pipetee 100 µl de Conjugado Enzimático en cada pozo. 8. Incube 30 minutos (max 32 minutos) a TA en un agitador orbital (agitación a velocidad media). 9. Lave la placa 5 x 300 μl con Buffer de Lavado diluído. Aspirar el contenido de cada pocillo. 10. Pipetee 100 µl de Solución de Substrato TMB en cada pozo. 11. Incube 20 minutos (max 25 minutos) a TA en un agitador orbital (agitación a velocidad media). 12. Pipetee 100 μl de Solución de Paro TMB en cada pozo. 13. Mida la densidad óptica con un fotómetro a 450 nm (Longitud de onda de referencia: 620 nm) 11.4. versión automática Normetanefrina (Placa de Microtitulación amarillo) microtitulación. 2. Incube 3 minutos (max 5 minutos) a 30 C en un agitador orbital (agitación a velocidad media). 3. Incube 60 minutos (max 70 minutos) a TA (temperatura ambiente). 4. Pipetee 25 µl de Antisuero Normetanefrina en cada pozo. 5. Incube 120 minutos (max 130 minutos) a TA en un agitador orbital (agitación a velocidad media). 6. Lave la placa 5 x 300 μl con Buffer de Lavado diluído. Aspirar el contenido de cada pocillo. 7. Pipetee 100 µl de Conjugado Enzimático en cada pozo. 8. Incube 30 minutos (max 32 minutos) a TA en un agitador orbital (agitación a velocidad media). 9. Lave la placa 5 x 300 μl con Buffer de Lavado diluído. Aspirar el contenido de cada pocillo. 10. Pipetee 100 µl de Solución de Substrato TMB en cada pozo. 11. Incube 20 minutos (max 25 minutos) a TA en un agitador orbital (agitación a velocidad media). 12. Pipetee 100 μl de Solución de Paro TMB en cada pozo. 13. Mida la densidad óptica con un fotómetro a 450 nm (Longitud de onda de referencia: 620 nm) 12. CONTROL DE CALIDAD Los resultados son válidos solamente si el ensayo ha sido realizado de acuerdo a las intrucciones. Además el usuario debe atenerse a las Prácticas de Buen Laboratorio (GLP) u otras normas o leyes comparables. Para la determinación del diagnóstico, el usuario y/o el laboratorio deben de tener un sistema validado de acuerdo con las Buenas Prácticas de Laboratorio (GLP). Los valores de los controles del ensayo deben encontrarse dentro de los rangos de aceptación indicados en las etiquetas de los viales. Si este criterio no se cumple, el ensayo no es válido y debe repetirse. Cada laboratorio debe emplear muestras conocidas como controles adicionales. En caso de detectarse alguna desviación, se debe verificar lo siguiente: Fecha de vencimiento de los reactivos, condiciones de almacenamiento, pipetas, dispositivos, condiciones de incubación y método de lavado. Version 2014-11 7 / 9

13. CÁLCULO DE RESULTADOS La DO de los estándares (eje-y, lineal) se plotean contra su concentración (eje-x, logarítmico) ya sea en papel semi-logarítmico o empleando un método automático. Se logra un buen ajuste con cubic spline, 4 Parameter Logistics or Logit-Log. Para el cálculo de la curva estándar, use las mediciones obtenidas de los estándares (es aconsejable no emplear valores duplicados). La concentración de las muestras se puede leer directamente de la curva estándar. En caso de muestras diluídas los valores deberán multiplicarse por el factor de dilución correspondiente. Conversión: Metanefrina (pg/ml) x 5.07 = pmol/l Normetanefrina (pg/ml) x 5.46 = pmol/l Curva de Calibración Típica Metanefrina (Ejemplo. No usar para el cálculo!) Estándar pg/ml DO Medio A 0 1.724 B 15 1.475 C 50 1.284 D 180 0.947 E 600 0.602 F 2500 0.288 Curva de Calibración Típica Normetanefrina (Ejemplo. No usar para el cálculo!) Estándar pg/ml DO Medio A 0 1.654 B 12 1.481 C 45 1.322 D 140 1.081 E 700 0.674 F 3000 0.258 14. VALORES ESPERADOS Los resultados por si solos no deben ser la única razón para un tratamiento terapéutico, sino que deben correlacionarse con observaciones clínicas y ensayos de diagnóstico. Los sujetos aparentemente sanos presentan los Plasma siguientes valores: (pg/ml) (nmol/l) Metanefrina < 90 < 0.459 Normetanefrina < 190 < 1.037 Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio rango de valores normales. 15. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO La toma de la muestra y almcenamiento tiene un efecto importante en los resultados. Vea TOMA DE MUESTRA Y ALMACENAMIENTO para mayores detalles. Para reactividad cruzada, vea PRUEBAS FUNCIONALES. Version 2014-11 8 / 9

16. PRUEBAS FUNCIONALES Reactividad Cruzada (%) Sustancia Metanefrina Normetanefrina Metanefrina 100 0.015 Normetanefrina 0.130 100 3-Methoxytyramine 0.003 0.076 Reactividad Adrenalina 0.039 0.0003 cruzada de otras Especificidad Analítica Noradrenalina 0.0008 0.0030 substancias (Reactividad Cruzada) Tiramina 0.0005 0.0043 testeadas Dopamina <0.0001 0.0006 < 0.001 % Àcido homovanílico <0.0001 <0.0001 Àcido vanil mandélico <0.0001 <0.0001 L-DOPA <0.0001 <0.0001 L-Tirosina <0.0001 <0.0001 Sensibilidad Analítica Metanefrina 7 pg/ml (Límite de Detección) Normetanefrina 7 pg/ml Señal media (Estándar-Cero) - 2DS Precisión Intervalo (pg/ml) CV (%) Intra-Ensayo Metanefrina 157-403 7.9 7.8 Normetanefrina 193 757 8.4 4.1 Inter-Ensayo Metanefrina 118-276 8.8 8.6 Normetanefrina 246-551 9.3 9.2 Intervalo Dilución en Medio Intervalo Linearidad (pg/ml) Serie hasta (%) (%) Metanefrina 43 886 1:20 103 96 112 Normetanefrina 70 1613 1:20 93 86 105 Intervalo (pg/ml) Medio (%) Intervalo (%) Recuperación después Metanefrina 20 900 94 82 117 del enriquecimiento Normetanefrina 34 1633 96 90-108 Comparación del Método versus LC/MS Comparación de Métodos Toda la noche versus versión corta Metanefrina IBL-ELISA = 1.04 x [LC/MS] - 23 r = 0.990 ; n = 32 Normetanefrina IBL-ELISA = 0.99 x [LC/MS] - 8 r = 0.984 ; n = 32 Metanefrina versión corta = 1.089 x - 2.054 r = 0.993 ; n = 138 Normetanefrina versión corta = 0.926x +11.78 r = 0.978 ; n = 138 17. REFERENCIAS SOBRE EL PRODUCTO 1. Vogelgesang A, May V, Grunwald U, Bakkeboe M, Langner S, Wallaschofski H, Kessler Ch, Bröker B, Dressel A Functional status of peripheral blood T-cells in ischemic stroke patients. PLOSone, January 2010, Volume 5, Issue 1 e8718. 2. Lenz T, Zorner J, Kirchmaier C, Pillitteri D, Badenhoop K, Bartel C, Geiger H, Hasselbacher K, Tuschy U, Westermann J, Salewski L: Multicenter Study on the Diagnostic Value of a New RIA for the Detection of Free Plasma Metanephrines in the Work-Up for Pheochromocytoma. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1073: 358-373 (2006) 3. Unger, N.; Pitt, C. (2006); Petersenn, S.; et al.: Diagnostic value of various biochemical parameters for the diagnosis of pheochromocytoma in patients with adrenal mass European Journal of Endocrinology 154 409 417 4. Eisenhofer, G.; Walther, M.; Keiser, H.; et al. (2004): Plasma metanephrines: a novel and costeffective test for pheochromocytoma Brazilian Journal of Medical and Biological Research 33: 1157-1169 (2000) 5. Bravo, E.: Pheochromocytoma: Current Perspectives in the Pathogenesis, Diagnosis, and Management Arq Bras Endocrinol Metab 48/5:746-750 6. Candito, M.; Billaud, E.; Chauffert, M.; et al. (2002): Biochemical diagnosis of pheochromocytoma and neuroblastomas Ann Biol Clin (Paris). 2002 Jan-Feb;60(1):15-36. 7. Lenders, J.; Pacak, K.; McClellan, M.; et al. (2002): Biochemical Diagnosis of Pheochromocytoma Which Test Is Best? Jama, March 20, 2002-Vol 287, No. 11 8. Eisenhofer, G.; Keiser, H.; Friberg, P.; et al. (1998): Plasma Metanephrines Are Markers of Pheochromocytoma Produced by Catechol-O-Methyltransferase Within Tumors Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism Vol. 83, No. 6 9. Lenders, J.; Keiser, H.; Goldstein, D.; et al. (1995): Plasma Metanephrines in the Diagnosis of Pheochromocytoma Annals of Internal Medicine Volume 123 Number 2 Version 2014-11 9 / 9

Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, 22335 Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) 40 532891-0 Fax: -11 E-MAIL: IBL@IBL-International.com WEB: http://www.ibl-international.com Tel.: +1 (416) 645-1703 Fax: -1704 E-MAIL: Sales@IBL-International.com WEB: http://www.ibl-international.com LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 / 2012-01-20